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【摘要】 目的 探讨溃疡性结肠炎不同时期选择素表达及其意义。方法 采用前瞻性研究设计,选择2007年7~12月UC患者,采用组织匀浆及ELISA检测结肠黏膜不同时期内选择素的表达。结果 ①共29例资料完整患者进入资料统计整理;②活动期UC患者病变黏膜及正常黏膜P选择素表达均明显高于正常对照组(F=35.2,P<0.01);E选择素在UC患者正常及病变黏膜同样高表达,但两种选择素异常表达在病变黏膜及正常黏膜中无统计学差异(t=1.46和1.32,P>0.10;③UC缓解期内P、E选择素高表达与UC复发频次关系密切(χ2=4.201和5.040,P<0.05)。结论 选择素P、E可能是UC发病重要炎性介质,在UC发病中可能无决定性作用。但选择素高表达可能与UC复发频次关系密切。
【关键词】 溃汤性结肠炎;P选择素;E选择素
【Abstract】 Objective To investigate the expression of selectin in different stage and position of colon mucos in UC.Methods The study was prospectively designed.The cases of UC from 2007.7 to 2007.12 was selected and selectin P、E in colon mucos homogenate were detected by ELISA.Results ①29 cases of UC with whole dates were brought into the last statistic.②Slectin P in suffered and normal mucos of UC in active stage was high expressed,compared to healthy group,statistics was significant(F=35.2,P<0.01).Selectin E was high expressed in mucos of UC with active stage.But there were no statistical difference between normal and suffered mucos(t=1.46 and 1.32,P>0.10).③In remittance stage,high level of selectin P、E in colon mucos and relapse frequency showed positive correlation(χ2=4.201 and 5.040,P<0.05).Conclusion Selectin P、E are important inflammation factor in UC and maybe not take a decisive role in the onset of UC.But high level of selectin P、E in remittance stage in colon mucos may have more possibility of relapse.
【Key words】Uleerative colitis;E-selectin;Sectin-P
DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.06.59
作者单位:046011 长治医学院附属和济医院内镜科(王培龙 张俊峰), 消化科(张谦)
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis UC) 是一种病因未完全明了的慢性非特异性结肠炎症。已经证实结肠黏膜陷窝内白细胞聚集是UC活动期标志性改变。在白细胞聚集、迁移过程中,选择素家族包括选择素P、选择素E及选择素L起重要作用。以往研究表明在UC活动期,血液中及病变黏膜中选择素表达增高[1]。但选择素异常表达是否为免疫异常的起始因子以及是否同UC预后关系密切。目前尚无相关文献。本研究定量测定分析溃疡性结肠炎患者不同时期内选择素的表达并分析其异常表达同UC预后的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象及标本收集 选择2007年7~12月在本院首次诊断为活动性溃疡性结肠炎的患者为研究组,诊断标准按照2007年济南会议上制定的对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[2]。对照组为同期进行结肠镜检查并且检查结果为正常的健康体检人群。首次在我院就诊并入选的UC患者行结肠镜检查时于明显病变黏膜处和正常黏膜处各取3块组织,迅速置于-196℃液氮中冷冻贮藏备用。首次诊断为UC均采用柳氮磺胺嘧啶(salazosulfamide,SAS)治疗,治疗2个月无效,使用美沙拉嗪(艾迪莎R)治疗。必要时使用激素或免疫抑制剂。入选UC患者复查时同以上方法采集标本,活动性病变1个月/次,病变缓解期2 个月/次。观察期限为1年。对照组于结肠镜检查时随机取组织三块,贮存方法同研究组。
