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（泸州医学院附属医院，四川泸州646000）
摘要：目的：观察愈肝颗粒对大鼠肝癌模型的防治作用，并进一步探讨其表观遗传学机制。方法：采用甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR，MSP)技术检测大鼠肝组织p16抑癌基因异常甲基化情况，RT-PCR法检测3种主要DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）水平变化，ELISA法检测血清AFP水平，HE染色观察肝脏病理情况。结果：HE染色显示愈肝颗粒组大鼠肝脏病理改变较轻，细胞异形性不明显，而模型对照组大鼠肝脏细胞异形性明显，癌细胞排列呈梁状或多板状或实性成片排列。结论：愈肝颗粒可对大鼠肝癌的发生有防治作用，其机制与调节DNMTs表达水平及调整p16抑癌基因基因启动子甲基化水平有关。
关键词：愈肝颗粒；大鼠；肝癌；二乙基亚硝胺；DNA甲基转移酶；p16基因；甲基化
中图分类号：R735.7文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）10-0026-02
原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一。尽管近年来肝癌在诊治有很大进展，但其预后仍不乐观，因此采取预防措施降低其发生显得尤为重要。中药在防治肝癌方面有广阔的前景。本课题旨在通过动物试验，制造肝癌模型，运用现代分子生物学技术观察愈肝颗粒对DNMTs、p16抑癌基因基因启动子甲基化水平的影响，探索愈肝颗粒防治肝癌的作用机理，为临床防治肝癌提供可靠的实验依据。
1材料与方法
1.1试验材料与仪器
RNA抽提试剂盒（Trizol试剂盒）及DNA抽提试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；大鼠p16基因甲基化检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；RT试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；PCR试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖凝胶购自西班牙DIOWEST公司；DNAMarker购自天根生化科技（北京）有限公司；大鼠（rat）甲胎蛋白（AFP）检测试剂盒购自美国ADL公司；二乙基亚硝胺（DEN）购自sigma公司，愈肝颗粒浸膏由泸州市中医院制剂室生产，主要成分由茵陈、栀子、党参、黄芪、白术、青皮、丹参、泽兰、茜草等13味中药组成，SD大鼠由泸州医学院动物试验中心提供。
1.2方法
1.2.1动物模型制作及分组
选用标准清洁级SD大鼠70只，体重180±30g，将其随机分至3组，空白对照组10只，模型对照组30只，愈肝颗粒组30只，每组均为雌雄各半。模型对照组、愈肝颗粒组大鼠腹腔注射40mg/kg体重的DEN，2次/周，连续8周。空白对照组则注射等体积的生理盐水。同时，自实验开始愈肝颗粒组大鼠给予愈肝颗粒浸膏（每毫升相当于原生药1.86g）灌胃，10mL/kg体重，每天一次，连续8周。模型对照组、空白对照组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，8周末处死动物，留取标本。
1.2.2RT-PCR检测
采用Trizol法提取肝组织RNA，NanoDorpND-1000核酸蛋白测定仪定量，-70℃冰箱保存。每个样本设40μL反应体积，将2μｇ总RNA为底物及2μL随机引物、2μL逆转录酶、4μLdNTPs、1μLRNaseInhibitor42℃反应20min，cDNA于-20℃冰箱保存。以各样本cDNA5μL为模板，引物对按前向、反向顺序排列为：DNMT1：5′-CTGAGGAAGGCTACCTGGCTAA-3′，5-TGTCCGACTTGCTCCTCCTG-3′，扩增片段204bp，DNMT3A：5′-GGAATGTGCCAGAACTGTAAGA-3′，5′-CCTGTAGCAATCCCATCAAA-3′，扩增片段404bp，DNMT3B：5′-TGGTGAAGCGGATGATGGAGATGGC-3′，5′-CCGATGGCGTACTGCTGCTCTTAGG-3′，扩增片段329bp，GAPDH：5′-AAATCCCATCACCATCTTCC-3′，5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′，扩增片段581bp。
