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摘要 [目的]研究EDTA对镉胁迫下玉米种子发芽的促进作用，为在污染土壤环境下进行作物种子发芽提供理论和技术支持。[方法]在砂土盆钵里进行玉米种子发芽试验，分别用不同浓度氯化镉以及EDTA+氯化镉处理观察种子发芽率。[结果]高浓度氯化镉显著抑制玉米种子发芽，但是添加EDTA后能显著提高镉胁迫下种子发芽率。药理学试验证明，EDTA增强的发芽能力与镉诱导的活性氧毒害有密切关系。[结论]EDTA与镉螯合后可减轻镉的活性氧毒害，从而提高种子发芽率。
关键词 EDTA;镉胁迫;玉米种子;双氧水
中图分类号 S513;Q945.78 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）19-0043-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.012
Abstract [Objective] To investigate the effects of EDTA on maize seed germination under Cd stress， and to provide theoretical and technical support for the seed germination operation under contaminated soil environment. [Method] The seed germination test was carried out in sand basin. Treatments of different cadmium chlorideat concentrations and EDTA + cadmium chloride were adopted for seed germination rate. [Result] Cadmium chloride at high concentration could significantly inhibit the seed germination of maize， but adding EDTA could significantly enhance the seed germination rate under Cd stress. Pharmacological tests proved that germinating ability improvement by EDTA was closely related to the reactive oxygen toxicity induced by Cd. [Conclusion] EDTA mediated seed germination improvement under Cd stress can be partly attributed to the attenuation of ROS levels by formation of CdEDTA complex.
Key words EDTA;Cd stress;Maize seed;H2O2
作者簡介 邓本良（1978—），男，湖南邵阳人，讲师，博士，从事活性氧调控作物种子发芽机理研究。
收稿日期 2020-02-06
重金属胁迫能显著抑制作物种子发芽，如镉离子和铅离子能显著抑制小麦种子发芽[1-2]。为提高作物种子在重金属胁迫下的发芽率，采用不同保护剂进行处理取得了较好的效果，如对镉盐或砷盐胁迫下的作物种子用一氧化氮处理能显著提高这2种重金属胁迫下的发芽率[3-4]。重金属抑制植物种子发芽一种可能的机理是重金属诱导产生的大量活性氧，从而抑制了种子发芽[5-8]。EDTA作为一种重金属螯合剂，能促进植物对重金属的吸收，同时能帮助其在重金属污染的环境下更好地生长而得到广泛应用[9-10]。然而，目前鲜见重金属螯合剂对重金属胁迫下的植物种子发芽影响的研究。鉴于此，笔者对高浓度镉离子胁迫下的玉米种子采用EDTA处理，研究EDTA在高浓度镉胁迫环境下对玉米种子发芽的促进作用，并从活性氧毒害角度对其机理进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验选用的玉米种子为香甜糯2015，购自淘宝网。
1.2 试验方法
在种子发芽盒中加入事先用不同浓度氯化镉（0、1、10 和100 mmol/L）润洗的粗砂（直径约2～3 mm，模拟污染环境），然后将自来水浸泡2 h的玉米种子半埋入砂子中，并分成若干组。对照组用自来水喷洒，处理组包括用不同浓度（0、1、10和100 mmol/L）EDTA、二甲基硫脲（DMTU，10 mmol/L）、咪唑（10 mmol/L）、双氧水（H2O2，10 mmol/L）等或其组合进行处理，观察这些试剂处理后对玉米种子发芽率的影响。每天分2次检查种子发芽情况，连续检查72 h。当露白0.5 mm即视为发芽。每个试验设定3个重复。
1.3 数据处理
