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【摘要】目的研究髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）-463位G/A基因多态性与福建汉族人冠心病易感性的关系。方法采用病例－对照研究方法，应用聚合酶链反应－限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）技术检测157例冠脉造影证实的冠心病患者（冠心病组）和78例冠脉造影未对照者（冠脉造影未发现任何可辨认斑块或狭窄，对照组）MPO－463位基因型，并进行统计学分析。结果MPO-463位G/A多态性有3种基因型（GG，GA，AA），两组间基因型分布和等位基因频率分布差异有统计学意义（P均<0.05），携带至少一个等位基因G（GG+GA型）者发生冠心病的危险性是不携带此基因（AA型）者的3.518倍。结论 MPO－463位基因多态性与福建汉族人冠心病易感性相关。
【关键词】髓过氧化物酶；冠状动脉性心脏病；基因多态性
冠心病是（CHD）由于冠状动脉粥样硬化使冠脉管腔狭窄或阻塞，或（和）冠状动脉功能性改变（痉挛）导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病，与遗传、环境等多种因素有关。目前认为，髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）通过多种机制参与动脉粥样硬化的发生发展，因此本文从基因角度对我国福建汉族人MPO-463bp处G/A基因多态性进行了分析，探讨其与CHD易感性的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集2005年11月至2006年10月在福建省立医院住院并经冠脉造影证实至少有1支冠状动脉狭窄≥50%者157例为CHD组，男125例，女32例，年龄33~87岁，平均年龄62.93±11.09岁。均为福建汉族人。对照组为福建汉族同期住院后经冠脉造影证实未发现任何可辨认斑块或狭窄者78例，男49 例，女29例，年龄20~86岁，平均年龄59.64±11.32岁，排除X综合征、周围血管病、变异型心绞痛以及有明显心肌梗死证据的个体。
1.2方法
1.2.1模板DNA制备
采集EDTA-K2抗凝静脉血2ml，采用盐析法提取外周血DNA，并用核酸蛋白分析仪对其进行定量测定。
1.2.2引物设计与合成
设计一对引物[1]，P1 ：5’-CGG TAT AGG CAC ACA ATG GTG A-3’， P2：5’-GCA ATG GTT CAA GCG ATT CTT C-3’，由TaKaRa公司合成。
1.2.3PCR反应条件反应体系包括引物0.4μM、dNTP 0.2mM、Buffer2.5μl、Taq酶0.625U、模板DNA 100ng，用无核水补足体积至25μl。PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，循环35个周期；最后72℃额外延伸10min。4℃备用。
1.2.4 扩增产物的限制性酶切用限制性内切酶Aci I消化经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物，37℃水浴16小时以上，65℃保温20min 终止反应。酶切产物采用3％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用凝胶成像系统进行成像和分析（瑞典Amersham Pharmacia公司）。
1.3统计学处理基因型频率用基因计数法统计。基因型的Hardy-Weinberg 平衡符合程度用χ2检验。冠心病组与对照组间的基因型及等位基因频率分布的比较采用χ2检验；计算比值比（odds ratio, OR）及其95％可信区间（confidence interval, CI）。以P<0.05为差异有显著性意义，应用SPSS 11.5 统计软件进行数据统计分析。
2 结果
2.1MPO基因-463G/A基因位点检测PCR扩增产物为350bp，其中含有一个固定的Aci I酶切位点，酶切后产生一个61bp的片断作为内对照。当为G等位基因时，酶切后形成三个片断，169bp、120bp和61bp；当为A等位基因时，形成两个片断，289bp和61bp（见图1）。
（M: Maker1、3：GA基因型2：GG基因型4：AA基因型）
图1酶切产物经3％琼脂糖凝胶电泳结果
2.2 MPO-463G/A多态性的基因型分布的组间比较
基因型分布符合Hardy-Wenberg 平衡，MPO-463G/A多态性在冠心病组与基因型分布和等位基因频率分布差异有统计学意义（χ2值分别为8.474和8.201，P均<0.05），见表1。
表1 冠心病组与对照组MPO –463G/A 基因型和等位
注：与对照组比较，*P均<0.05
2.3冠心病组和对照组MPO-463位基因型构成比比较具有GG基因型者发生冠心病的危险性较具有AA基因型者显著增高（χ2＝7.315, P=0.007<0.01，OR=4.070，95％CI=1.472-11.253）；杂合子GA发生冠心病的危险性较纯合子AA仍有升高趋势（χ2＝3.53, P=0.060，OR=2.750， 95％CI=0.957-7.900）；将GA和GG基因型合并计算，发现携带至少一个等位基因G者其患冠心病的风险仍显著增高（χ2＝6.20, P=0.013<0.05，OR=3.518，95％CI= 1.307-9.472），见表2。
表2 MPO基因型与冠心病遗传易感性的关系
3讨论
