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摘要：以青钱柳叶为原料，采用石油醚脱脂，沸水浴提取，乙醇沉淀，经过Sevage 法除蛋白，冷冻干燥得到青钱柳叶精制多糖，苯酚-硫酸法测定了总糖含量。采用清除DPPH 自由基、清除羟基自由基的体外抗氧化模型，并以抗坏血酸（VC）为阳性对照，研究了青钱柳叶精制多糖的体外抗氧化能力。结果表明，通过多步提取得率为1.79%，苯酚-硫酸法测得总糖含量为84.7%，青钱柳叶精制多糖具有较好的抗氧化活性，青钱柳叶多糖对DPPH 自由基、羟基自由基均有明显的清除作用，且最高清除率分别为89.3%、63.4 %，其浓度与抗氧化活性呈现一定的量效关系。
关键词：青钱柳 多糖 抗氧化
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00
青钱柳俗称摇钱树、山麻柳、青钱李、甜茶树、一串钱、等，属双子叶植物胡桃科青钱柳属，是我国特有的单属种，是国家重点保护的濒危植物之一，属三类保护植物。青钱柳是一种高大速生阔叶乔木，因其树形似柳，果实圆形似铜线，色青而下垂，故名“青钱柳”[1]。
青钱柳在民间的应用，主要是制成保健茶饮用，具有悠久的应用历史，因其具有特殊的保健功能而被誉为“神茶”，是我国第一个获得美国FDA 认可的保健茶[2]。现代化学研究表明青钱柳的主要成分包括有机酸、黄酮、多糖和三萜类等，其中达玛烷型三萜皂苷类是其主要的甜味成分[3]。药理活性研究表明具有降糖[4]、降脂[5]、降压[6]、抗肿瘤、抗菌[7]、抗氧化[8]和增强免疫[9]等多种作用，并安全无毒。
目前青钱柳的开发利用比较单一，主要是开发为保健茶产品，随着青钱柳组培及扩繁技术的推广，大量的青钱柳叶资源亟待开发利用，本研究对青钱柳叶多糖进行提取，然后测定其抗氧化性，为其综合开发利用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干燥青钱柳叶，由陕西百圣生物工程有限公司从秦岭南麓采集烘干保存。
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）为日本东京化成工业株式会社产品；无水乙醇、浓硫酸、水杨酸、苯酚、正丁醇、氯仿、葡萄糖、乙醚等均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、真空恒温干燥箱（天京市拓普仪器有限公司）、冷冻干燥机LGJ-10D（北京四环科学仪器厂有限公司）、紫外分光光度计4802S（龙尼柯上海仪器有限公司）、旋转蒸发仪RV10基本型（德国IKA公司）、722G可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。
1.3方法
1.3.1青钱柳多糖的制备
干燥的青钱柳叶粉碎，过40目筛。石油醚脱脂，按固液比1：10的比例进行青钱柳粉石油醚（沸程60-90℃）回流1h脱脂，脱脂后过滤，滤渣烘干称重。滤渣用无离子水回流提取多糖，固液比1：10，温度95℃，提取2h，提取2次，过滤合并提取液，滤液减压浓缩至原体积30%。加入3倍浓缩液体积的95%的乙醇，4℃醇沉过夜，反复醇沉4次，4500r/min，离心15min得到絮状沉淀，得粗多糖。
将粗多糖复溶在蒸馏水，Sevage法脱蛋白[10]，Sevage试剂用氯仿和正丁醇体积比5：1配制，在粗多糖水溶液中按1/5体积加入Sevag试剂，混合物剧烈振摇30 min，静置2h后，分液，重复操作5次，上层水液冷冻干燥得精制多糖样品。
1.3.2青钱柳多糖的测定
（1）标准曲线建立。准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，蒸馏水准确定容至100mL的1mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10mL该溶液，用蒸馏水稀释定容至100mL，即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。精确配制90%，6%苯酚。
取9支干净的具塞试管按表1方法操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min，取出凉水冷却10min，以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