采用SPSS软件对检测结果进行分析;采用Duncan’s多重比较进行分析;采用Excel 2007软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 镉盐对玉米种子发芽率的影响
由图1可知，水对照处理在24、48和72 h的玉米种子发芽率依次为45%、93%和95%（P<0.05）。与水对照相比，低浓度（1 mmol/L）CdCl2能显著加快玉米种子发芽。处理24、48和72 h的玉米种子发芽率分别为57%、96%和96%（P<0.05）。而高浓度（100 mmol/L）CdCl2润洗后的砂子则能显著抑制玉米种子发芽率，如处理24、38和72 h发芽率分别是21%、25%和26%（P<0.05）。与水对照相比，100 mmol/L CdCl2 处理后玉米种子发芽率最终（处理72 h）降低了73%（P<0.05），说明只有高浓度镉处理才能有效抑制玉米种子发芽。 2.2 EDTA浓度对玉米种子发芽率的影响
采用4个浓度梯度（0、1、10和100 mmol/L）的EDTA（实际使用其钠盐）来检测其对玉米种子在72 h内的发芽能力的影响。由图2可知，不同浓度EDTA都能不同程度地抑制玉米种子发芽能力，并呈现一种浓度梯度关系：浓度越高则抑制效果越强。与水对照相比，100 mmol/L EDTA处理24、48和72 h发芽率分别降低了76%、62%和60%（P<0.05）。与高浓度EDTA强烈抑制最终发芽率相比，低浓度EDTA处理主要是延缓发芽率，并不明显影响最终（处理72 h）发芽率。与水对照相比，处理24 h时1、10 mmol/L EDTA处理的玉米发芽率分别降低5%和31%（P<0.05）。
2.3 氧还试剂对高浓度镉盐胁迫下玉米种子发芽率的影响
图3为100 mmol/L EDTA及相关氧还试剂（H2O2、DMTU和IMZ）对高浓度（100 mmol）镉盐胁迫下玉米种子发芽率的影响。由图3可知，EDTA处理显著增强了玉米种子在镉盐胁迫下的发芽率：EDTA在24、48和72 h时均提高了玉米种子在镉盐胁迫下的发芽率，分别达到67%、244%和233%（P<0.05）。然而EDTA处理增强的发芽率可被氧化剂H2O2削弱：10 mmol/L H2O2处理24，48和72 h均可降低玉米发芽率，分别降低了14%、12%和10%（P<0.05）。与氧化剂H2O2相比，抗氧化劑DMTU处理能进一步提高EDTA对镉胁迫下的玉米种子发芽率：10 mmol/L DMTU处理24、48和72 h均可提高玉米发芽率，分别降低了23%、8%和9%（P<0.05）。与DMTU相比，咪唑处理也能进一步增强EDTA提高的镉盐胁迫下的玉米种子发芽率：10 mmol/L咪唑处理24、48和72 h可提高玉米发芽率，分别为26%、9%和10%（P<0.05）。
3 结论与讨论
该研究结果显示，用高浓度镉离子和EDTA单独处理都能显著抑制玉米种子发芽，前者（氯化镉）可能是其诱导的活性氧含量过高导致玉米种子发芽受到抑制，这与前人用镉离子处理小麦种子的结论一致[1]。而单独用EDTA处理，尤其在高浓度下也能显著抑制玉米种子发芽，这可能是因为EDTA能螯合种子中某些关键离子（如钙离子），从而阻止种子进一步发芽。镉离子胁迫下的玉米种子用高浓度EDTA处理后能显著逆转镉离子的抑制效果，显著促进玉米种子发芽。对于这一现象，一个可能的机理是EDTA螯合镉离子后，减轻了镉离子对玉米种子的活性氧毒害作用。为了部分验证这一猜测，笔者使用了对Cd+EDTA处理的玉米外施H2O2和特异性活性氧清除剂DMTU以及NADPH氧化酶特异性抑制剂咪唑后，发现H2O2能降低EDTA对镉胁迫下的玉米种子的保护作用;相反，DMTU和咪唑能进一步提高EDTA对镉离子胁迫下的玉米种子的保护作用，这是因为DMTU能直接清除一部分EDTA-Cd螯合物诱导的活性氧，从而有利于种子发芽。类似地，咪唑能部分抑制植物体内1个能产活性氧的主要酶，即NADPH氧化酶[11]，从而降低了EDTA-Cd螯合物诱导的活性氧含量，这也说明NADPH氧化酶也是镉离子的1个靶点，这与前人报道类似[12]，同时也符合“oxidative window for germination”假说[13]。该假说认为，种子只在一定的活性氧浓度范围内才能促进种子发芽，浓度过高或过低都会抑制种子发芽。前人报道均显示，只有处于合适范围内的活性氧才能促进作物种子发芽[6-8]。 该研究结果显示，EDTA能不同程度地延缓，甚至抑制玉米种子的发芽;高浓度镉离子抑制的玉米种子发芽能被EDTA逆转;EDTA提高的镉离子胁迫下的玉米种子发芽率与活性氧水平有密切关系。此外，EDTA促进的镉离子胁迫下的玉米种子发芽可能还有其他原因，这需要今后进一步从生理生化和遗传学角度去深入研究其机理。
参考文献
[1] AHMAD I，AKHTAR M J，ZAHIR Z A，et al.Effect of cadmium on seed germination and seedling growth of four wheat（Triticum aestivum L.）cultivars[J].Pakistan journal of botany，2012，44（5）：1569-1574.
