论文部分内容阅读
摘要：【目的】評价氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜灵对克氏原螯虾（Procambarus clarkii）的急性毒性，分析其对克氏原螯虾的组织病理影响，为生态风险评估提供基础数据。【方法】采用静态试验法测定4种药物浸泡下克氏原螯虾的急性毒性作用，分别使用4种药物48 h半致死浓度（LC50）和96 h-LC50的10%浓度浸泡克氏原螯虾48和96 h后取样，基于石蜡切片技术比较分析4种药物对克氏原螯虾肝胰腺和肌肉组织结构的影响。【结果】4种药物浸泡下表现的中毒症状比较类似，且不同浓度组的中毒症状表现出明显的剂量和时间效应。急性毒性试验结果表明，4种化学药物对克氏原螯虾的毒性排序为氰戊菊酯>辛硫磷>硫醚沙星>甲霜灵。氰戊菊酯对克氏原螯虾24、48和96 h的LC50分别为4.375、4.252和3.865 μg/L，辛硫磷对克氏原螯虾24、48和96 h的LC50分别为161.301、87.784和81.637 μg/L，硫醚沙星对克氏原螯虾24、48和96 h的LC50分别为76.541、72.509和52.529 mg/L，甲霜灵对克氏原螯虾24、48和96 h的LC50分别为20.610、5.499和4.141 g/L。组织病理观察发现，以相对低浓度的化学药物染毒克氏原螯虾后，仍会对克氏原螯虾的组织产生损伤和破坏。染毒后的肝胰腺发现部分细胞破裂、皱缩、坏死，B细胞及其内部转运泡体积明显增大且增多，R细胞颜色加深等现象;肌肉整体呈现肌纤维断裂溶解、细胞排列不紧密、出现明显空腔等现象。【结论】氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜灵对克氏原螯虾的急性毒性具有较大差异。克氏原螯虾在4种化学药物的安全浓度下均能够存活，但会对肝胰腺和肌肉组织产生破坏。
关键词： 氰戊菊酯;辛硫磷;硫醚沙星;甲霜灵;克氏原螯虾;急性毒性;组织病理
Abstract：【Objective】In order to evaluate the acute toxicity of fenvalerate， phoxim， sulfide gatifloxacin and ridomil to Procambarus clarkii， analyze the histopathological effects on P. clarkii， and provide basic data for ecological risk assessment. 【Method】The acute toxicity effects of four drugs on P. clarkii were determined by static test method. P. clarkii were soaked in four drugs for 48 and 96 h with 10% concentration of 48 h half lethal concentration （LC50） and 10% concentration of 96 h-LC50 respectively. The changes of hepatopancreas and muscle structure of P. clarkii were compared and analyzed based on paraffin section technology. 【Result】The poisoning symptoms of the four drugs were similar， and the poisoning symptoms of different concentration groups showed obvious dose and time effects. The results of acute toxicity test showed that， toxicity ranking of four chemical drugs was fenvalerate>phoxim>sulfide gatifloxacin>ridomil. The LC50 of fenvalerate to P. clarkii was 4.375， 4.252 and 3.865 μg/L at 24， 48 and 96 h.The LC50 of phoxim to P. clarkii was 161.301， 87.784 and 81.637 μg/L. 24， 48 and 96 h-LC50 of sulfide gatifloxacin to P. clarkii was 76.541， 72.509 and 52.529 mg/L. And the LC50 of ridomil for P. clarkii at 24， 48 and 96 h respectively were 20.610， 5.499 and 4.141 g/L. Histopathological observation showed that the tissues of P. clarkii were still damaged and destroyed after being exposed to rela-tively low concentrations of chemical drugs. The results showed that part of hepatopancreas cells ruptured， shrunk and necrosis， the volume of B cells and its internal transport vesicles increased greatly， and the color of R cells deepened; the whole muscle showed the phenomenon of breaking and dissolving of muscle fibers， loose arrangement of cells and obvious cavity. 【Conclusion】The acute toxicity of fenvalerate， phoxim， sulfide gatifloxacin and ridomil to P. clarkiiis different. P. clarkii can survive at the safe concentration of four chemicals， but it damages the hepatopancreas and muscle tissue. Key words： fenvalerate; phoxim; sulfide gatifloxacin; ridomil; Procambarus clarkii; acute toxicity; histopathology
0 引言
【研究意义】克氏原螯虾（Procambarus clarkii）味道鲜美、营养丰富，价格相对较低，受到消费者的普遍欢迎，因此市场需求增加，克氏原螯虾的养殖业迅猛发展（林伟等，2020）。据统计，2019年全国克氏原螯虾养殖产量达208.96万t，养殖总面积达128.6万ha，其中稻田养殖面积为110.5万ha，占总养殖面积的85.96%（全国水产技术推广总站和中国水产学会，2020）。在克氏原螯虾带来市场价值的同时，受养殖技术水平差异、养殖户片面追求高产等因素的影响，不可避免地引起消费者对食用小龙虾农药、兽药残留等质量安全问题的担忧（何力等，2020）。在农药的施用过程中仅有1%左右作用于靶生物，其余的农药将残留于土壤或以间接途径进入水环境（丁中海等，2004;尚泰宇等，2019），当水中的毒性物质达到一定程度时，就可能对鱼、虾造成毒害和死亡等危害（于振海等，2017）。克氏原螯虾体内的污染物也可通过食物链的富集作用被人体摄取，对人类健康构成严重威胁。因此，迫切需要明确水产用药和农药对克氏原螯虾的急性毒性作用和影响，对制定科学合理的给药方案提供基础数据，保证水产品的质量安全。【前人研究进展】包括氰戊菊酯在内的拟除虫菊酯类农药作为一类高效、广谱的杀虫剂，已经广泛应用于农业灭害和水产养殖中（徐春娟等，2018）。拟除虫菊酯类对鸟类和哺乳动物的毒性相对较低，但对水生甲壳类动物和鱼类等生物的毒性较高（Jaroslava et al.，2019）。除此之外，杜洁（2016）发现氰戊菊酯的暴露会引起斑马鱼产生发育毒性现象，且对体内氧化代谢相关的核受体基因表达具有干扰效应。辛硫磷属于广谱性有机磷杀虫剂，对水产寄生虫具有触杀作用，能够通过破坏菌毒组织结构等方式来阻止病原体RNA或DNA的合成（徐杭忠等，2020）。辛硫磷在内的有机磷农药主要抑制脑突触体膜腺苷三磷酸酶，从而使突触体膜乙酰胆碱酯酶（AChE）等神经递质得以累积，阻断神经传导，导致神经传导功能紊乱（汪鹏鹏，2017）。硫醚沙星是一种水产养殖用的杀菌剂，对水霉病有良好的治疗作用，同时对鳗弧菌（V.anguillarum）、嗜水气单胞菌（A.hydrophila）和迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）等细菌具有抑制和灭杀效果（刘国兴等，2019）。甲霜灵属酰胺类内吸性杀菌剂，主要用于茎叶、种子和土壤处理，防治霜霉菌、疫霉菌及腐霉菌引起的病害（江泽军等，2015）。由于甲霜灵对于防治鱼类水霉病具有良好的效果且对靶动物安全，常被用作一种替代孔雀石绿的新型渔用药物以治疗水产动物的水霉病（孙晶等，2020），但同时也有研究认为甲霜灵对人体健康具有潜在风险（Lidova et al.，2013）。【本研究切入点】氰戊菊酯和辛硫磷属于高效杀虫剂，硫醚沙星和甲霜灵属于水产动物杀菌剂，在稻虾综合种养环境中使用较广泛，但对克氏原螯虾的安全性数据尚属空白。【拟解决的关键问题】利用静态试验法测试4种药物对克氏原螯虾的急性毒性作用，研究在急性暴露条件下克氏原螯虾肝胰腺和肌肉的病变情况，为评价环境生态风险提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