PCR反应体系：逆转录反应后原液2.5μL，Primer1(10μM)1μL，Primer2(10μM)1μL，2×MasterMix12.5μL，反应体积25μL。反应循环的设置：94℃3min；94℃30sec，TM℃30sec，72℃1min，30循环；72℃延伸5min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehydephosphate
dehydrogenase，GAPDH）为内参照。2%-3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行半定量分析以目的基因条带与内参照GAPDH基因条带吸光度值进行比较，计算其比值，并对实验分组中各样本计算结果取均值(见表1)。
表1各组大鼠肝组织中MSP与DNMTs的表达情况
（±s）
注：★与空白对照组比较，P<0.01；△模型对照组内比较，P<0.05；□模型对照组内比较，P<0.01；◇愈肝颗粒组内比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.01。
1.3统计学分析
采用SPSS13.0进行统计分析。数据均用均数±标准差（±S）表示，计量资料采用单因素方差分析，规定P≤0.05为有统计学意义。
2结果
2.1HE染色光镜下观察结果（见图1-6）
空白对照组(图1，2)：肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，大小均一，细胞核大而圆，胞质丰富。模型对照组（图3，4）：癌细胞排列呈梁状、索状或不规则。愈肝颗粒组（图5，6）：细胞排列基本规则，异形性不明显。
2.2p16基因异常甲基化
24例模型对照组大鼠肝脏标本经MSP法检测，18例p16基因启动子区异常甲基化（18/24），26例愈肝颗粒组大鼠肝脏标本MSP检测，p16基因启动子区异常甲基化（16/26），而10例空白对照组大鼠肝组织检测均为阴性（图7）（备注：造模死亡10只大鼠）。
图7p16基因启动子区甲基化MSP检测结果
2.3DNNMTs半定量结果
采用优化RT-PCR反应条件，对各个样本cDNA以特定引物（DNNMTs）及内参照GAPDH引物进行扩增，表1显示为半定量结果。
3讨论
本研究结果显示：24例模型对照组大鼠肝脏标本经MSP法检测，18例p16基因启动子区异常甲基化（18/24），26例愈肝颗粒组大鼠肝脏标本MSP检测，p16基因启动子区异常甲基化（16/26），而10例空白对照组大鼠肝组织检测均为阴性，说明p16基因的失活在肝癌的发生中有重要的意义，同时也表明愈肝颗粒可能通过抑制DNA的甲基化作用防治肝癌。模型对照组和愈肝颗粒组大鼠肝组织DNMTs水平检测结果与空白对照组比较，p16基因异常甲基化阳性组DNMT3A、DNMT3B升高较明显而DNMT1则相对下降，表明DNMT3A、DNMT3B在促进p16基因异常甲基化过程中起主要作用，同时表明3种DNMTs相对水平改变及相互作用与此进程关系密切；与Kimura等在肾透明细胞癌中的研究结果不同的是，DNMT1在MSP阴性的肝癌组织中高于正对照组并略高于异常甲基化阳性组。检测26例愈肝颗粒组与24例模型对照组大鼠肝组织DNMT1、DNMT3A、DNMT3B水平，结果显示：前者三项水平均较后者低，差异明显，均P<0.01，有统计学意义。说明愈肝颗粒可能通过调节DNMTs表达水平调整DNA甲基化状态，从而起到防治肝癌作用。这一实验结果提示中药愈肝颗粒可影响肝癌大鼠DNA甲基转移酶水平及p16基因的表达，为中西医结合治疗肝癌提供依据。
参考文献：
［1］王宝恩，张定凤主编.现代肝脏病学［M］.北京：科学出版社，2003：852-855.
［2］MetzgerE，WissmannM，YinN，MtdlerJM，SchneiderR，PetersAH．eta1．ISD1demethylatesrepressivehistonemarkstopromoteandrogen-receptor-dependenttranscription［J］.Nature，2005，437：436-9.