[2] YANG Y L，WEI X L，LU J，et al.Leadinduced phytotoxicity mechanism involved in seed germination and seedling growth of wheat（Triticum aestivum L.）[J].Ecotoxicology and environmental safety，2010，73（8）：1982-1987.
[3] HE J Y，REN Y F，CHEN X L，et al.Protective roles of nitric oxide on seed germination and seedling growth of rice（Oryza sativa L.）under cadmium stress[J].Ecotoxicology and environmental safety，2014，108：114-119.
[4] ISMAIL G S M.Protective role of nitric oxide against arsenicinduced damages in germinating mung bean seeds[J].Acta physiologiae plantarum，2012，34（4）：1303-1311. [5] KRANNER I，COLVILLE L.Metals and seeds：Biochemical and molecular implications and their significance for seed germination[J].Environmental and experimental botany，2011，72（1）：93-105.
[6] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.The effects of temperature on the germination behavior of white，yellow，red and purple maize plant seeds[J].Acta physiologiae plantarum，2015，37（8）：174-184.
[7] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.Can heavy metal pollution defend seed germination against heat stress？ Effect of heavy metals （Cu2+，Cd2+ and Hg2+）on maize seed germination under high temperature[J].Environmental pollution，2016，216：46-52.
[8] ZHANG Y F，DENG B L，LI Z T.Inhibition of NADPH oxidase increases defense enzyme activities and improves maize seed germination under Pb stress[J].Ecotoxicology and environmental safety，2018，158：187-192.
[9] GRCˇMAN H，VELIKONJABOLTA ，VODNIK D，et al.EDTA enhanced heavy metal phytoextraction：Metal accumulation，leaching and toxicity[J].Plant and soil，2001，235（1）：105-114.
[10] LIPHADZI M S，KIRKHAM M B，MANKIN K R，et al.EDTAassisted heavymetal uptake by poplar and sunflower grown at a longterm sewagesludge farm[J].Plant and soil，2003，257（1）：171-182.
[11] HAO F S，WANG X C，CHEN J.Involvement of plasmamembrane NADPH oxidase in nickelinduced oxidative stress in roots of wheat seedlings[J].Plant science，2006，170（1）：151-158.
[12] JAKUBOWSKA D，JANICKARUSSAK M，KABAA K，et al.Modification of plasma membrane NADPH oxidase activity in cucumber seedling roots in response to cadmium stress[J].Plant science，2015，234：50-59.
[13] BAILLY C，ELMAAROUFBOUTEAU H，CORBINEAU F.From intracellular signaling networks to cell death：The dual role of reactive oxygen species in seed physiology[J].Comptes rendus biologies，2008，331（10）：806-814.
关键词 EDTA;镉胁迫;玉米种子;双氧水
中图分类号 S513;Q945.78 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）19-0043-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.012
Abstract [Objective] To investigate the effects of EDTA on maize seed germination under Cd stress， and to provide theoretical and technical support for the seed germination operation under contaminated soil environment. [Method] The seed germination test was carried out in sand basin. Treatments of different cadmium chlorideat concentrations and EDTA + cadmium chloride were adopted for seed germination rate. [Result] Cadmium chloride at high concentration could significantly inhibit the seed germination of maize， but adding EDTA could significantly enhance the seed germination rate under Cd stress. Pharmacological tests proved that germinating ability improvement by EDTA was closely related to the reactive oxygen toxicity induced by Cd. [Conclusion] EDTA mediated seed germination improvement under Cd stress can be partly attributed to the attenuation of ROS levels by formation of CdEDTA complex.