克氏原螯虾（P. clarkii）取自江苏省淡水水产研究所扬中基地，平均体长79.46±1.56 mm，平均体重23.63±1.53 g。先在200 L的聚乙烯水箱中暂养一周，每天定时定量投喂饲料，每24 h换水1/2水箱。试验在上部外径1090×800 mm、下部外径960×690 mm、高280 mm的聚乙烯塑料箱中进行。试验用水为充分曝气72 h以上的自来水，水温（18.31±0.44）℃，pH 7.87±0.04，溶解氧（OD）为7.09±1.07 mg/L。正式试验前24 h停止投喂，且整个试验期间不投喂饲料，全程自然光照。选取附肢齐全、体质健壮和规格统一的个体作为试验用虾。
主要试验药品与试剂：氰戊菊酯（Fenvalerate）（浙江威尔达化工有限公司生产），有效成分含量20%，产品标准号GB/T 6695—1998;辛硫磷（Phoxim）（山东埃森化学有限公司生产），有效成分含量40%，产品标准号GB 9557—2008;硫醚沙星（Sulfide gatifloxacin）（北京渔经生物技术有限责任公司生产），有效成分含量80%，执行标准号为Q/TXY JS091;甲霜灵（Ridomil）（浙江禾本科技股份有限公司生产），有效成分含量≥98%。氰戊菊酯和辛硫磷先配成母液，再稀释成不同浓度，现用现配。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 急性毒性试验 参考GB/T 31270.21—2014《化学农药环境安全评价试验准则 第21部分：大型甲壳类生物毒性试验》中关于大型甲壳类生物的静态试验法，并根据4种药物对其他物种的LC50和预实验的浓度范围，氰戊菊酯组选择0.1、0.3、0.9、2.7和8.1 μg/L的用药浓度;辛硫磷组选择2、6、18、54和162 μg/L的用药浓度;硫醚沙星组选择10、20、40、80和160 mg/L的用药浓度;甲霜灵组选择0.5、1、2、4和8 g/L的用药浓度。每个浓度组设3个平行组，另设空白对照组，每组加水30 L，放虾15尾。连续观察克氏原螯虾的活动情况和中毒症状，及时捞出死亡个体并记录24、48和96 h的死亡情况。
1. 2. 2 组织病理观察 根据急性毒性试验得到的结果，分别选择4种药物对应的48 h-LC50值的10%浓度对克氏原螯虾浸泡48 h，同时选择4种药物对应的96 h-LC50的10%濃度对克氏原螯虾浸泡96 h，并设置对照组，每组加水30 L，放虾15尾。观察并记录试验期间虾是否存在中毒和死亡现象，从试验组和对照组每组随机取出3只克氏原螯虾，解剖取出肝胰腺和肌肉，经Bouin’s液固定24 h后，放入75%乙醇中保存备用。固定后的组织经乙醇脱水、石蜡包埋、切片、苏木精—伊红染色和中性树胶封片后，在显微镜（Olympus BX51）下观察拍照。 1. 3 统计分析
利用Excel 2010和SPSS 21.0对试验结果进行数理统计分析。采用直线内插法计算4种供试药物对克氏原螯虾的回归方程（药物浓度为横坐标，死亡率为纵坐标）、回归方程相关系数（R）以及24、48和96 h的半致死浓度（LC50）及其95%置信限，安全浓度（SC）=96 h-LC50×0.1。
2 结果与分析
2. 1 克氏原螯虾的中毒症状
试验期间，空白对照组均未发现中毒或死亡个体。所有虾的活力好、行为正常、反应灵敏，能正常蜕壳，且出现交配行为。使用玻璃棒接近时两螯迅速张开防御，或立即跳开躲避。4种药物浸泡下表现的中毒症状比较类似，且不同浓度组的中毒症状表现出明显的剂量和时间效应。中毒初期均表现为行动迟缓、反应迟钝、机体无力，蜕壳虾数量明显减少，用玻璃棒接近时未见及时逃开躲避。随着中毒时间的延长和药物浓度的加大，克氏原螯虾出现仰卧和侧卧现象，其附肢能节律性摆动但身体不能移动，此阶段没有虾发生蜕壳现象。最终的死亡个体多表现为弓背或身体僵直，以侧卧和仰卧死亡为主。4种药物对应的48 h-LC50值和96 h-LC50值的10%浓度分别浸泡克氏原螯虾48和96 h后，均未出现死亡个体，仅部分虾表现为行动迟缓和反应迟钝。
2. 2 4种药物对克氏原螯虾的急性毒性效应
4种药物对克氏原螯虾的急性毒性试验结果见表1。随着4种药物染毒时间的推移，测算得到24、48和96 h的LC50越来越低，药物对克氏原螯虾的毒性越来越大。由表1可知，氰戊菊酯24、48和96 h的LC50分别为4.375、4.252和3.865 μg/L，SC为0.3865 μg/L;辛硫磷24、48和96 h的LC50分别为161.301、87.784和81.637 μg/L，SC为8.1637 μg/L;硫醚沙星24、48和96 h的LC50分别为76.541、72.509和52.529 mg/L，SC为5.2529 mg/L;甲霜灵24、48和96 h的LC50分别为20.610、5.499和4.141 g/L，SC为0.4141 g/L。其中由于辛硫磷162 μg/L浸泡24 h组和甲霜灵8 g/L浸泡24 h组的死亡率未达100%，所以辛硫磷和甲霜灵的24 h的LC50值相较其对应48和96 h的LC50相差较大。
依据GB/T 31270.21—2014《化学农药环境安全评价试验准则》对药物的毒性等级进行划分。由于氰戊菊酯和辛硫磷的96 h-LC50≤0.1 mg a.i./L，因此二者对克氏原螯虾的急性毒性为剧毒，硫醚沙星和甲霜灵的96 h-LC50>10 mg a.i./L，故为低毒。综合对比4种化学药物的LC50，4种药物的毒性排序为氰戊菊酯>辛硫磷>硫醚沙星>甲霜灵。
2. 3 4种化学药物暴露条件下克氏原螯虾的组织病理观察
根据病理切片得到的图片仅挑选部分典型且需要说明的部分，未阐述的部分不具有代表性，因此不进行说明。
2. 3. 1 肝胰腺 健康的克氏原螯虾肝胰腺结构由无数肝小管组成，结构正常，分布均匀。肝小管基膜完整，上皮细胞排列紧密，管腔呈星型（图1-1）。氰戊菊酯染毒48 h后的肝小管出现严重损伤。在切片边缘位置（即肝胰腺表面），发现肝小管管腔呈现明显皱缩现象;包括B细胞在内的细胞出现破裂和空泡化现象，在切片中心位置（肝胰腺内部）未发现该现象（图1-2）。与染毒48 h相比，氰戊菊酯染毒96 h除上述症状外还发现由于管腔挤压导致的肝小管严重变形和细胞坏死的现象（图1-3）。由图1-4～图1-8可知，辛硫磷组、硫醚沙星组和甲霜灵组均在切片边缘位置（肝胰腺表面），发现B细胞及其内部转运泡体积明显增大且增多，且数量最多的组别是硫醚沙星组，其次为辛硫磷组，最少为甲霜灵组，而在切片中心位置（肝胰腺内部）未发现该现象。氰戊菊酯染毒48 h后的肝小管出现严重损伤。在切片边缘位置（即肝胰腺表面），发现肝小管管腔呈现明显皱缩现象;包括B细胞在内的细胞出现破裂和空泡化现象，在切片中心位置（肝胰腺内部）未发现该现象（图1-2）。与染毒48 h相比，氰戊菊酯染毒96 h除上述症状外还发现由于管腔挤压导致的肝小管严重变形和细胞坏死的现象（图1-3）。与对照组相比，辛硫磷组染毒48 h后肝小管的部分R细胞颜色加深，同时出现呈深褐色的液泡。试验虾在甲霜灵中浸泡48 h后，肝小管管腔呈现大量褶皱，且管腔的单层柱状细胞呈现增生趋势，肝小管内出现大量褐色颗粒和部分棕色的R细胞（图1-7）。
2. 3. 2 肌肉 由图2-1可知，健康克氏原螯虾肌纤维排列紧密有序，细胞核呈椭圆形，散布在肌纤维之间。氰戊菊酯组染毒48 h后，克氏原螯虾肌肉出现严重损伤，主要表现为肌肉呈明显的波浪化纹理且部分肌纤维断裂溶解，最终导致出现明显的空腔（图2-2）。辛硫磷染毒96 h后，损伤的肌肉主要表现为细胞排列松散且不规则，肌纤维出现断裂溶解，最终导致明显的空腔（图2-3）。硫醚沙星染毒96 h后，克氏原螯虾肌肉呈现较轻微损伤，主要表现为细胞排列松散不紧密，肌纤维之间出现不同程度的间隙（图2-4）。甲霜灵染毒48 h后，染毒虾的肌肉损伤较轻微，肌纤维之间出现不同程度的间隙（图2-5）;甲霜灵染毒96 h组的肌肉损伤比甲霜灵染毒48 h组更严重，主要表现为部分肌纤维失去固有形态，出现波浪化纹理（图2-6）。
3 讨论
