外显子重复和重排是导致新基因产生的重要方式。本研究以人溶菌酶为模型,通过体外外显子重复和重排构建“双中心”酶。人溶菌酶(EC 3.2.1.17)是一种重要的药用酶,其二聚体具有明显的抗HIV功能(水解病毒多糖)。该酶成为基因结构与蛋白质结构关系研究的典型实例,稳定性相当高。它有四个外显子,外显子2为氨基酸28-82编码,其包括催化中心的残基(Glu35和Asp53)和结合寡糖底物的一簇氨基酸。在第二和第三外显子表达产物之间存在一突环。我们将重复和重排第二外显子(这里的重排是指密码子重排)插入到突环中,构建了“双中心”溶菌酶基因,通过表达获得了“双中心”溶菌酶。活性检测结果表明外显子重复溶菌酶(RD-L)的相对活性是野生型的181.5%,外显子重排溶菌酶(RA-L)约为107.2%。“双中心”溶菌酶的稳定性与野生型相似。我们采用定点突变技术,结合计算机模拟结果,显示RD-L确实存在两个活性中心,而RA-L只存在一个活性中心。 综上,我们通过外显子重复构建出了“双中心”溶菌酶。这为工程酶的活性中心提供新的理论、策略和捷径,可能具有普遍的指导意义。