【摘 要】
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CRISPR/Cas9技术广泛应用于基因敲除,利用敲入包含荧光蛋白和目标基因的片段,有助于早期筛选实验动物.长链脂肪酸延长酶5(elongation of very long chain fatty acids 5,Elov
【机 构】
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上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心,上海201306中国水产科学研究院生物技术研究中心/农业农村部水生动物基因组学重点实验室/北京市渔业生物技术重点实验室,北京100141;中国水产科学研究院
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CRISPR/Cas9技术广泛应用于基因敲除,利用敲入包含荧光蛋白和目标基因的片段,有助于早期筛选实验动物.长链脂肪酸延长酶5(elongation of very long chain fatty acids 5,Elovl5)是鱼类调控高不饱和脂肪酸合成的关键酶之一.为在斑马鱼(Danio rerio)研究鲤(Cyprinus carpio)Elovl5活性,本研究构建包含Tol2序列、斑马鱼短链肌球蛋白2基因(myosin light chain 2,Mylz2)启动子、红色荧光蛋白基因(red fluorescence gene,DsRed2)、斑马鱼Elovl5启动子、鲤Elovl5基因、2A剪切肽和绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的载体,扩增获得一段长7.5 kb的片段.利用CRISPR/Cas9方法,将此片段敲入斑马鱼基因组.敲入成功的斑马鱼在受精72 h后开始于肌肉显红色荧光.对利用红色荧光筛选敲入成功的斑马鱼,进一步用PCR扩增DsRed2予以确证.在存活斑马鱼中,基因敲入阳性率为28.7％.相比对照组,仅在实验组观察到鲤Elovl5表达.实验组的18碳不饱和脂肪酸含量下降18.6％,20碳和22碳不饱和脂肪酸含量提高31.8％,其中20:4n-3不饱和脂肪酸含量是对照组的2.4倍(P<0.05).本研究采用CRISPR/Cas9技术,构建转鲤Elovl5斑马鱼,提高了斑马鱼高不饱和脂肪酸含量,为进一步研究鲤不饱和脂肪酸合成的遗传机制提供基础.
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