（责任编辑：王尚勇）
摘要：目的：观察愈肝颗粒对大鼠肝癌模型的防治作用，并进一步探讨其表观遗传学机制。方法：采用甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR，MSP)技术检测大鼠肝组织p16抑癌基因异常甲基化情况，RT-PCR法检测3种主要DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）水平变化，ELISA法检测血清AFP水平，HE染色观察肝脏病理情况。结果：HE染色显示愈肝颗粒组大鼠肝脏病理改变较轻，细胞异形性不明显，而模型对照组大鼠肝脏细胞异形性明显，癌细胞排列呈梁状或多板状或实性成片排列。结论：愈肝颗粒可对大鼠肝癌的发生有防治作用，其机制与调节DNMTs表达水平及调整p16抑癌基因基因启动子甲基化水平有关。
关键词：愈肝颗粒；大鼠；肝癌；二乙基亚硝胺；DNA甲基转移酶；p16基因；甲基化
中图分类号：R735.7文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）10-0026-02
原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一。尽管近年来肝癌在诊治有很大进展，但其预后仍不乐观，因此采取预防措施降低其发生显得尤为重要。中药在防治肝癌方面有广阔的前景。本课题旨在通过动物试验，制造肝癌模型，运用现代分子生物学技术观察愈肝颗粒对DNMTs、p16抑癌基因基因启动子甲基化水平的影响，探索愈肝颗粒防治肝癌的作用机理，为临床防治肝癌提供可靠的实验依据。
1材料与方法
1.1试验材料与仪器
RNA抽提试剂盒（Trizol试剂盒）及DNA抽提试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；大鼠p16基因甲基化检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；RT试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；PCR试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖凝胶购自西班牙DIOWEST公司；DNAMarker购自天根生化科技（北京）有限公司；大鼠（rat）甲胎蛋白（AFP）检测试剂盒购自美国ADL公司；二乙基亚硝胺（DEN）购自sigma公司，愈肝颗粒浸膏由泸州市中医院制剂室生产，主要成分由茵陈、栀子、党参、黄芪、白术、青皮、丹参、泽兰、茜草等13味中药组成，SD大鼠由泸州医学院动物试验中心提供。
1.2方法
1.2.1动物模型制作及分组
选用标准清洁级SD大鼠70只，体重180±30g，将其随机分至3组，空白对照组10只，模型对照组30只，愈肝颗粒组30只，每组均为雌雄各半。模型对照组、愈肝颗粒组大鼠腹腔注射40mg/kg体重的DEN，2次/周，连续8周。空白对照组则注射等体积的生理盐水。同时，自实验开始愈肝颗粒组大鼠给予愈肝颗粒浸膏（每毫升相当于原生药1.86g）灌胃，10mL/kg体重，每天一次，连续8周。模型对照组、空白对照组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，8周末处死动物，留取标本。
1.2.2RT-PCR检测
采用Trizol法提取肝组织RNA，NanoDorpND-1000核酸蛋白测定仪定量，-70℃冰箱保存。每个样本设40μL反应体积，将2μｇ总RNA为底物及2μL随机引物、2μL逆转录酶、4μLdNTPs、1μLRNaseInhibitor42℃反应20min，cDNA于-20℃冰箱保存。以各样本cDNA5μL为模板，引物对按前向、反向顺序排列为：DNMT1：5′-CTGAGGAAGGCTACCTGGCTAA-3′，5-TGTCCGACTTGCTCCTCCTG-3′，扩增片段204bp，DNMT3A：5′-GGAATGTGCCAGAACTGTAAGA-3′，5′-CCTGTAGCAATCCCATCAAA-3′，扩增片段404bp，DNMT3B：5′-TGGTGAAGCGGATGATGGAGATGGC-3′，5′-CCGATGGCGTACTGCTGCTCTTAGG-3′，扩增片段329bp，GAPDH：5′-AAATCCCATCACCATCTTCC-3′，5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′，扩增片段581bp。