冠心病是一种多因素疾病，即多种因素作用于不同环节所致。随着分子生物学技术的不断发展及SNP技术在临床的应用，目前认为冠心病的发生发展可能与基因的多态性相关[2] 因此，对冠心病相关基因多态性的研究，不仅可预测疾病发生的风险度，且可为疾病的基因诊断和治疗提供理论基础。
髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）是一种新的炎症标志物，它是由中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要过氧化物酶，MPO催化过氧化氢和氯离子生成次氯酸，使LDL氧化成为ox-LDL，启动AS的发生；同时，MPO促进HDL的氧化，影响其胆固醇的逆向转运作用，参与AS的发生发展。MPO基因位于染色体17q23－24区域，由12个外显子和11个内含子组成。自1996年Piedrafita等[3]发现MPO基因转录起始点上游-463处存在G/A多态性，并证实当等位基因为G时可增强转录25倍而A等位基因仅可增强转录几倍以来。G-A变异破坏了转录因子SP1的结合位点，降低mRNA表达水平，影响酶的活性，并可能影响个体对疾病易感性的差异，如肺癌、白血病、多发性硬化等[4-7]。
经采用PCR-RFLP方法对MPO-463处位点进行多态性分析，发现其在冠心病组与对照组之间的分布差异有统计学意义（P<0.05），提示MPO-463位基因多态性可能是冠心病的发病因素，与文献报道一致[1]。另有报道，在MPO转录起始点上游-463位点处存在G/A变异的个体有明显的心脏保护效应[1]。本文研究亦发现冠心病组的G等位基因频率为64.3％，明显高于对照组的50.0％，GG基因型者发生冠心病的危险性明显高于AA基因型者（P=0.007<0.01），若将GA和GG基因型合并计算，发现携带至少一个等位基因G者其患冠心病的风险仍明显增高（P=0.013<0.05），提示G等位基因可能为冠心病的危险因素。Asselbergs等[8] 对139例冠脉造影明确证实的CAD患者进行随访研究后发现，GG基因型是CAD患者发生心血管事件的强预测因子。
本实验研究发现,纯合AA型的比率在正常对照组为14.1% ,而Nikpoor等[1]的研究中对照组纯合AA型比率为8. 8%,London 等[4]在肺癌的研究中为9.4% , Cascorbi等[9]的研究中为4.1% ,可以看出福建汉族人AA型的比率明显偏高,提示MPO-463G/A基因多态性存在着人种差异。
综上所述，MPO-463G/A基因多态性于国内外不同种族间存有差异，本实验结果显示福建汉族人MPO-463G/A基因多态性与CHD易感性之间存在一定关系,等位基因G是可能是冠心病发生发展的危险因素,这对进一步明确冠心病的病因及预测预后奠定良好的理论基础。
参考文献
[1]Nikpoor B,Turecki G,Fournier C, et al. A functional myeloperoxidase polymorphic variant is associated with coronary artery disease in French-Canadians[J].Am Heart J.2001;142(2):336-339.
[2]李小鹰. 心血管疾病分子生物学[M].北京：人民军医出版社,2000:115-116.
[3]Piedrafita FJ, Molander RB, Vansant G,, et al. An Alu element in the myeloperoxidase promoter contains a composite SP1-thyroid hormone-retinoic acid response element [J]. J Biol Chem,1996,271(24):14412-14420.
[4]London S. J., Lehman T. A., Taylor J. A. Myeloperoxidase genetic polymorphism and lung cancer risk [J]. Cancer Res., 1997，57(22): 5001-5003.
[5]Kantarci OH, Lesnick TG, Yang P, et al. Myeloperoxidase -463 (G-->A)polymorphism associated with lower risk of lung cancer [J]. Mayo Clin Proc, 2002 ,77(1):17-22.
[6]Zakrzewska-Pniewska B, Styczynska M, Podlecka A, et al. Association of apolipoprotein E and myeloperoxidase genotypes to clinical course of familial and sporadic multiple sclerosis [J]. Mult Scler,2004, 10(3):266-271.
[7]Wanda F, Reynolds, Eric C, et al. An allelic association implicates myeloperoxidase in the etiology of acute promyelocytic leukemia[J]. Blood,1997,90(7): 2730-2737.
[8]Asselbergs FW, Reynolds WF, Cohen-Tervaert JW,et al. Myeloperoxidase polymorphism related to cardiovascular events in coronary artery disease [J].Am J Med.2004;116(6):429-430.