克氏原螯虾分布较广，且饲养管理简便，有望作为环境毒理和药物毒性攻击水生甲壳动物的模型生物（刘青，2012）。化学药物对克氏原螯虾的急性毒性试验数据不仅对阐明药物的毒性作用具有重要意义，该数据也是进行药物安全评价的重要手段（丁正峰等，2012）。氰戊菊酯对不同水产动物的急性毒性差异较明显。周冬仁等（2018）报道，氰戊菊酯对凡纳滨对虾的48 h-LC50为0.123 μg/L;蒋金花等（2015）研究发现氰戊菊酯对斑马鱼幼鱼的96 h-LC50为0.0183 mg/L;本研究中，氰戊菊酯在克氏原螯虾上同样表现出很高的毒性，氰戊菊酯24、48和96 h的LC50分别为4.375、4.252和3.865 μg/L，SC为0.3865 μg/L。本研究结果发现，辛硫磷24、48和96 h的LC50分别为161.301、87.784和81.637 μg/L，SC为8.1637 μg/L;与汪鹏鹏（2017）对斑马鱼的毒性试验结果（96 h、LC50为6.482 mg/L）差异较明显，说明克氏原螯虾对辛硫磷的耐受能力比斑马鱼低。本研究结果证实，硫醚沙星24、48和96 h的LC50分别为76.541、72.509和52.529 mg/L，SC为5.2529 mg/L。秦志清等（2016）报道，硫醚沙星对异育银鲫中科3号幼鱼的48 h-LC50为18.54 mg/L;周桂娴等（2020）报道，硫醚沙星对凡纳滨对虾的48 h-LC50为0.112 mg/L;与之相比，克氏原螯虾对硫醚沙星的忍耐力比同对虾目的凡纳濱对虾强。甲霜灵具有广谱高效的杀菌效果，也可用来防治水产动物由水霉菌引起的疾病（李浩然等，2015）。本研究中，甲霜灵24、48和96 h的LC50分别为20.610、5.499和4.141 g/L，SC为0.4141 g/L。在实际生产中治疗水霉病大多使用甲霜灵复方制剂，其复方制剂对草鱼水花、鲢鱼水花和鲫鱼鱼苗的96 h-LD50为245 mg/L（苏惠冰等，2017），说明甲霜灵在实际生产中不会使用特别大的剂量，且其毒性弱，不会对养殖生物造成危害。 刘晓晓（2018）选用约为96 h-LC50的10%马度米星铵浸泡克氏原螯虾进行亚慢性染毒研究和组织切片观察;本研究选择10%的48 h-LC50和96 h-LC50的药物浓度作为低浓度试验浓度对克氏原螯虾进行染毒和组织切片观察。肝胰腺是甲壳动物的重要器官，主要发挥消化、吸收、储存和排泄等功能（孟愔等，2019）。同时，肝胰腺还是非常重要的药物代谢器官，刘晓晓（2018）发现马度米星铵可诱导克氏原螯虾肝胰腺药物代谢酶的表达，说明一些药物会对肝胰腺产生一定影响。本研究中辛硫磷、硫醚沙星和甲霜灵处理组均导致肝胰腺外围肝小管中B细胞及其内部转运泡数量增多和体积增大，该结果与陶易凡等（2016）的研究结论类似。B细胞发挥分泌消化酶类及胞内消化的作用（赵卫红等，2014）。B细胞及其内部转运泡的变化促进了B细胞分泌的消化酶的转运和代谢吸收，从而为环境胁迫下克氏原螯虾提供更多的营养物质和能量以维持正常生理代谢。而R细胞具有吸收、分解代谢和储存营养物质、分解重金属等功能（陈忱，2015）。本研究中辛硫磷组R细胞颜色加深和出现的褐色液泡可能与营养代谢产物有关（陶易凡等，2016），但仍有待进一步确认。虾的肌肉作为主要食用部分，其水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分等常规营养成分含量是评价肌肉品质的重要指标（万金娟等，2020）。本研究结果表明，染毒虾的肌肉组织主要以断裂和溶解为主，不仅影响虾肉的口感，还可能引起肌肉绵软无力、功能紊乱，进而导致其应激死亡。
本研究中，各组仅以10%的LC50染毒处理即会对克氏原螯虾肝胰腺和肌肉组织产生破坏，且组织破坏程度排序和化学药物毒性排序同为氰戊菊酯>辛硫磷>硫醚沙星>甲霜灵。
4 结论
氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜灵对克氏原螯虾的急性毒性具有较大差异。克氏原螯虾在4种化学药物的安全浓度下均能够存活，但会对肝胰腺和肌肉组织产生破坏。
参考文献：
陈忱. 2015. 克氏原螯虾幼虾消化系统发育及饥饿复投喂对其的影响[D]. 武汉：华中农业大学.doi：10.7666/d.Y2803905. [Chen C. 2015. Studies on the ontogeny of digesitive system and the effect of starvation and refeeding on digestive system of juvenile red swamp crayfish（procambarus clarkii）[D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University.]
丁正峰，薛晖，王晓丰，唐建清. 2012. 毒死蜱（CPF）对克氏原螯虾的急性毒性及组织病理观察[J]. 生态与农村环境学报，28（4）：462-467. doi：10.3969/j.issn.1673-4831. 2012. 04.023. [Ding Z F，Xue H，Wang X F，Tang J Q. 2012.Acute toxicity of chlorpyrifos（CPF） to crayfish（Procambarus clarkii）and the histopathological observation[J].Journal of Ecology and Rural Environment，28（4）：462-467.]
丁中海，杨怡，金洪钧，单正军，于红霞，冯建舫，张晓峰，周家艳. 2004. 三种农药对斑马鱼的急性毒性和生物浓缩系数[J]. 应用生态学报，（5）：888-890. [Ding Z H，Yang Y，Jin H J， Shan Z J，Yu H X，Feng J F，Zhang X F，Zhou J Y. 2004. Acute toxicity and bio-concentration factor of three pesticides on Brachydanio rerio[J]. Chinese Journal of Applied Ecology，（5）：888-890.]
杜洁. 2016. 拟除虫菊酯对斑马鱼内分泌平衡及氧化代谢的扰动效应[D]. 杭州：浙江工业大学. [Du J. 2016. Disturbance effect of pyrethroids on endocrine and oxidative metabolism in zebrafish（Daniorerio）[D]. Hangzhou：Zhejiang University of Technology.]
何力，喻亚丽，甘金华，董立学，彭婕，陈建武，韩刚. 2020. 克氏原螯虾质量安全风险研究与分析[J]. 中國渔业质量与标准，10（1）：1-12. doi：10.3969/j.issn.2095-1833.2020. 01.001. [He L，Yu Y L，Gan J H，Dong L X，Peng J，Chen J W，Han G. 2020. Study and analysis on quality and safety risk of crayfish[J]. Chinese Fishery Quality and Standards，10（1）：1-12.]
蒋金花，陈江滨，吴声敢，俞瑞鲜，王彦华，苍涛，蔡磊明，赵学平. 2015. 氰戊菊酯对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生命阶段的毒性效应[J]. 生态毒理学报，10（6）：269-275.doi：10. 7524/AJE.1673-5897.20150210001. [Jiang J H，Chen J B，Wu S G，Yu R X，Wang Y H，Cang T，Cai L M，Zhao X P. 2015. Toxicity effects of fenvalerate to different life stages of zebrafish（Danio rerio） and Chinese rare minnow（Gobiocypris rarus）[J]. Asian Journal of Ecotoxico-logy，10（6）：269-275.] 江泽军，张鹏，李永飞，杜鹏飞，陈鸽，金茂俊，王静. 2015. 分散固相萃取—高效液相色谱—串联质谱法测定水稻和土壤中的福美双与甲霜灵残留[J]. 农药学学报，17（3）：313-320. doi：10.3969/j.issn.1008-7303.2015.03.10. [Jiang Z J，Zhang P，Li Y F，Du P F，Chen G，Jin M J，Wang J. 2015. Simultaneous determination of thiram and metalaxyl residues in rice and soil by dispersive solid phase extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Pesticide Scien-ce，17（3）：313-320.]
李浩然，欧仁建，邱军强，郭微微，杨先乐，胡鲲. 2015. 立达霉对七彩神仙鱼卵水霉病的防治效果[J]. 南方农业学报，46（4）：697-701. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2015.4.697. [Li H R，Ou R J，Qiu J Q，Guo W W，Yang X L，Hu K. 2015. Control effect of Ridomil on saprolegniasis infec-ted Discus fish（Symphysodon aequifasciatus） zygotes[J].Journal of Southern Agriculture，46（4）：697-701.]
林伟，刘开放，赵良杰. 2020. 稻太郎和稻黄金对克氏原螯虾急性毒性及安全性评价[J]. 水产学杂志，33（2）：66-69. [Lin W， Liu K F， Zhao L J. 2020. Safety evaluation and acute toxicity of herbicides Daotailang and Daohuangjin to juvenile red swamp crayfish Procambarus clarkii[J]. Chinese Journal of Fisheries， 33（2）：66-69.]