Key words EDTA;Cd stress;Maize seed;H2O2
作者簡介 邓本良（1978—），男，湖南邵阳人，讲师，博士，从事活性氧调控作物种子发芽机理研究。
收稿日期 2020-02-06
重金属胁迫能显著抑制作物种子发芽，如镉离子和铅离子能显著抑制小麦种子发芽[1-2]。为提高作物种子在重金属胁迫下的发芽率，采用不同保护剂进行处理取得了较好的效果，如对镉盐或砷盐胁迫下的作物种子用一氧化氮处理能显著提高这2种重金属胁迫下的发芽率[3-4]。重金属抑制植物种子发芽一种可能的机理是重金属诱导产生的大量活性氧，从而抑制了种子发芽[5-8]。EDTA作为一种重金属螯合剂，能促进植物对重金属的吸收，同时能帮助其在重金属污染的环境下更好地生长而得到广泛应用[9-10]。然而，目前鲜见重金属螯合剂对重金属胁迫下的植物种子发芽影响的研究。鉴于此，笔者对高浓度镉离子胁迫下的玉米种子采用EDTA处理，研究EDTA在高浓度镉胁迫环境下对玉米种子发芽的促进作用，并从活性氧毒害角度对其机理进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验选用的玉米种子为香甜糯2015，购自淘宝网。
1.2 试验方法
在种子发芽盒中加入事先用不同浓度氯化镉（0、1、10 和100 mmol/L）润洗的粗砂（直径约2～3 mm，模拟污染环境），然后将自来水浸泡2 h的玉米种子半埋入砂子中，并分成若干组。对照组用自来水喷洒，处理组包括用不同浓度（0、1、10和100 mmol/L）EDTA、二甲基硫脲（DMTU，10 mmol/L）、咪唑（10 mmol/L）、双氧水（H2O2，10 mmol/L）等或其组合进行处理，观察这些试剂处理后对玉米种子发芽率的影响。每天分2次检查种子发芽情况，连续检查72 h。当露白0.5 mm即视为发芽。每个试验设定3个重复。
1.3 数据处理
采用SPSS软件对检测结果进行分析;采用Duncan’s多重比较进行分析;采用Excel 2007软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 镉盐对玉米种子发芽率的影响
由图1可知，水对照处理在24、48和72 h的玉米种子发芽率依次为45%、93%和95%（P<0.05）。与水对照相比，低浓度（1 mmol/L）CdCl2能显著加快玉米种子发芽。处理24、48和72 h的玉米种子发芽率分别为57%、96%和96%（P<0.05）。而高浓度（100 mmol/L）CdCl2润洗后的砂子则能显著抑制玉米种子发芽率，如处理24、38和72 h发芽率分别是21%、25%和26%（P<0.05）。与水对照相比，100 mmol/L CdCl2 处理后玉米种子发芽率最终（处理72 h）降低了73%（P<0.05），说明只有高浓度镉处理才能有效抑制玉米种子发芽。 2.2 EDTA浓度对玉米种子发芽率的影响
采用4个浓度梯度（0、1、10和100 mmol/L）的EDTA（实际使用其钠盐）来检测其对玉米种子在72 h内的发芽能力的影响。由图2可知，不同浓度EDTA都能不同程度地抑制玉米种子发芽能力，并呈现一种浓度梯度关系：浓度越高则抑制效果越强。与水对照相比，100 mmol/L EDTA处理24、48和72 h发芽率分别降低了76%、62%和60%（P<0.05）。与高浓度EDTA强烈抑制最终发芽率相比，低浓度EDTA处理主要是延缓发芽率，并不明显影响最终（处理72 h）发芽率。与水对照相比，处理24 h时1、10 mmol/L EDTA处理的玉米发芽率分别降低5%和31%（P<0.05）。
2.3 氧还试剂对高浓度镉盐胁迫下玉米种子发芽率的影响
图3为100 mmol/L EDTA及相关氧还试剂（H2O2、DMTU和IMZ）对高浓度（100 mmol）镉盐胁迫下玉米种子发芽率的影响。由图3可知，EDTA处理显著增强了玉米种子在镉盐胁迫下的发芽率：EDTA在24、48和72 h时均提高了玉米种子在镉盐胁迫下的发芽率，分别达到67%、244%和233%（P<0.05）。然而EDTA处理增强的发芽率可被氧化剂H2O2削弱：10 mmol/L H2O2处理24，48和72 h均可降低玉米发芽率，分别降低了14%、12%和10%（P<0.05）。与氧化剂H2O2相比，抗氧化劑DMTU处理能进一步提高EDTA对镉胁迫下的玉米种子发芽率：10 mmol/L DMTU处理24、48和72 h均可提高玉米发芽率，分别降低了23%、8%和9%（P<0.05）。与DMTU相比，咪唑处理也能进一步增强EDTA提高的镉盐胁迫下的玉米种子发芽率：10 mmol/L咪唑处理24、48和72 h可提高玉米发芽率，分别为26%、9%和10%（P<0.05）。
3 结论与讨论