[9]Cascorbi I, Henning S, B rockmoller J, et al. Substantially reduced risk of cancer of aerodigestive tract in subjects with variant -463A of the myeloperoxidase gene[J].Cancer Res,2000,60(3):644-649.
基金项目：福建省自然科学基金项目资助（2006J0326，X0650036）
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
【关键词】髓过氧化物酶；冠状动脉性心脏病；基因多态性
冠心病是（CHD）由于冠状动脉粥样硬化使冠脉管腔狭窄或阻塞，或（和）冠状动脉功能性改变（痉挛）导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病，与遗传、环境等多种因素有关。目前认为，髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）通过多种机制参与动脉粥样硬化的发生发展，因此本文从基因角度对我国福建汉族人MPO-463bp处G/A基因多态性进行了分析，探讨其与CHD易感性的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集2005年11月至2006年10月在福建省立医院住院并经冠脉造影证实至少有1支冠状动脉狭窄≥50%者157例为CHD组，男125例，女32例，年龄33~87岁，平均年龄62.93±11.09岁。均为福建汉族人。对照组为福建汉族同期住院后经冠脉造影证实未发现任何可辨认斑块或狭窄者78例，男49 例，女29例，年龄20~86岁，平均年龄59.64±11.32岁，排除X综合征、周围血管病、变异型心绞痛以及有明显心肌梗死证据的个体。
1.2方法
1.2.1模板DNA制备
采集EDTA-K2抗凝静脉血2ml，采用盐析法提取外周血DNA，并用核酸蛋白分析仪对其进行定量测定。
1.2.2引物设计与合成
设计一对引物[1]，P1 ：5’-CGG TAT AGG CAC ACA ATG GTG A-3’， P2：5’-GCA ATG GTT CAA GCG ATT CTT C-3’，由TaKaRa公司合成。
1.2.3PCR反应条件反应体系包括引物0.4μM、dNTP 0.2mM、Buffer2.5μl、Taq酶0.625U、模板DNA 100ng，用无核水补足体积至25μl。PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，循环35个周期；最后72℃额外延伸10min。4℃备用。
1.2.4 扩增产物的限制性酶切用限制性内切酶Aci I消化经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物，37℃水浴16小时以上，65℃保温20min 终止反应。酶切产物采用3％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用凝胶成像系统进行成像和分析（瑞典Amersham Pharmacia公司）。
1.3统计学处理基因型频率用基因计数法统计。基因型的Hardy-Weinberg 平衡符合程度用χ2检验。冠心病组与对照组间的基因型及等位基因频率分布的比较采用χ2检验；计算比值比（odds ratio, OR）及其95％可信区间（confidence interval, CI）。以P<0.05为差异有显著性意义，应用SPSS 11.5 统计软件进行数据统计分析。
2 结果
2.1MPO基因-463G/A基因位点检测PCR扩增产物为350bp，其中含有一个固定的Aci I酶切位点，酶切后产生一个61bp的片断作为内对照。当为G等位基因时，酶切后形成三个片断，169bp、120bp和61bp；当为A等位基因时，形成两个片断，289bp和61bp（见图1）。
（M: Maker1、3：GA基因型2：GG基因型4：AA基因型）
图1酶切产物经3％琼脂糖凝胶电泳结果
2.2 MPO-463G/A多态性的基因型分布的组间比较
基因型分布符合Hardy-Wenberg 平衡，MPO-463G/A多态性在冠心病组与基因型分布和等位基因频率分布差异有统计学意义（χ2值分别为8.474和8.201，P均<0.05），见表1。
表1 冠心病组与对照组MPO –463G/A 基因型和等位
注：与对照组比较，*P均<0.05
2.3冠心病组和对照组MPO-463位基因型构成比比较具有GG基因型者发生冠心病的危险性较具有AA基因型者显著增高（χ2＝7.315, P=0.007<0.01，OR=4.070，95％CI=1.472-11.253）；杂合子GA发生冠心病的危险性较纯合子AA仍有升高趋势（χ2＝3.53, P=0.060，OR=2.750， 95％CI=0.957-7.900）；将GA和GG基因型合并计算，发现携带至少一个等位基因G者其患冠心病的风险仍显著增高（χ2＝6.20, P=0.013<0.05，OR=3.518，95％CI= 1.307-9.472），见表2。
表2 MPO基因型与冠心病遗传易感性的关系
3讨论
冠心病是一种多因素疾病，即多种因素作用于不同环节所致。随着分子生物学技术的不断发展及SNP技术在临床的应用，目前认为冠心病的发生发展可能与基因的多态性相关[2] 因此，对冠心病相关基因多态性的研究，不仅可预测疾病发生的风险度，且可为疾病的基因诊断和治疗提供理论基础。
髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）是一种新的炎症标志物，它是由中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要过氧化物酶，MPO催化过氧化氢和氯离子生成次氯酸，使LDL氧化成为ox-LDL，启动AS的发生；同时，MPO促进HDL的氧化，影响其胆固醇的逆向转运作用，参与AS的发生发展。MPO基因位于染色体17q23－24区域，由12个外显子和11个内含子组成。自1996年Piedrafita等[3]发现MPO基因转录起始点上游-463处存在G/A多态性，并证实当等位基因为G时可增强转录25倍而A等位基因仅可增强转录几倍以来。G-A变异破坏了转录因子SP1的结合位点，降低mRNA表达水平，影响酶的活性，并可能影响个体对疾病易感性的差异，如肺癌、白血病、多发性硬化等[4-7]。
经采用PCR-RFLP方法对MPO-463处位点进行多态性分析，发现其在冠心病组与对照组之间的分布差异有统计学意义（P<0.05），提示MPO-463位基因多态性可能是冠心病的发病因素，与文献报道一致[1]。另有报道，在MPO转录起始点上游-463位点处存在G/A变异的个体有明显的心脏保护效应[1]。本文研究亦发现冠心病组的G等位基因频率为64.3％，明显高于对照组的50.0％，GG基因型者发生冠心病的危险性明显高于AA基因型者（P=0.007<0.01），若将GA和GG基因型合并计算，发现携带至少一个等位基因G者其患冠心病的风险仍明显增高（P=0.013<0.05），提示G等位基因可能为冠心病的危险因素。Asselbergs等[8] 对139例冠脉造影明确证实的CAD患者进行随访研究后发现，GG基因型是CAD患者发生心血管事件的强预测因子。
本实验研究发现,纯合AA型的比率在正常对照组为14.1% ,而Nikpoor等[1]的研究中对照组纯合AA型比率为8. 8%,London 等[4]在肺癌的研究中为9.4% , Cascorbi等[9]的研究中为4.1% ,可以看出福建汉族人AA型的比率明显偏高,提示MPO-463G/A基因多态性存在着人种差异。
综上所述，MPO-463G/A基因多态性于国内外不同种族间存有差异，本实验结果显示福建汉族人MPO-463G/A基因多态性与CHD易感性之间存在一定关系,等位基因G是可能是冠心病发生发展的危险因素,这对进一步明确冠心病的病因及预测预后奠定良好的理论基础。
参考文献
[1]Nikpoor B,Turecki G,Fournier C, et al. A functional myeloperoxidase polymorphic variant is associated with coronary artery disease in French-Canadians[J].Am Heart J.2001;142(2):336-339.
[2]李小鹰. 心血管疾病分子生物学[M].北京：人民军医出版社,2000:115-116.
[3]Piedrafita FJ, Molander RB, Vansant G,, et al. An Alu element in the myeloperoxidase promoter contains a composite SP1-thyroid hormone-retinoic acid response element [J]. J Biol Chem,1996,271(24):14412-14420.
[4]London S. J., Lehman T. A., Taylor J. A. Myeloperoxidase genetic polymorphism and lung cancer risk [J]. Cancer Res., 1997，57(22): 5001-5003.
[5]Kantarci OH, Lesnick TG, Yang P, et al. Myeloperoxidase -463 (G-->A)polymorphism associated with lower risk of lung cancer [J]. Mayo Clin Proc, 2002 ,77(1):17-22.
[6]Zakrzewska-Pniewska B, Styczynska M, Podlecka A, et al. Association of apolipoprotein E and myeloperoxidase genotypes to clinical course of familial and sporadic multiple sclerosis [J]. Mult Scler,2004, 10(3):266-271.
[7]Wanda F, Reynolds, Eric C, et al. An allelic association implicates myeloperoxidase in the etiology of acute promyelocytic leukemia[J]. Blood,1997,90(7): 2730-2737.
[8]Asselbergs FW, Reynolds WF, Cohen-Tervaert JW,et al. Myeloperoxidase polymorphism related to cardiovascular events in coronary artery disease [J].Am J Med.2004;116(6):429-430.
[9]Cascorbi I, Henning S, B rockmoller J, et al. Substantially reduced risk of cancer of aerodigestive tract in subjects with variant -463A of the myeloperoxidase gene[J].Cancer Res,2000,60(3):644-649.
基金项目：福建省自然科学基金项目资助（2006J0326，X0650036）
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