刘国兴，郑友，李春宁，彭刚，郝忱，丁淑燕，史杨白. 2019. 4种水产药物对河川沙塘鳢幼鱼的急性毒性试验[J]. 安徽农业科学，47（23）：103-106. doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.030. [Liu G X，Zheng Y，Li C N，Peng G，Hao C，Ding S Y，Shi Y B. 2019. Acute toxicity of four aquacultural drugs to juvenile dark sleeper（Odontobutis potamophila）[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，47（23）：103-106.]
刘青. 2012. 两种渔药对克氏原螯虾的急性毒性研究[J]. 水产科技情报，39（4）： 198-200. doi：10.3969/j.issn.1001-1994. 2012.04.009. [Liu Q. 2012. Acute toxicity of two kinds of fishery drugs to Procambarus clarkii[J]. Fishe-ries Science & Technology Information，39（4）：198-200.]
刘晓晓. 2018. 马度米星铵对克氏原螯虾的毒性研究[D]. 南京：南京农业大学.doi：10.27244/d.cnki.gnjnu.2018. 000518. [Liu X X. 2018. Research of toxic effects of ma-duramicin ammonium on the freshwater crayfish， Procambarus clarkia[D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University.]
孟愔，胡骞，金玉立，吕慧源，顾泽茂. 2019. 复方中草藥制剂对克氏原螯虾生长、免疫功能及肝胰腺组织的影响[J].中国饲料，（21）：60-65.doi：10.15906/j.cnki.cn11-2975/s. 20192113. [Meng Y，Hu Q，Jin Y L，Lü H Y，Gu Z M. 2019. Effects of compound Chinese herbal medicine on growth， immunity and hepatopancreas of crayfish Procambarus clarkii[J]. China Feed，（21）：60-65.]
秦志清，樊海平，薛凌展，邓志武，张焱. 2016. 常用渔药对异育银鲫“中科3号”幼鱼的急性毒性试验[J]. 科学养鱼，（10）：55-56. doi：10.14184/j.cnki.issn1004-843x.2016.10. 030. [Qin Z Q，Fan H P，Xue L Z，Deng Z W，Zhang Y. 2016. Acute toxicity test of common fishery drugs on juvenile of Allogynogenetic crucian carp “Zhongke No.3”[J]. Scientific Fish Farming，（10）：55-56.] 全国水产技术推广总站，中国水产学会. 2020. 2020中国小龙虾产业发展报告全文发布[EB/OL]. 2020-06-22. http：//www.nftec.agri.cn/zzxhdt/202006/t20200622_7433378.htm. [Na-tional Fisheries Technology Extension Center，China Socie-ty ofFisheries. 2020. Report on the development of Chinese crayfish industry in 2020[EB/OL]. 2020-06-22. http：//www.nftec.agri.cn/zzxhdt/202006/t20200622_7433378.htm.]
尚泰宇，時春雨，秦朝辉，彭梦圆，贾博爽，夏晓华. 2019. 氰氟草酯对泥鳅的毒性效应[J]. 河南农业科学，48（9）：162-167. [Shang T Y，Shi C Y，Qin Z H，Peng M Y，Jia B S，Xia X H. 2019. Toxic effects of cyhalofop-butyl to Misgurnus anguillicaudatus[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 48（9）： 162-167.]
苏惠冰，尹清干，杨先乐，胡鲲. 2017. 利用复方甲霜灵粉防治鱼苗孵化过程中的水霉病[J]. 科学养鱼，（9）：69. doi：10.14184/j.cnki.issn1004-843x.2017.09.038. [Su H B，Yin Q G，Yang X L，Hu K. 2017. Using compound meta-laxyl powder to prevent and control water mold in the process of fish hatching[J]. Scientific Fish Farming，（9）：69.]
孙晶，邱军强，陈天楠，王雅丽，郑瑞州，胡鲲. 2020. 基于单克隆抗体的胶体金试纸条检测水产品中甲霜灵的残留[J/OL]. 上海海洋大学学报. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/31.2024.S.20200720.1559.002. [Sun J，Qiu J Q，Chen T N，Wang Y L，Zheng R Z，Hu K. 2020. Detection of meta-laxyl residues in aquatic product based on monoclonal antibody-based colloidal gold tests trips[J/OL]. Journal of Shanghai Ocean University. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/31.2024.S.20200720.1559.002.html.]
陶易凡，强俊，王辉，徐跑，马昕羽，赵文强. 2016. 低pH胁迫对克氏原螯虾鳃和肝胰腺酶活力及组织结构的影响[J].中国水产科学，23（6）：1279-1289.doi：10.3724/SP.J. 1118.2016.16056. [Tao Y F，Qiang J，Wang H，Xu P，Ma X Y，Zhao W Q. 2016. Acute toxicity of low-pH stress and its effect on enzyme activity and histological structure of gill and hepatopancreas in Procambarus clarkii[J].Journal of Fishery Sciences of China，23（6）：1279-1289.]
万金娟，陈友明，邵俊杰，唐建清，沈美芳，孙梦玲，张美琴，孙敏. 2020. 盱眙地区不同养殖模式下克氏原螯虾肌肉品质的比较分析[J]. 动物营养学报，32（2）：965-972. doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2020.02.053. [Wan J J，Chen Y M，Shao J J，Tang J Q，Shen M F，Sun M L，Zhang M Q，Sun M. 2020. Comparative analysis on muscle quality of red swamp crayfish（Procambarus clarkia） cultured under different aquaculture modes in Xuyi region[J].Chinese Journal of Animal Nutrition，32（2）：965-972.]
汪鹏鹏. 2017. 有机磷和有机氯农药对斑马鱼的毒性效应研究[D]. 兰州：西北师范大学. [Wang P P. 2017. Toxic effect of organophosphorus and organochlorine pesticides on zebrafish（Brachydanio rerio）[D]. Lanzhou：Northwest Normal University.]
徐春娟，刘永涛，苏志俊，余琳雪，丁浩，艾晓辉. 2018. 气相色谱法测定淡水养殖环境中的4种拟除虫菊酯类农药残留[J]. 分析科学学报，34（3）：332-336. doi：10.13526/j.issn. 1006-6144.2018.03.007. [Xu C J，Liu Y T，Su Z J，Yu L X，Ding H，Ai X H. 2018. Determination of four pyrethroid residues in fresh aquacultural environment by gas chromatography[J]. Journal of Analytical Science，34（3）：332-336.] 徐杭忠，刘琴琴，唐毅. 2020. 4种水产药物对长吻鮠稚鱼的急性毒性试验[J]. 水产科技情报，47（1）：10-13. doi：10. 16446/j.cnki.1001-1994.2020.01.003. [Xu H Z，Liu Q Q，Tang Y. 2020. Acute toxicity test of four aquatic drugs on endangered juvenile of Leiocassis longirostris[J]. Fishe-ries Science & Technology Information，47（1）：10-13.]
于振海，朱永安，郑玉珍，朱树人，王志忠，孟庆磊. 2017. 氯虫苯甲酰胺对克氏原螯虾的急性毒性试验[J]. 水产科技情报，44（5）：286-288. doi：10.16446/j.cnki.1001-1994. 2017.05.013. [Yu Z H，Zhu Y A，Zheng Y Z，Zhu S R，Wang Z Z，Meng Q L.2017. Acute toxicity of chlorantraniliprole to Procambarus clarkii[J]. Fisheries Science & Technology Information，44（5）：286-288.]
赵卫红，王资生，张余霞，於叶兵，吕富，吕林兰，陈立侨. 2014. 雌二醇对日本沼虾肝胰腺的脂肪酸含量及组织结构的影响[J]. 海洋渔业，36（6）：542-548. doi：10.13233/j.cnki.mar.fish.2014.06.010. [Zhao W H，Wang Z S，Zhang Y X，Yu Y B，Lü F，Lü L L，Chen L Q. 2014. Effects of estradiol on fatty acid composition and tissue structure of hepatopancreas in Macrobrachium nipponense[J]. Marine Fisheries，36（6）：542-548.]
周冬仁，盛鹏程，孙博弈，施沁旋，吴琦芳，徐磊，罗毅志，王俊，叶雪平. 2018. 氰戊菊酯與溴氰菊酯对凡纳对虾的急性毒性[J]. 贵州农业科学，46（7）：103-105. doi：10.3969/j.issn.1001-3601.2018.07.026. [Zhou D R，Sheng P C，Sun B Y，Shi Q X，Wu Q F，Xu L，Luo Y Z，Wang J，Ye X P. 2018. Acute toxicity of fenvalerate and deltamethrin to Penaeus vannamei[J]. Guizhou Agricultural Sciences，46（7）：103-105.]