PCR反应体系：逆转录反应后原液2.5μL，Primer1(10μM)1μL，Primer2(10μM)1μL，2×MasterMix12.5μL，反应体积25μL。反应循环的设置：94℃3min；94℃30sec，TM℃30sec，72℃1min，30循环；72℃延伸5min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehydephosphate
dehydrogenase，GAPDH）为内参照。2%-3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行半定量分析以目的基因条带与内参照GAPDH基因条带吸光度值进行比较，计算其比值，并对实验分组中各样本计算结果取均值(见表1)。
表1各组大鼠肝组织中MSP与DNMTs的表达情况
（±s）
注：★与空白对照组比较，P<0.01；△模型对照组内比较，P<0.05；□模型对照组内比较，P<0.01；◇愈肝颗粒组内比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.01。
1.3统计学分析
采用SPSS13.0进行统计分析。数据均用均数±标准差（±S）表示，计量资料采用单因素方差分析，规定P≤0.05为有统计学意义。
2结果
2.1HE染色光镜下观察结果（见图1-6）
空白对照组(图1，2)：肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，大小均一，细胞核大而圆，胞质丰富。模型对照组（图3，4）：癌细胞排列呈梁状、索状或不规则。愈肝颗粒组（图5，6）：细胞排列基本规则，异形性不明显。
2.2p16基因异常甲基化
24例模型对照组大鼠肝脏标本经MSP法检测，18例p16基因启动子区异常甲基化（18/24），26例愈肝颗粒组大鼠肝脏标本MSP检测，p16基因启动子区异常甲基化（16/26），而10例空白对照组大鼠肝组织检测均为阴性（图7）（备注：造模死亡10只大鼠）。
图7p16基因启动子区甲基化MSP检测结果
2.3DNNMTs半定量结果
采用优化RT-PCR反应条件，对各个样本cDNA以特定引物（DNNMTs）及内参照GAPDH引物进行扩增，表1显示为半定量结果。
3讨论
本研究结果显示：24例模型对照组大鼠肝脏标本经MSP法检测，18例p16基因启动子区异常甲基化（18/24），26例愈肝颗粒组大鼠肝脏标本MSP检测，p16基因启动子区异常甲基化（16/26），而10例空白对照组大鼠肝组织检测均为阴性，说明p16基因的失活在肝癌的发生中有重要的意义，同时也表明愈肝颗粒可能通过抑制DNA的甲基化作用防治肝癌。模型对照组和愈肝颗粒组大鼠肝组织DNMTs水平检测结果与空白对照组比较，p16基因异常甲基化阳性组DNMT3A、DNMT3B升高较明显而DNMT1则相对下降，表明DNMT3A、DNMT3B在促进p16基因异常甲基化过程中起主要作用，同时表明3种DNMTs相对水平改变及相互作用与此进程关系密切；与Kimura等在肾透明细胞癌中的研究结果不同的是，DNMT1在MSP阴性的肝癌组织中高于正对照组并略高于异常甲基化阳性组。检测26例愈肝颗粒组与24例模型对照组大鼠肝组织DNMT1、DNMT3A、DNMT3B水平，结果显示：前者三项水平均较后者低，差异明显，均P<0.01，有统计学意义。说明愈肝颗粒可能通过调节DNMTs表达水平调整DNA甲基化状态，从而起到防治肝癌作用。这一实验结果提示中药愈肝颗粒可影响肝癌大鼠DNA甲基转移酶水平及p16基因的表达，为中西医结合治疗肝癌提供依据。
参考文献：
［1］王宝恩，张定凤主编.现代肝脏病学［M］.北京：科学出版社，2003：852-855.
［2］MetzgerE，WissmannM，YinN，MtdlerJM，SchneiderR，PetersAH．eta1．ISD1demethylatesrepressivehistonemarkstopromoteandrogen-receptor-dependenttranscription［J］.Nature，2005，437：436-9.
（责任编辑：王尚勇）