1.2 仪器及试剂 ①结肠镜采用OlympusV-70型电子结肠镜。②赛多利斯精密天平(型号:CP323S;灵敏度1 mg)。3.S-250D型超声细胞破碎机(美国必能达)4.ELx800酶标仪(上海宝特仪器有限公司)。人可溶性E、P选择素ELISA试剂盒(Uscnlife,编号分别为E0549 h、E0569 h,购自上海亚培生物科技有限公司)。
1.3 操作过程 ①将组织标本置精密天平上称重后置试管中加入4℃PBS液2 ml,使用超声破碎探头60 W破碎60 s(周围冰块降温,肉眼观察无块状组织);②将组织液1640 r/min离心后取上清液-80℃冰箱贮存备用;③ELISA法检测组织液中E、P选择素含量,操作方法按照试剂盒说明书进行,由专业从事ELISA试验人员进行ELISA操作,最后数据换算成ng/mg组织。
1.4 统计学分析 组织内选择素表达含量用x±s(ng/mg)表示,组间比较使用方差分析。率的检验使用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。统计软件选择SPSS11.0。
2 结果
2.1 入选患者一般资料:截至2008年12月,研究组资料完整UC患者29例,其中,男7例,女22例,年龄22~65岁,平均36.7±4.9岁,病变范围:累及直肠7例,直肠-乙状结肠13例,左半结肠5例,全结肠4例。ASA治疗后12月内17例患者完全缓解,10例至少在观察期有过1次病变活动缓解交替,2例SAS无效,采用美沙拉嗪(艾迪莎R)治疗后缓解。
2.2 活动期UC病变黏膜与正常黏膜选择素表达差异比较(x±s,ng/mg):活动期UC病变黏膜及正常黏膜P选择素表达均明显增高(F=35.2,P<0.01),E选择素在活动期UC病变黏膜及正常黏膜均明显表达,但两中选择素异常表达在病变黏膜及正常黏膜中无统计学差异(t=1.46和1.32,P>0.10)。
2.3 缓解期选择素表达与UC复发频次之间关系 缓解期标本共收集76份,以緩解期选择素表达中位数(P选择素37.6 ng/mg,E选择素18.6 ng/mg)为界,将选择素表达分为高表达与低表达组。缓解期P选择素与E选择素表达与UC持续缓解或复发频次存在相关关系(χ2=4.201和5.040,P<0.05)。
表1
缓解期选择素表达与UC治疗预后之间关系
组别持续缓解(例)复发(例)P值
P选择素中位数(37.6 ng/mg)高(24次)570.025
低(52次)123
E选择素中位数(18.6 ng/mg)高(13次)480.004
低(63次)132
3 讨论
溃疡性结肠炎目前主要发病机制为免疫紊乱导致免疫系统对结肠黏膜的损害。在UC活动性病变早期特征性病变为病变黏膜隐窝内中性粒细胞浸润及脓肿形成。在以往的研究中,炎性介质IL-1、TL-12、IL-14、TNF得到广泛研究并取得巨大进展[3-5],但以上炎性因子均与淋巴细胞免疫关系更为密切。但难以解释UC活动性病变早期中性粒细胞早期在结腸黏膜陷窝聚集及其作用。
粒细胞与UC发病关系密切,有研究表明UC患者粒细胞凋亡水平降低,并且粒细胞分离对重症UC有较好的治疗作用[6]。选择素为一种14KD的膜糖蛋白,一般在血小板、白细胞以及活化毛细血管内皮细胞表面表达[7]。与黏附分子家族等一起在炎症反应中尤其为炎症初期粒细胞聚集过程中有重要作用。Fagerstam JP等[8]研究了选择素P与UC的关系,发现UC患者病变黏膜P-选择素表达较正常结肠黏膜表达明显增高,但也有学者如 Magro F等[9]发现血清P选择素与E选择素在UC患者虽然增高,但与IBS患者及正常组对照并未发现明显统计学差异。但是B.Vainer等[10]采用组织匀浆法,直接使用ELISA方法测定结肠黏膜中P选择素与E选择素含量,发现结肠病变黏膜较正常人群结肠黏膜中P、E选择素均明显升高,并且有明显统计学意义。可能病变部位高浓度选择素部分被清除有关。
本研究中,使用 ELISA方法定量测定UC患者结肠黏膜组织中选择素含量。同正常人群对比,UC患者活动期病变黏膜及正常黏膜中P选择素均有高表达,组间差异有明显统计学意义(P<0.01)。E选择素在UC活动期病变黏膜较正常黏膜高,但无统计学意义。可能E选择素表达增高与体内其他免疫介质作用关系密切。
关于缓解期结肠黏膜选择素的改变文献较少,本研究中,缓解期中P、E选择素的表达仍然高于正常水平,E选择素一般仅存在于炎症部位,可以推测UC即使在缓解期内,结肠黏膜内炎症仍在活动。将选择素表达以中位数为界分为高表达组与低表达组,与UC复发频次间进行相关性分析(χ2=4.201和5.040,P<0.05),表明选择素的高表达和复发可能存在相关关系。定期检测选择素表达可能对UC预后有一定意义,但尚需更大量样本进一步研究。
选择素在组织胺、肿瘤坏死因子等免疫因子作用下在炎症部位血管内皮细胞迅速表达,从而介导中性粒细胞、淋巴细胞等相互作用。本研究中UC活动期内正常结肠黏膜与病变黏膜选择素均异常表达提示UC患者存在全身免疫异常,但免疫异常无法解释UC为什么多见于远端结肠,因此,远端结肠与近端结肠是否存在病理生理差异以及与UC关系值得进一步研究。
参考文献
[1] Nielsen OH,Brynskov J,Vainer B.Increased mucosal concentrations of soluble intercellular adhesion molecule-1(sICAM-1),sE-selectin,and interleukin-8 in active ulcerative colitis.Dig Dis Sci,1996,41(9):1780-1785.
