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【摘 要】目的：探讨参蛭活血颗粒剂对MsPGN大鼠肾组织ICAM-1表达的影响及作用机制。方法：将50只Wistar雄性大鼠进行MsPGN模型复制，分为空白组、模型组、中药对照组及治疗组，观察参蛭活血颗粒剂对MsPGN大鼠肾功能、血常规、血脂的变化。采用免疫组化法检测各组肾脏组织学变化及肾组织中细胞间粘附分子-l（ICAM-1）的表达情况。结果：治疗组及对照组的尿蛋白定量较模型组均明显降低（P<0.05），治疗组及对照组ICAM-1在肾脏组织的表达较模型组均有不同程度减低，治疗组减低最为显著（P<0.05）。结论：参蛭活血颗粒剂可明显降低MsPGN尿蛋白定量、保护肾功能，下调肾组织α-SMA的表达。
【关键词】系膜增生性肾炎；参蛭活血颗粒剂；细胞间粘附分子-l（ICAM-1）
【文章编号】1004-7484（2014）06-3787-02
系膜增生性肾小球肾炎（ MsPGN）是原发性肾小球疾病中最常见的病理类型，在我国系膜增生性肾小球肾炎约占原发性肾小球肾炎的29.7%-59.5%[1]。MsPGN的病理改变为系膜细胞（mesangial ce11s，MCs）增生，继发系膜区细胞外基质（extracellular matrix，ECM）聚积，这种病理改变也是多种肾小球疾病共同的病理改变，也是导致肾小球硬化，使疾病向终末期肾病转化的重要环节。因此，抑制系膜细胞增生和基质的积聚是治疗系膜增生性肾小球肾炎最有希望的方法。本研究通过复制MsPGN大鼠模型，进行对照研究进一步证实参蛭活血颗粒剂治疗MsPGN的疗效并对其作用机制进行探讨。
1 材料与方法
1.1材料：
实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重200±10g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。实验药物：参蛭活血颗粒剂：黑龙江省中医药制剂室提供，每袋6克。肾炎康复片：由天津同仁堂股份有限公司生产，国药准字Z10940034。主要试剂：血肌酐试剂盒和尿素氮试剂盒：南京建成生物工程研究所；ICAM-1试剂盒：武汉博士德生物技术有限公司。
1.2.方法：
1.2.1模型制备
参照文献 [2]造模方法及预实验结果，随机抽取50只Wistar大鼠，Wistar大鼠50只，适应性喂养一周，称取体重，以确定给药量，并随机选取8只作为正常组，检测尿蛋白确定均为阴性。复制MsPGN模型：（1）预免疫：双后足垫皮下注射完全弗氏试剂0.03ml/只，内含1mgBSA。此后分别于1周末，2周末加强2次，3周末时以BSA每只0.2mg、0.4mg、0.6mg、1.2mg做4次腹腔注射，每次间隔1小时。次日再以BSA0.9mg/只腹腔注射加强一次。（2）免疫：预免疫后每日腹腔注射BSA，剂量从0.2mg/只开始，每日增加0.2mg至2mg/只。继续每4天加量0.5mg至3.5mg/只为止，共4周。（3）注射LPS：分别于第15天及第36天尾静脉注射LPS 30ug/只。
1.2.2分组及方法
Wistar大鼠50只，随机分为正常组（ZC）8只，模型对照组（MX）8只，肾炎康复片组（SK）8只，中药组（ZY）8只，分别给予蒸馏水、肾炎康复片、参蛭活血颗粒连续灌胃4周。以上药物剂量参照《现代医学实验动物学》按照大鼠与成人药物剂量计算公式，各组大鼠均自由取食，自由饮水。
1.2.3指标检测：
治疗结束后，用代谢笼分别收集各组大鼠24h尿液，记录尿量，离心后存于-20℃冰箱中备用。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，离心后取血清保存于冰箱中备用，备做血尿酸、血肌酐及血尿素氮。然后取出双肾，去包膜，称重，左肾切取一半置于4%多聚甲醛液固定，HE染色观察肾组织病理变化。
采用免疫二步法检测ICAM-1在肾脏组织的表达，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。对免疫组化切片ICAM-1的表达进行半定量分析。Motic -BA400显微镜，于40×视野下摄影，每组每张切片随机选取5个视野，用Motic image 3.2图像分析软件进行分析，测量每个肾小球的面积及染色面积。用阳性染色面积和肾小球面积的百分比表示该成分的相对含量。阳性表达于细胞质中，呈棕黄色，以PBS液代替一抗做阴性对照。