周桂娴，陈天娇，胡鲲. 2020. 4种化学投入品对凡纳滨对虾的急性毒性[J]. 水产养殖，41（1）：34-37. doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2020.01.007. [Zhou G X，Chen T J，Hu K. 2020. Acute toxicity test of four chemicals to P. vannamei[J]. Journal of Aquaculture，41（1）：34-37.]
Jaroslava L，Milos B，Antonin K，Josef V. 2019. Acute toxicity of two pyrethroid insecticides for fivenon-indigenous crayfish species in Europe[J].Veterinární Medicína，64（3）：125-133. doi：10.17221/136/2018-VETMED.
Lidova J， Bu?i? M， Kouba A， Velisek J，Li Y B，Dong F S，Liu X G，Xu J，Chen X，Han Y T，Cheng Y P，Jian Q，Zheng Y Q. 2013. Enantioselective separation and transformation of metalaxyl and its major metabolite metala-xyl acid in tomato and cucumber[J]. Food Chemistry，141（1）：10-17. doi：10.1016/j.foodchem.2013.02.126.
（责任编辑 邓慧灵）
关键词： 氰戊菊酯;辛硫磷;硫醚沙星;甲霜灵;克氏原螯虾;急性毒性;组织病理
Abstract：【Objective】In order to evaluate the acute toxicity of fenvalerate， phoxim， sulfide gatifloxacin and ridomil to Procambarus clarkii， analyze the histopathological effects on P. clarkii， and provide basic data for ecological risk assessment. 【Method】The acute toxicity effects of four drugs on P. clarkii were determined by static test method. P. clarkii were soaked in four drugs for 48 and 96 h with 10% concentration of 48 h half lethal concentration （LC50） and 10% concentration of 96 h-LC50 respectively. The changes of hepatopancreas and muscle structure of P. clarkii were compared and analyzed based on paraffin section technology. 【Result】The poisoning symptoms of the four drugs were similar， and the poisoning symptoms of different concentration groups showed obvious dose and time effects. The results of acute toxicity test showed that， toxicity ranking of four chemical drugs was fenvalerate>phoxim>sulfide gatifloxacin>ridomil. The LC50 of fenvalerate to P. clarkii was 4.375， 4.252 and 3.865 μg/L at 24， 48 and 96 h.The LC50 of phoxim to P. clarkii was 161.301， 87.784 and 81.637 μg/L. 24， 48 and 96 h-LC50 of sulfide gatifloxacin to P. clarkii was 76.541， 72.509 and 52.529 mg/L. And the LC50 of ridomil for P. clarkii at 24， 48 and 96 h respectively were 20.610， 5.499 and 4.141 g/L. Histopathological observation showed that the tissues of P. clarkii were still damaged and destroyed after being exposed to rela-tively low concentrations of chemical drugs. The results showed that part of hepatopancreas cells ruptured， shrunk and necrosis， the volume of B cells and its internal transport vesicles increased greatly， and the color of R cells deepened; the whole muscle showed the phenomenon of breaking and dissolving of muscle fibers， loose arrangement of cells and obvious cavity. 【Conclusion】The acute toxicity of fenvalerate， phoxim， sulfide gatifloxacin and ridomil to P. clarkiiis different. P. clarkii can survive at the safe concentration of four chemicals， but it damages the hepatopancreas and muscle tissue. Key words： fenvalerate; phoxim; sulfide gatifloxacin; ridomil; Procambarus clarkii; acute toxicity; histopathology
0 引言
【研究意义】克氏原螯虾（Procambarus clarkii）味道鲜美、营养丰富，价格相对较低，受到消费者的普遍欢迎，因此市场需求增加，克氏原螯虾的养殖业迅猛发展（林伟等，2020）。据统计，2019年全国克氏原螯虾养殖产量达208.96万t，养殖总面积达128.6万ha，其中稻田养殖面积为110.5万ha，占总养殖面积的85.96%（全国水产技术推广总站和中国水产学会，2020）。在克氏原螯虾带来市场价值的同时，受养殖技术水平差异、养殖户片面追求高产等因素的影响，不可避免地引起消费者对食用小龙虾农药、兽药残留等质量安全问题的担忧（何力等，2020）。在农药的施用过程中仅有1%左右作用于靶生物，其余的农药将残留于土壤或以间接途径进入水环境（丁中海等，2004;尚泰宇等，2019），当水中的毒性物质达到一定程度时，就可能对鱼、虾造成毒害和死亡等危害（于振海等，2017）。克氏原螯虾体内的污染物也可通过食物链的富集作用被人体摄取，对人类健康构成严重威胁。因此，迫切需要明确水产用药和农药对克氏原螯虾的急性毒性作用和影响，对制定科学合理的给药方案提供基础数据，保证水产品的质量安全。【前人研究进展】包括氰戊菊酯在内的拟除虫菊酯类农药作为一类高效、广谱的杀虫剂，已经广泛应用于农业灭害和水产养殖中（徐春娟等，2018）。拟除虫菊酯类对鸟类和哺乳动物的毒性相对较低，但对水生甲壳类动物和鱼类等生物的毒性较高（Jaroslava et al.，2019）。除此之外，杜洁（2016）发现氰戊菊酯的暴露会引起斑马鱼产生发育毒性现象，且对体内氧化代谢相关的核受体基因表达具有干扰效应。辛硫磷属于广谱性有机磷杀虫剂，对水产寄生虫具有触杀作用，能够通过破坏菌毒组织结构等方式来阻止病原体RNA或DNA的合成（徐杭忠等，2020）。辛硫磷在内的有机磷农药主要抑制脑突触体膜腺苷三磷酸酶，从而使突触体膜乙酰胆碱酯酶（AChE）等神经递质得以累积，阻断神经传导，导致神经传导功能紊乱（汪鹏鹏，2017）。硫醚沙星是一种水产养殖用的杀菌剂，对水霉病有良好的治疗作用，同时对鳗弧菌（V.anguillarum）、嗜水气单胞菌（A.hydrophila）和迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）等细菌具有抑制和灭杀效果（刘国兴等，2019）。甲霜灵属酰胺类内吸性杀菌剂，主要用于茎叶、种子和土壤处理，防治霜霉菌、疫霉菌及腐霉菌引起的病害（江泽军等，2015）。由于甲霜灵对于防治鱼类水霉病具有良好的效果且对靶动物安全，常被用作一种替代孔雀石绿的新型渔用药物以治疗水产动物的水霉病（孙晶等，2020），但同时也有研究认为甲霜灵对人体健康具有潜在风险（Lidova et al.，2013）。【本研究切入点】氰戊菊酯和辛硫磷属于高效杀虫剂，硫醚沙星和甲霜灵属于水产动物杀菌剂，在稻虾综合种养环境中使用较广泛，但对克氏原螯虾的安全性数据尚属空白。【拟解决的关键问题】利用静态试验法测试4种药物对克氏原螯虾的急性毒性作用，研究在急性暴露条件下克氏原螯虾肝胰腺和肌肉的病变情况，为评价环境生态风险提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
