【摘 要】
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目的 探讨炎症环境下磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)通路对SW620Lgr5+结肠癌干细胞(CSC)增殖的影响.方法 以人结肠癌SW620、SW480、HT29、HCT116细胞为材料,Western b
【机 构】
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宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室,宁夏银川750004宁夏医科大学临床医学院,宁夏银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室,宁夏银川,750004;
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目的 探讨炎症环境下磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)通路对SW620Lgr5+结肠癌干细胞(CSC)增殖的影响.方法 以人结肠癌SW620、SW480、HT29、HCT116细胞为材料,Western blot法检测四株细胞中干细胞标志物富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)的表达水平;选用Lgr5表达量最高的SW620细胞,采用荧光激活细胞分选技术(FACS)分析Lgr5+细胞的比例;无血清悬浮培养得到结肠癌球细胞,FACS分选获得结肠癌Lgr5+ CSC,集落形成实验、5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药实验鉴定分选得到的结肠癌Lgr5+CSC生物学特征的变化;肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理Lgr5+ CSC建立炎症模型,CCK-8法筛选TNF-α的最适作用浓度及最佳作用时间;采用PI3K/AKT通路抑制剂MK2206处理Lgr5+ CSC,分为空白对照组、MK2206组、TNF-α组、MK2206联合TNF-α组;集落形成实验检测细胞增殖情况,异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测AKT、磷酸化的AKT (p-AKT)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化的GSK-3β(p-GSK-3β)蛋白水平.结果 SW620细胞中Lgr5的蛋白表达量显著高于其他细胞系;FACS分析得到SW620细胞中Lgr5+细胞比例为6.9％,无血清培养基悬浮培养后,分选得到SW620Lgr5+ CSC的比例为34.5％;与SW620细胞相比,SW620Lgr5+ CSC的增殖能力与耐药性显著提高;1 ng/mL TNF-α.作用24h时,SW620Lgr5+ CSC具有最高的细胞活力;与对照组相比,TNF-α显著增加SW620Lg5+ CSC的集落形成能力,但MK2206显著性降低SW620Lgr5+ CSC的集落形成能力,增加SW620Lgr5+ CSC的凋亡率;同时MK2206显著降低TNF-α诱导的SW620Lgr5+ CSC的集落形成能力,增加其凋亡比例.TNF-oα处理增加SW620LgT5+ CSC中AKT和GSK-3β的磷酸化水平,但MK2206可抑制TNF-α诱导的AKT和GSK-3β的磷酸化水平.结论 TNF-α通过激活PI3K/AKT信号通路促进SW620Lgr5+ CSC增殖.
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