【摘 要】
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目的:利用双分子荧光互补技术定量分析cofilin-actin的特异性相互作用.方法:首先构建表达VN210(编码荧光蛋白Venus 1-210氨基酸)和VC210(编码荧光蛋白Venus 210-238氨基酸)探针的质粒,通过梯度剂量转染检测该探针对的自组装能力;其次构建VN210/VC210与bJun、bFos、Fos△zip、cofilin(WT)、cofilin(S3E)和actin的融合表达载体,在HeLa细胞中分别过表达不同载体组合,以VN210-bJun/bFos-VC210组作为阳性对照,
【机 构】
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中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系 北京100005
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目的:利用双分子荧光互补技术定量分析cofilin-actin的特异性相互作用.方法:首先构建表达VN210(编码荧光蛋白Venus 1-210氨基酸)和VC210(编码荧光蛋白Venus 210-238氨基酸)探针的质粒,通过梯度剂量转染检测该探针对的自组装能力;其次构建VN210/VC210与bJun、bFos、Fos△zip、cofilin(WT)、cofilin(S3E)和actin的融合表达载体,在HeLa细胞中分别过表达不同载体组合,以VN210-bJun/bFos-VC210组作为阳性对照,以VN210-bJun/bFos△zip-VC210组作为阴性对照,使用多功能细胞观测显微镜观察并拍摄荧光图像;最后使用多功能微孔板检测仪,对对照组进行波谱扫描,确定最适合检测的激发光波长和发射光波长,再以此选择波长检测实验组中可观察到荧光信号组合的荧光强度,进行统计分析.结果:(1)VN210/VC210在各转染剂量组中均未观察到荧光信号;(2)阳性对照组可观察到荧光信号,阴性对照组未观察到荧光信号;实验组中,VN210-cofilin(WT)/actin-VC210组荧光信号较强,VN210-cofilin(S3E)/actin-VC210和VN210/actin-VC210组荧光信号较弱,其余组均观察不到荧光信号;(3)产生荧光信号的实验组中,VN210-cofilin(S3E)/actin-VC210和VN210/actin-VC210组间的荧光信号无显著差异,但分别与VN210-cofilin(WT)/actin-VC210组具有显著差异.结论:VN210/VC210双分子荧光互补技术可定量检测cofilin-actin的特异性相互作用.
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