克氏原螯虾（P. clarkii）取自江苏省淡水水产研究所扬中基地，平均体长79.46±1.56 mm，平均体重23.63±1.53 g。先在200 L的聚乙烯水箱中暂养一周，每天定时定量投喂饲料，每24 h换水1/2水箱。试验在上部外径1090×800 mm、下部外径960×690 mm、高280 mm的聚乙烯塑料箱中进行。试验用水为充分曝气72 h以上的自来水，水温（18.31±0.44）℃，pH 7.87±0.04，溶解氧（OD）为7.09±1.07 mg/L。正式试验前24 h停止投喂，且整个试验期间不投喂饲料，全程自然光照。选取附肢齐全、体质健壮和规格统一的个体作为试验用虾。
主要试验药品与试剂：氰戊菊酯（Fenvalerate）（浙江威尔达化工有限公司生产），有效成分含量20%，产品标准号GB/T 6695—1998;辛硫磷（Phoxim）（山东埃森化学有限公司生产），有效成分含量40%，产品标准号GB 9557—2008;硫醚沙星（Sulfide gatifloxacin）（北京渔经生物技术有限责任公司生产），有效成分含量80%，执行标准号为Q/TXY JS091;甲霜灵（Ridomil）（浙江禾本科技股份有限公司生产），有效成分含量≥98%。氰戊菊酯和辛硫磷先配成母液，再稀释成不同浓度，现用现配。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 急性毒性试验 参考GB/T 31270.21—2014《化学农药环境安全评价试验准则 第21部分：大型甲壳类生物毒性试验》中关于大型甲壳类生物的静态试验法，并根据4种药物对其他物种的LC50和预实验的浓度范围，氰戊菊酯组选择0.1、0.3、0.9、2.7和8.1 μg/L的用药浓度;辛硫磷组选择2、6、18、54和162 μg/L的用药浓度;硫醚沙星组选择10、20、40、80和160 mg/L的用药浓度;甲霜灵组选择0.5、1、2、4和8 g/L的用药浓度。每个浓度组设3个平行组，另设空白对照组，每组加水30 L，放虾15尾。连续观察克氏原螯虾的活动情况和中毒症状，及时捞出死亡个体并记录24、48和96 h的死亡情况。
1. 2. 2 组织病理观察 根据急性毒性试验得到的结果，分别选择4种药物对应的48 h-LC50值的10%浓度对克氏原螯虾浸泡48 h，同时选择4种药物对应的96 h-LC50的10%濃度对克氏原螯虾浸泡96 h，并设置对照组，每组加水30 L，放虾15尾。观察并记录试验期间虾是否存在中毒和死亡现象，从试验组和对照组每组随机取出3只克氏原螯虾，解剖取出肝胰腺和肌肉，经Bouin’s液固定24 h后，放入75%乙醇中保存备用。固定后的组织经乙醇脱水、石蜡包埋、切片、苏木精—伊红染色和中性树胶封片后，在显微镜（Olympus BX51）下观察拍照。 1. 3 统计分析
利用Excel 2010和SPSS 21.0对试验结果进行数理统计分析。采用直线内插法计算4种供试药物对克氏原螯虾的回归方程（药物浓度为横坐标，死亡率为纵坐标）、回归方程相关系数（R）以及24、48和96 h的半致死浓度（LC50）及其95%置信限，安全浓度（SC）=96 h-LC50×0.1。
2 结果与分析
2. 1 克氏原螯虾的中毒症状
试验期间，空白对照组均未发现中毒或死亡个体。所有虾的活力好、行为正常、反应灵敏，能正常蜕壳，且出现交配行为。使用玻璃棒接近时两螯迅速张开防御，或立即跳开躲避。4种药物浸泡下表现的中毒症状比较类似，且不同浓度组的中毒症状表现出明显的剂量和时间效应。中毒初期均表现为行动迟缓、反应迟钝、机体无力，蜕壳虾数量明显减少，用玻璃棒接近时未见及时逃开躲避。随着中毒时间的延长和药物浓度的加大，克氏原螯虾出现仰卧和侧卧现象，其附肢能节律性摆动但身体不能移动，此阶段没有虾发生蜕壳现象。最终的死亡个体多表现为弓背或身体僵直，以侧卧和仰卧死亡为主。4种药物对应的48 h-LC50值和96 h-LC50值的10%浓度分别浸泡克氏原螯虾48和96 h后，均未出现死亡个体，仅部分虾表现为行动迟缓和反应迟钝。
2. 2 4种药物对克氏原螯虾的急性毒性效应
4种药物对克氏原螯虾的急性毒性试验结果见表1。随着4种药物染毒时间的推移，测算得到24、48和96 h的LC50越来越低，药物对克氏原螯虾的毒性越来越大。由表1可知，氰戊菊酯24、48和96 h的LC50分别为4.375、4.252和3.865 μg/L，SC为0.3865 μg/L;辛硫磷24、48和96 h的LC50分别为161.301、87.784和81.637 μg/L，SC为8.1637 μg/L;硫醚沙星24、48和96 h的LC50分别为76.541、72.509和52.529 mg/L，SC为5.2529 mg/L;甲霜灵24、48和96 h的LC50分别为20.610、5.499和4.141 g/L，SC为0.4141 g/L。其中由于辛硫磷162 μg/L浸泡24 h组和甲霜灵8 g/L浸泡24 h组的死亡率未达100%，所以辛硫磷和甲霜灵的24 h的LC50值相较其对应48和96 h的LC50相差较大。
依据GB/T 31270.21—2014《化学农药环境安全评价试验准则》对药物的毒性等级进行划分。由于氰戊菊酯和辛硫磷的96 h-LC50≤0.1 mg a.i./L，因此二者对克氏原螯虾的急性毒性为剧毒，硫醚沙星和甲霜灵的96 h-LC50>10 mg a.i./L，故为低毒。综合对比4种化学药物的LC50，4种药物的毒性排序为氰戊菊酯>辛硫磷>硫醚沙星>甲霜灵。
2. 3 4种化学药物暴露条件下克氏原螯虾的组织病理观察
根据病理切片得到的图片仅挑选部分典型且需要说明的部分，未阐述的部分不具有代表性，因此不进行说明。
2. 3. 1 肝胰腺 健康的克氏原螯虾肝胰腺结构由无数肝小管组成，结构正常，分布均匀。肝小管基膜完整，上皮细胞排列紧密，管腔呈星型（图1-1）。氰戊菊酯染毒48 h后的肝小管出现严重损伤。在切片边缘位置（即肝胰腺表面），发现肝小管管腔呈现明显皱缩现象;包括B细胞在内的细胞出现破裂和空泡化现象，在切片中心位置（肝胰腺内部）未发现该现象（图1-2）。与染毒48 h相比，氰戊菊酯染毒96 h除上述症状外还发现由于管腔挤压导致的肝小管严重变形和细胞坏死的现象（图1-3）。由图1-4～图1-8可知，辛硫磷组、硫醚沙星组和甲霜灵组均在切片边缘位置（肝胰腺表面），发现B细胞及其内部转运泡体积明显增大且增多，且数量最多的组别是硫醚沙星组，其次为辛硫磷组，最少为甲霜灵组，而在切片中心位置（肝胰腺内部）未发现该现象。氰戊菊酯染毒48 h后的肝小管出现严重损伤。在切片边缘位置（即肝胰腺表面），发现肝小管管腔呈现明显皱缩现象;包括B细胞在内的细胞出现破裂和空泡化现象，在切片中心位置（肝胰腺内部）未发现该现象（图1-2）。与染毒48 h相比，氰戊菊酯染毒96 h除上述症状外还发现由于管腔挤压导致的肝小管严重变形和细胞坏死的现象（图1-3）。与对照组相比，辛硫磷组染毒48 h后肝小管的部分R细胞颜色加深，同时出现呈深褐色的液泡。试验虾在甲霜灵中浸泡48 h后，肝小管管腔呈现大量褶皱，且管腔的单层柱状细胞呈现增生趋势，肝小管内出现大量褐色颗粒和部分棕色的R细胞（图1-7）。
2. 3. 2 肌肉 由图2-1可知，健康克氏原螯虾肌纤维排列紧密有序，细胞核呈椭圆形，散布在肌纤维之间。氰戊菊酯组染毒48 h后，克氏原螯虾肌肉出现严重损伤，主要表现为肌肉呈明显的波浪化纹理且部分肌纤维断裂溶解，最终导致出现明显的空腔（图2-2）。辛硫磷染毒96 h后，损伤的肌肉主要表现为细胞排列松散且不规则，肌纤维出现断裂溶解，最终导致明显的空腔（图2-3）。硫醚沙星染毒96 h后，克氏原螯虾肌肉呈现较轻微损伤，主要表现为细胞排列松散不紧密，肌纤维之间出现不同程度的间隙（图2-4）。甲霜灵染毒48 h后，染毒虾的肌肉损伤较轻微，肌纤维之间出现不同程度的间隙（图2-5）;甲霜灵染毒96 h组的肌肉损伤比甲霜灵染毒48 h组更严重，主要表现为部分肌纤维失去固有形态，出现波浪化纹理（图2-6）。
3 讨论
克氏原螯虾分布较广，且饲养管理简便，有望作为环境毒理和药物毒性攻击水生甲壳动物的模型生物（刘青，2012）。化学药物对克氏原螯虾的急性毒性试验数据不仅对阐明药物的毒性作用具有重要意义，该数据也是进行药物安全评价的重要手段（丁正峰等，2012）。氰戊菊酯对不同水产动物的急性毒性差异较明显。周冬仁等（2018）报道，氰戊菊酯对凡纳滨对虾的48 h-LC50为0.123 μg/L;蒋金花等（2015）研究发现氰戊菊酯对斑马鱼幼鱼的96 h-LC50为0.0183 mg/L;本研究中，氰戊菊酯在克氏原螯虾上同样表现出很高的毒性，氰戊菊酯24、48和96 h的LC50分别为4.375、4.252和3.865 μg/L，SC为0.3865 μg/L。本研究结果发现，辛硫磷24、48和96 h的LC50分别为161.301、87.784和81.637 μg/L，SC为8.1637 μg/L;与汪鹏鹏（2017）对斑马鱼的毒性试验结果（96 h、LC50为6.482 mg/L）差异较明显，说明克氏原螯虾对辛硫磷的耐受能力比斑马鱼低。本研究结果证实，硫醚沙星24、48和96 h的LC50分别为76.541、72.509和52.529 mg/L，SC为5.2529 mg/L。秦志清等（2016）报道，硫醚沙星对异育银鲫中科3号幼鱼的48 h-LC50为18.54 mg/L;周桂娴等（2020）报道，硫醚沙星对凡纳滨对虾的48 h-LC50为0.112 mg/L;与之相比，克氏原螯虾对硫醚沙星的忍耐力比同对虾目的凡纳濱对虾强。甲霜灵具有广谱高效的杀菌效果，也可用来防治水产动物由水霉菌引起的疾病（李浩然等，2015）。本研究中，甲霜灵24、48和96 h的LC50分别为20.610、5.499和4.141 g/L，SC为0.4141 g/L。在实际生产中治疗水霉病大多使用甲霜灵复方制剂，其复方制剂对草鱼水花、鲢鱼水花和鲫鱼鱼苗的96 h-LD50为245 mg/L（苏惠冰等，2017），说明甲霜灵在实际生产中不会使用特别大的剂量，且其毒性弱，不会对养殖生物造成危害。 刘晓晓（2018）选用约为96 h-LC50的10%马度米星铵浸泡克氏原螯虾进行亚慢性染毒研究和组织切片观察;本研究选择10%的48 h-LC50和96 h-LC50的药物浓度作为低浓度试验浓度对克氏原螯虾进行染毒和组织切片观察。肝胰腺是甲壳动物的重要器官，主要发挥消化、吸收、储存和排泄等功能（孟愔等，2019）。同时，肝胰腺还是非常重要的药物代谢器官，刘晓晓（2018）发现马度米星铵可诱导克氏原螯虾肝胰腺药物代谢酶的表达，说明一些药物会对肝胰腺产生一定影响。本研究中辛硫磷、硫醚沙星和甲霜灵处理组均导致肝胰腺外围肝小管中B细胞及其内部转运泡数量增多和体积增大，该结果与陶易凡等（2016）的研究结论类似。B细胞发挥分泌消化酶类及胞内消化的作用（赵卫红等，2014）。B细胞及其内部转运泡的变化促进了B细胞分泌的消化酶的转运和代谢吸收，从而为环境胁迫下克氏原螯虾提供更多的营养物质和能量以维持正常生理代谢。而R细胞具有吸收、分解代谢和储存营养物质、分解重金属等功能（陈忱，2015）。本研究中辛硫磷组R细胞颜色加深和出现的褐色液泡可能与营养代谢产物有关（陶易凡等，2016），但仍有待进一步确认。虾的肌肉作为主要食用部分，其水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分等常规营养成分含量是评价肌肉品质的重要指标（万金娟等，2020）。本研究结果表明，染毒虾的肌肉组织主要以断裂和溶解为主，不仅影响虾肉的口感，还可能引起肌肉绵软无力、功能紊乱，进而导致其应激死亡。