1.3统计分析
2 实验结果
2.1病理学检查结果：
HE染色模型组可见肾小球明显增大。肾小球系膜区呈局部或弥漫性系膜组织增生，肾小球系膜区增宽，肾小球内细胞数增多，以系膜细胞增生为主，系膜基质亦有增生。个别区域系膜组织增生较明显，细胞成团，基质增多，使系膜区成团块状或结节状，肾小球囊壁粘连。
2.2 治疗后各组尿素氮、肌酐的影响：
治疗组及中药对照组尿素氮、肌酐与模型对照组比较，两者有特别显著性差异（P<0.01）；治疗组尿素氮、肌酐与中药对照组比较，两者有显著性差异（P<0.05）。
2.3治疗后各组血脂的影响：
由表二可见：病理模型组的血脂与空白对照组比较，两者有特别显著性差异（P<0.01）；治疗组及中药对照组血脂与模型对照组比较，两者有特别显著性差异（P<0.01）；治疗组血脂与中药对照组比较，两者有显著性差异（P<0.05）。
2.4 治疗后各组肾组织ICAM-1表达的影响：
由表三可见：病理模型组的肾组织ICAM-1与空白对照组比较，两者有特别显著性差异（P<0.01）；治疗组及中药对照组肾组织ICAM-1与模型对照组比较，两者有特别显著性差异（P<0.01）；治疗组肾组织ICAM-1与中药对照组比较，两者有显著性差异（P<0.05）。
3 讨论
系膜增生性肾小球肾炎是由于自身免疫调节功能紊乱所导致的免疫介导的炎症性疾病。由于病毒或细菌感染，使外源性抗原增加，与体内抗体结合，形成循环免疫复合物随血液循环在肾脏不断沉积，直接损伤肾小球，并通过免疫系统使补体活化，白细胞聚集，炎症细胞激活，肾小球固有细胞活化，分泌释放炎症因子、细胞因子从而使肾小球损伤进一步加重[3]。系膜增生性肾小球肾炎的病理特征是系膜细胞（MCs）增殖和系膜基质（ECM）的增多。其中系膜细胞的不断增殖，尤其是细胞外基质的大量积聚导致了肾小球硬化的发生。因此，抑制系膜细胞增生和基质的积聚是治疗系膜增生性肾小球肾炎最有希望的方法。参蛭活血颗粒剂由党参、水蛭、黄芪、桃仁、红花等药物组成，具有益气养阴、活血化瘀的功效。方中党参、黄芪、莲子益气养阴补虚以扶助正气，水蛭、桃仁、红花活血化瘀以祛邪通络。诸药相伍通补并用、标本兼顾，络脉瘀阻可消、正气亏虚可复，这就是以该方为基础辨证治疗MsPGN能够获得较好疗效的原因。
细胞间粘附分子-l（ICAM-1）是介导细胞与细胞或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子，大都为糖蛋白，属于粘附分子中的免疫球蛋白超家族成员，是重要的细胞粘附分子之一，分布于细胞表面或细胞外基质[4]处。由粘附分子介导的的细胞粘附机制，参与肾脏等多种疾病免疫病理损伤的物质基础。ICAM-1在肾脏炎性病变、肾小管损伤、肾间质纤维化等发生发展中起重要作用，当其受到多种炎性因子刺激后，其表达上调它可增强单核巨噬细胞与血管内皮细胞间的粘附，促进炎症发生、发展。ICAM-1的持续增强表达可导致组织器官结构和功能的严重损伤。在正常肾脏，ICAM-l通常以低水平表达于大血管内皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小管周围毛细血管内皮细胞及某些肾小球囊的壁层上皮细胞，偶尔表达于间质细胞。但在病变的肾脏组织中，均可见到肾小管上皮细胞表面ICAM-1的表达，并显示出与局部浸润的T淋巴细胞和巨噬细胞的相关性。近几年来，国内外开始了对ICAM-1在肾脏纤维化作用中的实验研究，并探索其从细胞内释放到细胞外产生作用的机制等研究[5]。
通过本实验研究表明参蛭活血颗粒剂可明显降低MsPGN尿蛋白定量、保护肾功能，其作用机制可能与下调肾组织ICAM-1的表达相关。
参考文献：
[1] 黎磊石，关天俊，刘志红，等.4298例成年人肾小球疾病病理类型及流行病学特点.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6（2）：103-109.
[2] 张五星，陈香美，等.大鼠慢性血清病肾炎模型的改进研究[J].中国比较医学杂志，2003，3（3）：139-141.
[3] 王玉，李曉玫 .肾脏固有细胞的表型转化特征及其病理生理意义 .中国病理生理杂志，2002，18（10）：1303-1307.