该研究结果显示，用高浓度镉离子和EDTA单独处理都能显著抑制玉米种子发芽，前者（氯化镉）可能是其诱导的活性氧含量过高导致玉米种子发芽受到抑制，这与前人用镉离子处理小麦种子的结论一致[1]。而单独用EDTA处理，尤其在高浓度下也能显著抑制玉米种子发芽，这可能是因为EDTA能螯合种子中某些关键离子（如钙离子），从而阻止种子进一步发芽。镉离子胁迫下的玉米种子用高浓度EDTA处理后能显著逆转镉离子的抑制效果，显著促进玉米种子发芽。对于这一现象，一个可能的机理是EDTA螯合镉离子后，减轻了镉离子对玉米种子的活性氧毒害作用。为了部分验证这一猜测，笔者使用了对Cd+EDTA处理的玉米外施H2O2和特异性活性氧清除剂DMTU以及NADPH氧化酶特异性抑制剂咪唑后，发现H2O2能降低EDTA对镉胁迫下的玉米种子的保护作用;相反，DMTU和咪唑能进一步提高EDTA对镉离子胁迫下的玉米种子的保护作用，这是因为DMTU能直接清除一部分EDTA-Cd螯合物诱导的活性氧，从而有利于种子发芽。类似地，咪唑能部分抑制植物体内1个能产活性氧的主要酶，即NADPH氧化酶[11]，从而降低了EDTA-Cd螯合物诱导的活性氧含量，这也说明NADPH氧化酶也是镉离子的1个靶点，这与前人报道类似[12]，同时也符合“oxidative window for germination”假说[13]。该假说认为，种子只在一定的活性氧浓度范围内才能促进种子发芽，浓度过高或过低都会抑制种子发芽。前人报道均显示，只有处于合适范围内的活性氧才能促进作物种子发芽[6-8]。 该研究结果显示，EDTA能不同程度地延缓，甚至抑制玉米种子的发芽;高浓度镉离子抑制的玉米种子发芽能被EDTA逆转;EDTA提高的镉离子胁迫下的玉米种子发芽率与活性氧水平有密切关系。此外，EDTA促进的镉离子胁迫下的玉米种子发芽可能还有其他原因，这需要今后进一步从生理生化和遗传学角度去深入研究其机理。
参考文献
[1] AHMAD I，AKHTAR M J，ZAHIR Z A，et al.Effect of cadmium on seed germination and seedling growth of four wheat（Triticum aestivum L.）cultivars[J].Pakistan journal of botany，2012，44（5）：1569-1574.
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[6] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.The effects of temperature on the germination behavior of white，yellow，red and purple maize plant seeds[J].Acta physiologiae plantarum，2015，37（8）：174-184.
[7] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.Can heavy metal pollution defend seed germination against heat stress？ Effect of heavy metals （Cu2+，Cd2+ and Hg2+）on maize seed germination under high temperature[J].Environmental pollution，2016，216：46-52.
[8] ZHANG Y F，DENG B L，LI Z T.Inhibition of NADPH oxidase increases defense enzyme activities and improves maize seed germination under Pb stress[J].Ecotoxicology and environmental safety，2018，158：187-192.
[9] GRCˇMAN H，VELIKONJABOLTA ，VODNIK D，et al.EDTA enhanced heavy metal phytoextraction：Metal accumulation，leaching and toxicity[J].Plant and soil，2001，235（1）：105-114.
[10] LIPHADZI M S，KIRKHAM M B，MANKIN K R，et al.EDTAassisted heavymetal uptake by poplar and sunflower grown at a longterm sewagesludge farm[J].Plant and soil，2003，257（1）：171-182.
[11] HAO F S，WANG X C，CHEN J.Involvement of plasmamembrane NADPH oxidase in nickelinduced oxidative stress in roots of wheat seedlings[J].Plant science，2006，170（1）：151-158.
[12] JAKUBOWSKA D，JANICKARUSSAK M，KABAA K，et al.Modification of plasma membrane NADPH oxidase activity in cucumber seedling roots in response to cadmium stress[J].Plant science，2015，234：50-59.
[13] BAILLY C，ELMAAROUFBOUTEAU H，CORBINEAU F.From intracellular signaling networks to cell death：The dual role of reactive oxygen species in seed physiology[J].Comptes rendus biologies，2008，331（10）：806-814.