（2）多糖含量测定。将提取得到的青钱柳粗多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL，取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度。
1.3.3抗氧化活性测定
（1）DPPH·清除活性。将1mg/ml的样品溶液用无水乙醇稀释成质量浓度为2，4，6，8和10mg/mL的溶液。分别取3mL上述溶液于试管中，加入2mL 0.2mmol/L的DPPH·溶液，混匀后避光静置1h，在517 nm处测定吸光值（用原溶剂作参比）。同时测定3mL溶剂（无水乙醇）与2ml 0.2mmol/L的DPPH·溶液的混合溶液在517 nm处的吸光值。以抗坏血酸为阳性对照，临用前以去离子水配制成与待测物溶液同等浓度的对照液。蒸馏水做空白对照。做三次平行。按照下式计算不同浓度待测物的DPPH自由基清除率（IP）。
（2）·OH清除活性。将10mg/ml的待测物用无水乙醇分别稀释成质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml 的待测物溶液，分别取1ml 上述待测物溶液于试管中，依次加入6mmol/l FeSO4 溶液1ml、6mmol/l水杨酸乙醇溶液1ml，最后加入8mmol/l的H2O2 溶液1mL以启动反应，37℃水浴加热30min后终止反应，于510nm测定吸光度。以抗坏血酸为阳性对照，临用前以去离子水配制成与本试验待测物溶液同等浓度的对照液。蒸馏水做空白对照。做三次平行。
2 结果与分析
2.1多糖提取及含量测定结果 以葡萄糖为标准品，吸光度为纵坐标，标准品为横坐标，作标准曲线如图1，Y=0.0074x+0.0070，R2=0.9991，在0-80ug/mL的范围内呈良好的线性关系。
经过脱脂、水提、醇沉、脱蛋白，从20g青钱柳叶中得到0.358g精制多糖，提取得率为1.79%，苯酚-硫酸法测得总糖含量为84.7%。
2.3 抗氧化活性测定
2.3.1 DPPH·清除作用
DPPH·具有单一的电子，所以能够接受一个电子或氢离子，其乙醇溶液呈紫色，在波长517nm下具有最大吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对从而吸收消失或减弱，颜色从紫色逐渐变成黄色，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析，间接评价该自由基清除剂的活性。抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越强。体外测定的青钱柳多糖对DPPH·清除效果见图2，可看出青钱柳多糖的清除DPPH自由基的活性总体上小于阳性对照VC，但是其清除DPPH自由基的活性随样品浓度增加而增大，当青钱柳浓度从2mg/mL增加到4mg/mL时，其清除DPPH自由基的能力迅速增加，达到76%，当青钱柳浓度为10mg/mL时对DPPH自由基清除率为89.3%，基本上与VC清除率持平（90.9%）。
2.3.2·OH清除作用
和其他自由基相比，羟基自由基是体内最活跃的活性氧自由基，产生于生命活动的氧化代谢过程，可使氨基酸、蛋白质、脂肪类和核酸等大分子发生氧化损伤，诱导细胞凋亡或使转化细胞脱离正常细胞的控制无限生长而癌变[11]。
由图3可以看出，青钱柳多糖对羟基有一定的清除活性，最高清除率是63.4%，葛霞等[8]对青钱柳的抗氧化活性研究的结果为当多糖质量浓度上升到1.2 mg/mL 时，对羟基清除率达到68.1%，与本研究的结果相符。维生素C 浓度在0.6-1.0mg/mL时，清除活性均在90%以上，由此看出青钱柳多糖的清除羟基自由基的能力远远小于阳性对照维生素C。对羟基自由基而讲，目前普遍有两个机理：一个是抑制羟基自由基的产生，另一是清除羟基自由。具体哪种机理需要被深入研究。
4 结语
本研究结果表明，青钱柳叶水提多糖具有一定的抗氧化能力，对DPPH 自由基、羟基自由基有较好的清除作用，且浓度与清除率在一定浓度范围内呈量效关系。虽然青钱柳粗多糖清除DPPH和自由基效果较阳性对照VC弱，但青钱柳多糖能够达到清除自由基、阻断自由基链式反应的作用，在一定浓度范围内能抑制自由基引起的氧化损伤，这为青钱柳多糖的进一步研究和应用提供了理论依据。
参考文献
[1]上官新晨，陈木森，蒋艳 等.微波提取青钱柳多糖的研究[J].食品与生物技术学报，2007，26（5）：6-9.