[2] 中华医学会消化病分会炎症性肠病协作组.对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见.中华消化杂志,2007,27(8):545-551.
[3] Ludwiczek O,Vannier E,Borggraefe I,et al.Imbalance between interleukin-1 agonists and antagonists:relationship to severity of inflammatory bowel disease.Clin Exp Immunol,2004,138(2):323-329.
[4] Damen GM,van Lierop P,de Ruiter L,et al.Production of IL12p70 and IL23 by monocyte-derived dendritic cells in children with inflammatory bowel disease.Gut,2008,57(10):1480.
[5] Owczarek D,Cibor D,Szczepanek M,et al.Biological therapy of inflammatory bowel disease.Pol Arch Med Wewn,2009,119(1-2):84-88.
[6] Abreu MT,Plevy S,Sands BE,et al.Selective leukocyte apheresis for the treatment of inflammatory bowel disease.J Clin Gastroenterol,2007,41(10):874-888.
[7] Varki A.Selectins and other mammalian sialic acid-binding lectins.Curr Opin Cell Biol,1992,4(2):257-266.
[8] Fagerstam JP,Whiss PA,Storm,M,et al.Expression plateletP-selee tion and detection of soluble P-selection.NYP and RANTES in patients with inflammatory bowel disease.Inflamm Rus,2000,49:466-476.
[9] Magro F,Araujo F,Pereira P,et al Soluble selectins,sICAM,sVCAM,and angiogenic proteins in different activity groups of patients with inflammatory bowel disease.Dig Dis Sci,2004,49(7-8):1265-1274.
[10] B.Vainer,H.Nielsen.Changed colonic profile of P-selectin,platelet-endothelial cell adhesion molecule-1(PECAM-1),intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1),ICAM-2,and ICAM-3 in inflammatory bowel disease.Clin Exp Immunol,2000,121:242-247.
【关键词】 溃汤性结肠炎;P选择素;E选择素
【Abstract】 Objective To investigate the expression of selectin in different stage and position of colon mucos in UC.Methods The study was prospectively designed.The cases of UC from 2007.7 to 2007.12 was selected and selectin P、E in colon mucos homogenate were detected by ELISA.Results ①29 cases of UC with whole dates were brought into the last statistic.②Slectin P in suffered and normal mucos of UC in active stage was high expressed,compared to healthy group,statistics was significant(F=35.2,P<0.01).Selectin E was high expressed in mucos of UC with active stage.But there were no statistical difference between normal and suffered mucos(t=1.46 and 1.32,P>0.10).③In remittance stage,high level of selectin P、E in colon mucos and relapse frequency showed positive correlation(χ2=4.201 and 5.040,P<0.05).Conclusion Selectin P、E are important inflammation factor in UC and maybe not take a decisive role in the onset of UC.But high level of selectin P、E in remittance stage in colon mucos may have more possibility of relapse.