[4] 张梅，李晓玫.IgA肾病患者肾组织MAPK各亚类活化与肾小管上皮细胞转分化的关系[J]. 中国病理生理杂志. 2003（11）.
[5] 陈建粮，李晓玫，王海燕. 白细胞介素10对人肾系膜细胞的细胞间粘附分子1表达的抑制作用通过核因子κB介导[J]. 北京医科大学学报. 1999（02） .
【关键词】系膜增生性肾炎；参蛭活血颗粒剂；细胞间粘附分子-l（ICAM-1）
【文章编号】1004-7484（2014）06-3787-02
系膜增生性肾小球肾炎（ MsPGN）是原发性肾小球疾病中最常见的病理类型，在我国系膜增生性肾小球肾炎约占原发性肾小球肾炎的29.7%-59.5%[1]。MsPGN的病理改变为系膜细胞（mesangial ce11s，MCs）增生，继发系膜区细胞外基质（extracellular matrix，ECM）聚积，这种病理改变也是多种肾小球疾病共同的病理改变，也是导致肾小球硬化，使疾病向终末期肾病转化的重要环节。因此，抑制系膜细胞增生和基质的积聚是治疗系膜增生性肾小球肾炎最有希望的方法。本研究通过复制MsPGN大鼠模型，进行对照研究进一步证实参蛭活血颗粒剂治疗MsPGN的疗效并对其作用机制进行探讨。
1 材料与方法
1.1材料：
实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重200±10g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。实验药物：参蛭活血颗粒剂：黑龙江省中医药制剂室提供，每袋6克。肾炎康复片：由天津同仁堂股份有限公司生产，国药准字Z10940034。主要试剂：血肌酐试剂盒和尿素氮试剂盒：南京建成生物工程研究所；ICAM-1试剂盒：武汉博士德生物技术有限公司。
1.2.方法：
1.2.1模型制备
参照文献 [2]造模方法及预实验结果，随机抽取50只Wistar大鼠，Wistar大鼠50只，适应性喂养一周，称取体重，以确定给药量，并随机选取8只作为正常组，检测尿蛋白确定均为阴性。复制MsPGN模型：（1）预免疫：双后足垫皮下注射完全弗氏试剂0.03ml/只，内含1mgBSA。此后分别于1周末，2周末加强2次，3周末时以BSA每只0.2mg、0.4mg、0.6mg、1.2mg做4次腹腔注射，每次间隔1小时。次日再以BSA0.9mg/只腹腔注射加强一次。（2）免疫：预免疫后每日腹腔注射BSA，剂量从0.2mg/只开始，每日增加0.2mg至2mg/只。继续每4天加量0.5mg至3.5mg/只为止，共4周。（3）注射LPS：分别于第15天及第36天尾静脉注射LPS 30ug/只。
1.2.2分组及方法
Wistar大鼠50只，随机分为正常组（ZC）8只，模型对照组（MX）8只，肾炎康复片组（SK）8只，中药组（ZY）8只，分别给予蒸馏水、肾炎康复片、参蛭活血颗粒连续灌胃4周。以上药物剂量参照《现代医学实验动物学》按照大鼠与成人药物剂量计算公式，各组大鼠均自由取食，自由饮水。
1.2.3指标检测：
治疗结束后，用代谢笼分别收集各组大鼠24h尿液，记录尿量，离心后存于-20℃冰箱中备用。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，离心后取血清保存于冰箱中备用，备做血尿酸、血肌酐及血尿素氮。然后取出双肾，去包膜，称重，左肾切取一半置于4%多聚甲醛液固定，HE染色观察肾组织病理变化。
采用免疫二步法检测ICAM-1在肾脏组织的表达，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。对免疫组化切片ICAM-1的表达进行半定量分析。Motic -BA400显微镜，于40×视野下摄影，每组每张切片随机选取5个视野，用Motic image 3.2图像分析软件进行分析，测量每个肾小球的面积及染色面积。用阳性染色面积和肾小球面积的百分比表示该成分的相对含量。阳性表达于细胞质中，呈棕黄色，以PBS液代替一抗做阴性对照。
1.3统计分析
2 实验结果
2.1病理学检查结果：
HE染色模型组可见肾小球明显增大。肾小球系膜区呈局部或弥漫性系膜组织增生，肾小球系膜区增宽，肾小球内细胞数增多，以系膜细胞增生为主，系膜基质亦有增生。个别区域系膜组织增生较明显，细胞成团，基质增多，使系膜区成团块状或结节状，肾小球囊壁粘连。