[2]王克全，曹莹.青钱柳化学成分及药理作用的研究进展[J].黑龙江医学， 2007，31（8）：577-679.
[3]何春年，彭勇，肖伟.青钱柳神茶的应用历史与研究现状[J].中国现代中药，2012，14（5）：62-68.
[4]吴凡，王晨，严七秀 等.青钱柳降血糖功能因子研究概况[J].光明中医，2014，29（10）：2245-2247.
[5]Kurihara H， Fukami H， Kusumoto A， et al. Hypoglycemic action of Cyclocary apaliurus （Batal.） Iljinskaja in normal and diabetic mice[J].Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry， 2003， 67（4）：877-880.
[6]侯小利，刘晓霞，王硕 等.青钱柳叶总黄酮对自发性高血压大鼠的影响[J].中药药理与临床，2014，30（2）：62-69.
[7]黄贝贝，叶荷平.青钱柳抗菌作用的实验研究[J].江西中医学院学报，2006，18（4）：48-49.
[8]葛霞，陈婷婷，蔡教英 等.青钱柳多糖抗氧化活性的研究[J].中国食品学报，2011，11（5）：59-64.
[9]黄贝贝，肖凤仪，张文平 等.青钱柳对小鼠免疫功能的影响[J].江西中医学院学报，2004，16（5）：59-60.
[10]史德芳，杨洋，孙晓雪 等.仙人掌多糖提取过程中三种脱蛋白方法的比较研究[J].现代食品科技，2006（4）：93-95.
[11]王瑞遵.黄芪多糖的分离纯化及体外抗氧化活性研究[D].河南：郑州大学，2010.
收稿日期：2015-03-26
作者简介：胡红忠（1969—），男，陕西略阳县人，工程师，从事保健食品及食品开发与加工20余年。
关键词：青钱柳 多糖 抗氧化
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00
青钱柳俗称摇钱树、山麻柳、青钱李、甜茶树、一串钱、等，属双子叶植物胡桃科青钱柳属，是我国特有的单属种，是国家重点保护的濒危植物之一，属三类保护植物。青钱柳是一种高大速生阔叶乔木，因其树形似柳，果实圆形似铜线，色青而下垂，故名“青钱柳”[1]。
青钱柳在民间的应用，主要是制成保健茶饮用，具有悠久的应用历史，因其具有特殊的保健功能而被誉为“神茶”，是我国第一个获得美国FDA 认可的保健茶[2]。现代化学研究表明青钱柳的主要成分包括有机酸、黄酮、多糖和三萜类等，其中达玛烷型三萜皂苷类是其主要的甜味成分[3]。药理活性研究表明具有降糖[4]、降脂[5]、降压[6]、抗肿瘤、抗菌[7]、抗氧化[8]和增强免疫[9]等多种作用，并安全无毒。
目前青钱柳的开发利用比较单一，主要是开发为保健茶产品，随着青钱柳组培及扩繁技术的推广，大量的青钱柳叶资源亟待开发利用，本研究对青钱柳叶多糖进行提取，然后测定其抗氧化性，为其综合开发利用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干燥青钱柳叶，由陕西百圣生物工程有限公司从秦岭南麓采集烘干保存。
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）为日本东京化成工业株式会社产品；无水乙醇、浓硫酸、水杨酸、苯酚、正丁醇、氯仿、葡萄糖、乙醚等均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、真空恒温干燥箱（天京市拓普仪器有限公司）、冷冻干燥机LGJ-10D（北京四环科学仪器厂有限公司）、紫外分光光度计4802S（龙尼柯上海仪器有限公司）、旋转蒸发仪RV10基本型（德国IKA公司）、722G可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。
1.3方法
1.3.1青钱柳多糖的制备