【Key words】Uleerative colitis;E-selectin;Sectin-P
DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.06.59
作者单位:046011 长治医学院附属和济医院内镜科(王培龙 张俊峰), 消化科(张谦)
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis UC) 是一种病因未完全明了的慢性非特异性结肠炎症。已经证实结肠黏膜陷窝内白细胞聚集是UC活动期标志性改变。在白细胞聚集、迁移过程中,选择素家族包括选择素P、选择素E及选择素L起重要作用。以往研究表明在UC活动期,血液中及病变黏膜中选择素表达增高[1]。但选择素异常表达是否为免疫异常的起始因子以及是否同UC预后关系密切。目前尚无相关文献。本研究定量测定分析溃疡性结肠炎患者不同时期内选择素的表达并分析其异常表达同UC预后的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象及标本收集 选择2007年7~12月在本院首次诊断为活动性溃疡性结肠炎的患者为研究组,诊断标准按照2007年济南会议上制定的对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[2]。对照组为同期进行结肠镜检查并且检查结果为正常的健康体检人群。首次在我院就诊并入选的UC患者行结肠镜检查时于明显病变黏膜处和正常黏膜处各取3块组织,迅速置于-196℃液氮中冷冻贮藏备用。首次诊断为UC均采用柳氮磺胺嘧啶(salazosulfamide,SAS)治疗,治疗2个月无效,使用美沙拉嗪(艾迪莎R)治疗。必要时使用激素或免疫抑制剂。入选UC患者复查时同以上方法采集标本,活动性病变1个月/次,病变缓解期2 个月/次。观察期限为1年。对照组于结肠镜检查时随机取组织三块,贮存方法同研究组。
1.2 仪器及试剂 ①结肠镜采用OlympusV-70型电子结肠镜。②赛多利斯精密天平(型号:CP323S;灵敏度1 mg)。3.S-250D型超声细胞破碎机(美国必能达)4.ELx800酶标仪(上海宝特仪器有限公司)。人可溶性E、P选择素ELISA试剂盒(Uscnlife,编号分别为E0549 h、E0569 h,购自上海亚培生物科技有限公司)。
1.3 操作过程 ①将组织标本置精密天平上称重后置试管中加入4℃PBS液2 ml,使用超声破碎探头60 W破碎60 s(周围冰块降温,肉眼观察无块状组织);②将组织液1640 r/min离心后取上清液-80℃冰箱贮存备用;③ELISA法检测组织液中E、P选择素含量,操作方法按照试剂盒说明书进行,由专业从事ELISA试验人员进行ELISA操作,最后数据换算成ng/mg组织。
1.4 统计学分析 组织内选择素表达含量用x±s(ng/mg)表示,组间比较使用方差分析。率的检验使用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。统计软件选择SPSS11.0。
2 结果
2.1 入选患者一般资料:截至2008年12月,研究组资料完整UC患者29例,其中,男7例,女22例,年龄22~65岁,平均36.7±4.9岁,病变范围:累及直肠7例,直肠-乙状结肠13例,左半结肠5例,全结肠4例。ASA治疗后12月内17例患者完全缓解,10例至少在观察期有过1次病变活动缓解交替,2例SAS无效,采用美沙拉嗪(艾迪莎R)治疗后缓解。
2.2 活动期UC病变黏膜与正常黏膜选择素表达差异比较(x±s,ng/mg):活动期UC病变黏膜及正常黏膜P选择素表达均明显增高(F=35.2,P<0.01),E选择素在活动期UC病变黏膜及正常黏膜均明显表达,但两中选择素异常表达在病变黏膜及正常黏膜中无统计学差异(t=1.46和1.32,P>0.10)。
2.3 缓解期选择素表达与UC复发频次之间关系 缓解期标本共收集76份,以緩解期选择素表达中位数(P选择素37.6 ng/mg,E选择素18.6 ng/mg)为界,将选择素表达分为高表达与低表达组。缓解期P选择素与E选择素表达与UC持续缓解或复发频次存在相关关系(χ2=4.201和5.040,P<0.05)。
表1
缓解期选择素表达与UC治疗预后之间关系
组别持续缓解(例)复发(例)P值
P选择素中位数(37.6 ng/mg)高(24次)570.025
低(52次)123
E选择素中位数(18.6 ng/mg)高(13次)480.004
低(63次)132
3 讨论
溃疡性结肠炎目前主要发病机制为免疫紊乱导致免疫系统对结肠黏膜的损害。在UC活动性病变早期特征性病变为病变黏膜隐窝内中性粒细胞浸润及脓肿形成。在以往的研究中,炎性介质IL-1、TL-12、IL-14、TNF得到广泛研究并取得巨大进展[3-5],但以上炎性因子均与淋巴细胞免疫关系更为密切。但难以解释UC活动性病变早期中性粒细胞早期在结腸黏膜陷窝聚集及其作用。
粒细胞与UC发病关系密切,有研究表明UC患者粒细胞凋亡水平降低,并且粒细胞分离对重症UC有较好的治疗作用[6]。选择素为一种14KD的膜糖蛋白,一般在血小板、白细胞以及活化毛细血管内皮细胞表面表达[7]。与黏附分子家族等一起在炎症反应中尤其为炎症初期粒细胞聚集过程中有重要作用。Fagerstam JP等[8]研究了选择素P与UC的关系,发现UC患者病变黏膜P-选择素表达较正常结肠黏膜表达明显增高,但也有学者如 Magro F等[9]发现血清P选择素与E选择素在UC患者虽然增高,但与IBS患者及正常组对照并未发现明显统计学差异。但是B.Vainer等[10]采用组织匀浆法,直接使用ELISA方法测定结肠黏膜中P选择素与E选择素含量,发现结肠病变黏膜较正常人群结肠黏膜中P、E选择素均明显升高,并且有明显统计学意义。可能病变部位高浓度选择素部分被清除有关。