2.2 治疗后各组尿素氮、肌酐的影响：
治疗组及中药对照组尿素氮、肌酐与模型对照组比较，两者有特别显著性差异（P<0.01）；治疗组尿素氮、肌酐与中药对照组比较，两者有显著性差异（P<0.05）。
2.3治疗后各组血脂的影响：
由表二可见：病理模型组的血脂与空白对照组比较，两者有特别显著性差异（P<0.01）；治疗组及中药对照组血脂与模型对照组比较，两者有特别显著性差异（P<0.01）；治疗组血脂与中药对照组比较，两者有显著性差异（P<0.05）。
2.4 治疗后各组肾组织ICAM-1表达的影响：
由表三可见：病理模型组的肾组织ICAM-1与空白对照组比较，两者有特别显著性差异（P<0.01）；治疗组及中药对照组肾组织ICAM-1与模型对照组比较，两者有特别显著性差异（P<0.01）；治疗组肾组织ICAM-1与中药对照组比较，两者有显著性差异（P<0.05）。
3 讨论
系膜增生性肾小球肾炎是由于自身免疫调节功能紊乱所导致的免疫介导的炎症性疾病。由于病毒或细菌感染，使外源性抗原增加，与体内抗体结合，形成循环免疫复合物随血液循环在肾脏不断沉积，直接损伤肾小球，并通过免疫系统使补体活化，白细胞聚集，炎症细胞激活，肾小球固有细胞活化，分泌释放炎症因子、细胞因子从而使肾小球损伤进一步加重[3]。系膜增生性肾小球肾炎的病理特征是系膜细胞（MCs）增殖和系膜基质（ECM）的增多。其中系膜细胞的不断增殖，尤其是细胞外基质的大量积聚导致了肾小球硬化的发生。因此，抑制系膜细胞增生和基质的积聚是治疗系膜增生性肾小球肾炎最有希望的方法。参蛭活血颗粒剂由党参、水蛭、黄芪、桃仁、红花等药物组成，具有益气养阴、活血化瘀的功效。方中党参、黄芪、莲子益气养阴补虚以扶助正气，水蛭、桃仁、红花活血化瘀以祛邪通络。诸药相伍通补并用、标本兼顾，络脉瘀阻可消、正气亏虚可复，这就是以该方为基础辨证治疗MsPGN能够获得较好疗效的原因。
细胞间粘附分子-l（ICAM-1）是介导细胞与细胞或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子，大都为糖蛋白，属于粘附分子中的免疫球蛋白超家族成员，是重要的细胞粘附分子之一，分布于细胞表面或细胞外基质[4]处。由粘附分子介导的的细胞粘附机制，参与肾脏等多种疾病免疫病理损伤的物质基础。ICAM-1在肾脏炎性病变、肾小管损伤、肾间质纤维化等发生发展中起重要作用，当其受到多种炎性因子刺激后，其表达上调它可增强单核巨噬细胞与血管内皮细胞间的粘附，促进炎症发生、发展。ICAM-1的持续增强表达可导致组织器官结构和功能的严重损伤。在正常肾脏，ICAM-l通常以低水平表达于大血管内皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小管周围毛细血管内皮细胞及某些肾小球囊的壁层上皮细胞，偶尔表达于间质细胞。但在病变的肾脏组织中，均可见到肾小管上皮细胞表面ICAM-1的表达，并显示出与局部浸润的T淋巴细胞和巨噬细胞的相关性。近几年来，国内外开始了对ICAM-1在肾脏纤维化作用中的实验研究，并探索其从细胞内释放到细胞外产生作用的机制等研究[5]。
通过本实验研究表明参蛭活血颗粒剂可明显降低MsPGN尿蛋白定量、保护肾功能，其作用机制可能与下调肾组织ICAM-1的表达相关。
参考文献：
[1] 黎磊石，关天俊，刘志红，等.4298例成年人肾小球疾病病理类型及流行病学特点.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6（2）：103-109.
[2] 张五星，陈香美，等.大鼠慢性血清病肾炎模型的改进研究[J].中国比较医学杂志，2003，3（3）：139-141.
[3] 王玉，李曉玫 .肾脏固有细胞的表型转化特征及其病理生理意义 .中国病理生理杂志，2002，18（10）：1303-1307.
[4] 张梅，李晓玫.IgA肾病患者肾组织MAPK各亚类活化与肾小管上皮细胞转分化的关系[J]. 中国病理生理杂志. 2003（11）.
[5] 陈建粮，李晓玫，王海燕. 白细胞介素10对人肾系膜细胞的细胞间粘附分子1表达的抑制作用通过核因子κB介导[J]. 北京医科大学学报. 1999（02） .