干燥的青钱柳叶粉碎，过40目筛。石油醚脱脂，按固液比1：10的比例进行青钱柳粉石油醚（沸程60-90℃）回流1h脱脂，脱脂后过滤，滤渣烘干称重。滤渣用无离子水回流提取多糖，固液比1：10，温度95℃，提取2h，提取2次，过滤合并提取液，滤液减压浓缩至原体积30%。加入3倍浓缩液体积的95%的乙醇，4℃醇沉过夜，反复醇沉4次，4500r/min，离心15min得到絮状沉淀，得粗多糖。
将粗多糖复溶在蒸馏水，Sevage法脱蛋白[10]，Sevage试剂用氯仿和正丁醇体积比5：1配制，在粗多糖水溶液中按1/5体积加入Sevag试剂，混合物剧烈振摇30 min，静置2h后，分液，重复操作5次，上层水液冷冻干燥得精制多糖样品。
1.3.2青钱柳多糖的测定
（1）标准曲线建立。准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，蒸馏水准确定容至100mL的1mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10mL该溶液，用蒸馏水稀释定容至100mL，即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。精确配制90%，6%苯酚。
取9支干净的具塞试管按表1方法操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min，取出凉水冷却10min，以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
（2）多糖含量测定。将提取得到的青钱柳粗多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL，取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度。
1.3.3抗氧化活性测定
（1）DPPH·清除活性。将1mg/ml的样品溶液用无水乙醇稀释成质量浓度为2，4，6，8和10mg/mL的溶液。分别取3mL上述溶液于试管中，加入2mL 0.2mmol/L的DPPH·溶液，混匀后避光静置1h，在517 nm处测定吸光值（用原溶剂作参比）。同时测定3mL溶剂（无水乙醇）与2ml 0.2mmol/L的DPPH·溶液的混合溶液在517 nm处的吸光值。以抗坏血酸为阳性对照，临用前以去离子水配制成与待测物溶液同等浓度的对照液。蒸馏水做空白对照。做三次平行。按照下式计算不同浓度待测物的DPPH自由基清除率（IP）。
（2）·OH清除活性。将10mg/ml的待测物用无水乙醇分别稀释成质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml 的待测物溶液，分别取1ml 上述待测物溶液于试管中，依次加入6mmol/l FeSO4 溶液1ml、6mmol/l水杨酸乙醇溶液1ml，最后加入8mmol/l的H2O2 溶液1mL以启动反应，37℃水浴加热30min后终止反应，于510nm测定吸光度。以抗坏血酸为阳性对照，临用前以去离子水配制成与本试验待测物溶液同等浓度的对照液。蒸馏水做空白对照。做三次平行。
2 结果与分析
2.1多糖提取及含量测定结果 以葡萄糖为标准品，吸光度为纵坐标，标准品为横坐标，作标准曲线如图1，Y=0.0074x+0.0070，R2=0.9991，在0-80ug/mL的范围内呈良好的线性关系。
经过脱脂、水提、醇沉、脱蛋白，从20g青钱柳叶中得到0.358g精制多糖，提取得率为1.79%，苯酚-硫酸法测得总糖含量为84.7%。
2.3 抗氧化活性测定
2.3.1 DPPH·清除作用