本研究中，各组仅以10%的LC50染毒处理即会对克氏原螯虾肝胰腺和肌肉组织产生破坏，且组织破坏程度排序和化学药物毒性排序同为氰戊菊酯>辛硫磷>硫醚沙星>甲霜灵。
4 结论
氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜灵对克氏原螯虾的急性毒性具有较大差异。克氏原螯虾在4种化学药物的安全浓度下均能够存活，但会对肝胰腺和肌肉组织产生破坏。
参考文献：
陈忱. 2015. 克氏原螯虾幼虾消化系统发育及饥饿复投喂对其的影响[D]. 武汉：华中农业大学.doi：10.7666/d.Y2803905. [Chen C. 2015. Studies on the ontogeny of digesitive system and the effect of starvation and refeeding on digestive system of juvenile red swamp crayfish（procambarus clarkii）[D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University.]
丁正峰，薛晖，王晓丰，唐建清. 2012. 毒死蜱（CPF）对克氏原螯虾的急性毒性及组织病理观察[J]. 生态与农村环境学报，28（4）：462-467. doi：10.3969/j.issn.1673-4831. 2012. 04.023. [Ding Z F，Xue H，Wang X F，Tang J Q. 2012.Acute toxicity of chlorpyrifos（CPF） to crayfish（Procambarus clarkii）and the histopathological observation[J].Journal of Ecology and Rural Environment，28（4）：462-467.]
丁中海，杨怡，金洪钧，单正军，于红霞，冯建舫，张晓峰，周家艳. 2004. 三种农药对斑马鱼的急性毒性和生物浓缩系数[J]. 应用生态学报，（5）：888-890. [Ding Z H，Yang Y，Jin H J， Shan Z J，Yu H X，Feng J F，Zhang X F，Zhou J Y. 2004. Acute toxicity and bio-concentration factor of three pesticides on Brachydanio rerio[J]. Chinese Journal of Applied Ecology，（5）：888-890.]
杜洁. 2016. 拟除虫菊酯对斑马鱼内分泌平衡及氧化代谢的扰动效应[D]. 杭州：浙江工业大学. [Du J. 2016. Disturbance effect of pyrethroids on endocrine and oxidative metabolism in zebrafish（Daniorerio）[D]. Hangzhou：Zhejiang University of Technology.]
何力，喻亚丽，甘金华，董立学，彭婕，陈建武，韩刚. 2020. 克氏原螯虾质量安全风险研究与分析[J]. 中國渔业质量与标准，10（1）：1-12. doi：10.3969/j.issn.2095-1833.2020. 01.001. [He L，Yu Y L，Gan J H，Dong L X，Peng J，Chen J W，Han G. 2020. Study and analysis on quality and safety risk of crayfish[J]. Chinese Fishery Quality and Standards，10（1）：1-12.]
蒋金花，陈江滨，吴声敢，俞瑞鲜，王彦华，苍涛，蔡磊明，赵学平. 2015. 氰戊菊酯对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生命阶段的毒性效应[J]. 生态毒理学报，10（6）：269-275.doi：10. 7524/AJE.1673-5897.20150210001. [Jiang J H，Chen J B，Wu S G，Yu R X，Wang Y H，Cang T，Cai L M，Zhao X P. 2015. Toxicity effects of fenvalerate to different life stages of zebrafish（Danio rerio） and Chinese rare minnow（Gobiocypris rarus）[J]. Asian Journal of Ecotoxico-logy，10（6）：269-275.] 江泽军，张鹏，李永飞，杜鹏飞，陈鸽，金茂俊，王静. 2015. 分散固相萃取—高效液相色谱—串联质谱法测定水稻和土壤中的福美双与甲霜灵残留[J]. 农药学学报，17（3）：313-320. doi：10.3969/j.issn.1008-7303.2015.03.10. [Jiang Z J，Zhang P，Li Y F，Du P F，Chen G，Jin M J，Wang J. 2015. Simultaneous determination of thiram and metalaxyl residues in rice and soil by dispersive solid phase extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Pesticide Scien-ce，17（3）：313-320.]
李浩然，欧仁建，邱军强，郭微微，杨先乐，胡鲲. 2015. 立达霉对七彩神仙鱼卵水霉病的防治效果[J]. 南方农业学报，46（4）：697-701. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2015.4.697. [Li H R，Ou R J，Qiu J Q，Guo W W，Yang X L，Hu K. 2015. Control effect of Ridomil on saprolegniasis infec-ted Discus fish（Symphysodon aequifasciatus） zygotes[J].Journal of Southern Agriculture，46（4）：697-701.]
林伟，刘开放，赵良杰. 2020. 稻太郎和稻黄金对克氏原螯虾急性毒性及安全性评价[J]. 水产学杂志，33（2）：66-69. [Lin W， Liu K F， Zhao L J. 2020. Safety evaluation and acute toxicity of herbicides Daotailang and Daohuangjin to juvenile red swamp crayfish Procambarus clarkii[J]. Chinese Journal of Fisheries， 33（2）：66-69.]
刘国兴，郑友，李春宁，彭刚，郝忱，丁淑燕，史杨白. 2019. 4种水产药物对河川沙塘鳢幼鱼的急性毒性试验[J]. 安徽农业科学，47（23）：103-106. doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.030. [Liu G X，Zheng Y，Li C N，Peng G，Hao C，Ding S Y，Shi Y B. 2019. Acute toxicity of four aquacultural drugs to juvenile dark sleeper（Odontobutis potamophila）[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，47（23）：103-106.]
刘青. 2012. 两种渔药对克氏原螯虾的急性毒性研究[J]. 水产科技情报，39（4）： 198-200. doi：10.3969/j.issn.1001-1994. 2012.04.009. [Liu Q. 2012. Acute toxicity of two kinds of fishery drugs to Procambarus clarkii[J]. Fishe-ries Science & Technology Information，39（4）：198-200.]
刘晓晓. 2018. 马度米星铵对克氏原螯虾的毒性研究[D]. 南京：南京农业大学.doi：10.27244/d.cnki.gnjnu.2018. 000518. [Liu X X. 2018. Research of toxic effects of ma-duramicin ammonium on the freshwater crayfish， Procambarus clarkia[D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University.]