本研究中,使用 ELISA方法定量测定UC患者结肠黏膜组织中选择素含量。同正常人群对比,UC患者活动期病变黏膜及正常黏膜中P选择素均有高表达,组间差异有明显统计学意义(P<0.01)。E选择素在UC活动期病变黏膜较正常黏膜高,但无统计学意义。可能E选择素表达增高与体内其他免疫介质作用关系密切。
关于缓解期结肠黏膜选择素的改变文献较少,本研究中,缓解期中P、E选择素的表达仍然高于正常水平,E选择素一般仅存在于炎症部位,可以推测UC即使在缓解期内,结肠黏膜内炎症仍在活动。将选择素表达以中位数为界分为高表达组与低表达组,与UC复发频次间进行相关性分析(χ2=4.201和5.040,P<0.05),表明选择素的高表达和复发可能存在相关关系。定期检测选择素表达可能对UC预后有一定意义,但尚需更大量样本进一步研究。
选择素在组织胺、肿瘤坏死因子等免疫因子作用下在炎症部位血管内皮细胞迅速表达,从而介导中性粒细胞、淋巴细胞等相互作用。本研究中UC活动期内正常结肠黏膜与病变黏膜选择素均异常表达提示UC患者存在全身免疫异常,但免疫异常无法解释UC为什么多见于远端结肠,因此,远端结肠与近端结肠是否存在病理生理差异以及与UC关系值得进一步研究。
参考文献
[1] Nielsen OH,Brynskov J,Vainer B.Increased mucosal concentrations of soluble intercellular adhesion molecule-1(sICAM-1),sE-selectin,and interleukin-8 in active ulcerative colitis.Dig Dis Sci,1996,41(9):1780-1785.
[2] 中华医学会消化病分会炎症性肠病协作组.对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见.中华消化杂志,2007,27(8):545-551.
[3] Ludwiczek O,Vannier E,Borggraefe I,et al.Imbalance between interleukin-1 agonists and antagonists:relationship to severity of inflammatory bowel disease.Clin Exp Immunol,2004,138(2):323-329.
[4] Damen GM,van Lierop P,de Ruiter L,et al.Production of IL12p70 and IL23 by monocyte-derived dendritic cells in children with inflammatory bowel disease.Gut,2008,57(10):1480.
[5] Owczarek D,Cibor D,Szczepanek M,et al.Biological therapy of inflammatory bowel disease.Pol Arch Med Wewn,2009,119(1-2):84-88.
[6] Abreu MT,Plevy S,Sands BE,et al.Selective leukocyte apheresis for the treatment of inflammatory bowel disease.J Clin Gastroenterol,2007,41(10):874-888.
[7] Varki A.Selectins and other mammalian sialic acid-binding lectins.Curr Opin Cell Biol,1992,4(2):257-266.
[8] Fagerstam JP,Whiss PA,Storm,M,et al.Expression plateletP-selee tion and detection of soluble P-selection.NYP and RANTES in patients with inflammatory bowel disease.Inflamm Rus,2000,49:466-476.
[9] Magro F,Araujo F,Pereira P,et al Soluble selectins,sICAM,sVCAM,and angiogenic proteins in different activity groups of patients with inflammatory bowel disease.Dig Dis Sci,2004,49(7-8):1265-1274.
[10] B.Vainer,H.Nielsen.Changed colonic profile of P-selectin,platelet-endothelial cell adhesion molecule-1(PECAM-1),intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1),ICAM-2,and ICAM-3 in inflammatory bowel disease.Clin Exp Immunol,2000,121:242-247.