DPPH·具有单一的电子，所以能够接受一个电子或氢离子，其乙醇溶液呈紫色，在波长517nm下具有最大吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对从而吸收消失或减弱，颜色从紫色逐渐变成黄色，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析，间接评价该自由基清除剂的活性。抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越强。体外测定的青钱柳多糖对DPPH·清除效果见图2，可看出青钱柳多糖的清除DPPH自由基的活性总体上小于阳性对照VC，但是其清除DPPH自由基的活性随样品浓度增加而增大，当青钱柳浓度从2mg/mL增加到4mg/mL时，其清除DPPH自由基的能力迅速增加，达到76%，当青钱柳浓度为10mg/mL时对DPPH自由基清除率为89.3%，基本上与VC清除率持平（90.9%）。
2.3.2·OH清除作用
和其他自由基相比，羟基自由基是体内最活跃的活性氧自由基，产生于生命活动的氧化代谢过程，可使氨基酸、蛋白质、脂肪类和核酸等大分子发生氧化损伤，诱导细胞凋亡或使转化细胞脱离正常细胞的控制无限生长而癌变[11]。
由图3可以看出，青钱柳多糖对羟基有一定的清除活性，最高清除率是63.4%，葛霞等[8]对青钱柳的抗氧化活性研究的结果为当多糖质量浓度上升到1.2 mg/mL 时，对羟基清除率达到68.1%，与本研究的结果相符。维生素C 浓度在0.6-1.0mg/mL时，清除活性均在90%以上，由此看出青钱柳多糖的清除羟基自由基的能力远远小于阳性对照维生素C。对羟基自由基而讲，目前普遍有两个机理：一个是抑制羟基自由基的产生，另一是清除羟基自由。具体哪种机理需要被深入研究。
4 结语
本研究结果表明，青钱柳叶水提多糖具有一定的抗氧化能力，对DPPH 自由基、羟基自由基有较好的清除作用，且浓度与清除率在一定浓度范围内呈量效关系。虽然青钱柳粗多糖清除DPPH和自由基效果较阳性对照VC弱，但青钱柳多糖能够达到清除自由基、阻断自由基链式反应的作用，在一定浓度范围内能抑制自由基引起的氧化损伤，这为青钱柳多糖的进一步研究和应用提供了理论依据。
参考文献
[1]上官新晨，陈木森，蒋艳 等.微波提取青钱柳多糖的研究[J].食品与生物技术学报，2007，26（5）：6-9.
[2]王克全，曹莹.青钱柳化学成分及药理作用的研究进展[J].黑龙江医学， 2007，31（8）：577-679.
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[4]吴凡，王晨，严七秀 等.青钱柳降血糖功能因子研究概况[J].光明中医，2014，29（10）：2245-2247.
[5]Kurihara H， Fukami H， Kusumoto A， et al. Hypoglycemic action of Cyclocary apaliurus （Batal.） Iljinskaja in normal and diabetic mice[J].Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry， 2003， 67（4）：877-880.
[6]侯小利，刘晓霞，王硕 等.青钱柳叶总黄酮对自发性高血压大鼠的影响[J].中药药理与临床，2014，30（2）：62-69.
[7]黄贝贝，叶荷平.青钱柳抗菌作用的实验研究[J].江西中医学院学报，2006，18（4）：48-49.
[8]葛霞，陈婷婷，蔡教英 等.青钱柳多糖抗氧化活性的研究[J].中国食品学报，2011，11（5）：59-64.
[9]黄贝贝，肖凤仪，张文平 等.青钱柳对小鼠免疫功能的影响[J].江西中医学院学报，2004，16（5）：59-60.
[10]史德芳，杨洋，孙晓雪 等.仙人掌多糖提取过程中三种脱蛋白方法的比较研究[J].现代食品科技，2006（4）：93-95.
[11]王瑞遵.黄芪多糖的分离纯化及体外抗氧化活性研究[D].河南：郑州大学，2010.
收稿日期：2015-03-26
作者简介：胡红忠（1969—），男，陕西略阳县人，工程师，从事保健食品及食品开发与加工20余年。