孟愔，胡骞，金玉立，吕慧源，顾泽茂. 2019. 复方中草藥制剂对克氏原螯虾生长、免疫功能及肝胰腺组织的影响[J].中国饲料，（21）：60-65.doi：10.15906/j.cnki.cn11-2975/s. 20192113. [Meng Y，Hu Q，Jin Y L，Lü H Y，Gu Z M. 2019. Effects of compound Chinese herbal medicine on growth， immunity and hepatopancreas of crayfish Procambarus clarkii[J]. China Feed，（21）：60-65.]
秦志清，樊海平，薛凌展，邓志武，张焱. 2016. 常用渔药对异育银鲫“中科3号”幼鱼的急性毒性试验[J]. 科学养鱼，（10）：55-56. doi：10.14184/j.cnki.issn1004-843x.2016.10. 030. [Qin Z Q，Fan H P，Xue L Z，Deng Z W，Zhang Y. 2016. Acute toxicity test of common fishery drugs on juvenile of Allogynogenetic crucian carp “Zhongke No.3”[J]. Scientific Fish Farming，（10）：55-56.] 全国水产技术推广总站，中国水产学会. 2020. 2020中国小龙虾产业发展报告全文发布[EB/OL]. 2020-06-22. http：//www.nftec.agri.cn/zzxhdt/202006/t20200622_7433378.htm. [Na-tional Fisheries Technology Extension Center，China Socie-ty ofFisheries. 2020. Report on the development of Chinese crayfish industry in 2020[EB/OL]. 2020-06-22. http：//www.nftec.agri.cn/zzxhdt/202006/t20200622_7433378.htm.]
尚泰宇，時春雨，秦朝辉，彭梦圆，贾博爽，夏晓华. 2019. 氰氟草酯对泥鳅的毒性效应[J]. 河南农业科学，48（9）：162-167. [Shang T Y，Shi C Y，Qin Z H，Peng M Y，Jia B S，Xia X H. 2019. Toxic effects of cyhalofop-butyl to Misgurnus anguillicaudatus[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 48（9）： 162-167.]
苏惠冰，尹清干，杨先乐，胡鲲. 2017. 利用复方甲霜灵粉防治鱼苗孵化过程中的水霉病[J]. 科学养鱼，（9）：69. doi：10.14184/j.cnki.issn1004-843x.2017.09.038. [Su H B，Yin Q G，Yang X L，Hu K. 2017. Using compound meta-laxyl powder to prevent and control water mold in the process of fish hatching[J]. Scientific Fish Farming，（9）：69.]
孙晶，邱军强，陈天楠，王雅丽，郑瑞州，胡鲲. 2020. 基于单克隆抗体的胶体金试纸条检测水产品中甲霜灵的残留[J/OL]. 上海海洋大学学报. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/31.2024.S.20200720.1559.002. [Sun J，Qiu J Q，Chen T N，Wang Y L，Zheng R Z，Hu K. 2020. Detection of meta-laxyl residues in aquatic product based on monoclonal antibody-based colloidal gold tests trips[J/OL]. Journal of Shanghai Ocean University. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/31.2024.S.20200720.1559.002.html.]
陶易凡，强俊，王辉，徐跑，马昕羽，赵文强. 2016. 低pH胁迫对克氏原螯虾鳃和肝胰腺酶活力及组织结构的影响[J].中国水产科学，23（6）：1279-1289.doi：10.3724/SP.J. 1118.2016.16056. [Tao Y F，Qiang J，Wang H，Xu P，Ma X Y，Zhao W Q. 2016. Acute toxicity of low-pH stress and its effect on enzyme activity and histological structure of gill and hepatopancreas in Procambarus clarkii[J].Journal of Fishery Sciences of China，23（6）：1279-1289.]
万金娟，陈友明，邵俊杰，唐建清，沈美芳，孙梦玲，张美琴，孙敏. 2020. 盱眙地区不同养殖模式下克氏原螯虾肌肉品质的比较分析[J]. 动物营养学报，32（2）：965-972. doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2020.02.053. [Wan J J，Chen Y M，Shao J J，Tang J Q，Shen M F，Sun M L，Zhang M Q，Sun M. 2020. Comparative analysis on muscle quality of red swamp crayfish（Procambarus clarkia） cultured under different aquaculture modes in Xuyi region[J].Chinese Journal of Animal Nutrition，32（2）：965-972.]
汪鹏鹏. 2017. 有机磷和有机氯农药对斑马鱼的毒性效应研究[D]. 兰州：西北师范大学. [Wang P P. 2017. Toxic effect of organophosphorus and organochlorine pesticides on zebrafish（Brachydanio rerio）[D]. Lanzhou：Northwest Normal University.]
徐春娟，刘永涛，苏志俊，余琳雪，丁浩，艾晓辉. 2018. 气相色谱法测定淡水养殖环境中的4种拟除虫菊酯类农药残留[J]. 分析科学学报，34（3）：332-336. doi：10.13526/j.issn. 1006-6144.2018.03.007. [Xu C J，Liu Y T，Su Z J，Yu L X，Ding H，Ai X H. 2018. Determination of four pyrethroid residues in fresh aquacultural environment by gas chromatography[J]. Journal of Analytical Science，34（3）：332-336.] 徐杭忠，刘琴琴，唐毅. 2020. 4种水产药物对长吻鮠稚鱼的急性毒性试验[J]. 水产科技情报，47（1）：10-13. doi：10. 16446/j.cnki.1001-1994.2020.01.003. [Xu H Z，Liu Q Q，Tang Y. 2020. Acute toxicity test of four aquatic drugs on endangered juvenile of Leiocassis longirostris[J]. Fishe-ries Science & Technology Information，47（1）：10-13.]
于振海，朱永安，郑玉珍，朱树人，王志忠，孟庆磊. 2017. 氯虫苯甲酰胺对克氏原螯虾的急性毒性试验[J]. 水产科技情报，44（5）：286-288. doi：10.16446/j.cnki.1001-1994. 2017.05.013. [Yu Z H，Zhu Y A，Zheng Y Z，Zhu S R，Wang Z Z，Meng Q L.2017. Acute toxicity of chlorantraniliprole to Procambarus clarkii[J]. Fisheries Science & Technology Information，44（5）：286-288.]
赵卫红，王资生，张余霞，於叶兵，吕富，吕林兰，陈立侨. 2014. 雌二醇对日本沼虾肝胰腺的脂肪酸含量及组织结构的影响[J]. 海洋渔业，36（6）：542-548. doi：10.13233/j.cnki.mar.fish.2014.06.010. [Zhao W H，Wang Z S，Zhang Y X，Yu Y B，Lü F，Lü L L，Chen L Q. 2014. Effects of estradiol on fatty acid composition and tissue structure of hepatopancreas in Macrobrachium nipponense[J]. Marine Fisheries，36（6）：542-548.]
周冬仁，盛鹏程，孙博弈，施沁旋，吴琦芳，徐磊，罗毅志，王俊，叶雪平. 2018. 氰戊菊酯與溴氰菊酯对凡纳对虾的急性毒性[J]. 贵州农业科学，46（7）：103-105. doi：10.3969/j.issn.1001-3601.2018.07.026. [Zhou D R，Sheng P C，Sun B Y，Shi Q X，Wu Q F，Xu L，Luo Y Z，Wang J，Ye X P. 2018. Acute toxicity of fenvalerate and deltamethrin to Penaeus vannamei[J]. Guizhou Agricultural Sciences，46（7）：103-105.]
周桂娴，陈天娇，胡鲲. 2020. 4种化学投入品对凡纳滨对虾的急性毒性[J]. 水产养殖，41（1）：34-37. doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2020.01.007. [Zhou G X，Chen T J，Hu K. 2020. Acute toxicity test of four chemicals to P. vannamei[J]. Journal of Aquaculture，41（1）：34-37.]
Jaroslava L，Milos B，Antonin K，Josef V. 2019. Acute toxicity of two pyrethroid insecticides for fivenon-indigenous crayfish species in Europe[J].Veterinární Medicína，64（3）：125-133. doi：10.17221/136/2018-VETMED.
Lidova J， Bu?i? M， Kouba A， Velisek J，Li Y B，Dong F S，Liu X G，Xu J，Chen X，Han Y T，Cheng Y P，Jian Q，Zheng Y Q. 2013. Enantioselective separation and transformation of metalaxyl and its major metabolite metala-xyl acid in tomato and cucumber[J]. Food Chemistry，141（1）：10-17. doi：10.1016/j.foodchem.2013.02.126.
（责任编辑 邓慧灵）