【摘 要】
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与传统克隆相比,手工克隆使用较为简单的仪器设备和技术操作即可生产克隆动物.小鼠作为模式实验动物在多领域得以应用.本研究中采用杂交胎鼠细胞系提供核供体细胞,在含细胞松
【机 构】
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深圳华大方舟生物技术有限公司,深圳华大基因研究院
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与传统克隆相比,手工克隆使用较为简单的仪器设备和技术操作即可生产克隆动物.小鼠作为模式实验动物在多领域得以应用.本研究中采用杂交胎鼠细胞系提供核供体细胞,在含细胞松弛素(Cytochalasin B,CB)和链蛋白酶(Pronase)及2％血清的M199 hepes缓冲液滴(CBMP)中消化透明带并切割去核,电融合后1h,重构胚置于含SrC12及CB(5 μg/mL)的无钙体外培养液(Ca2+-free IVC)中激活6h,体外培养液(IVC)中清洗3遍后,移入WOW系统培养,培养至小鼠HMC囊胚阶段.研究发现:1)CBMP液中Pronase的浓度相比20 μg/mL和100μg/mL,卵母细胞透明带在10 μg/mL组需要更长时间消化至消失,较有利于操作;2)直流电(DC)80 V,持续40μs,融合率达60％.3)含10 mmoL/L SrCl2的化学激活液处理的重构胚与5mmol/L组相比,囊胚更高(29±3％∶13±3％,P＜0.05),差异显著;4)两种体外培养液,CZB与mPZM,在IVC囊胚率上无显著差异(29±3％:24±5％,P＞0.05),而使用CZB可获得较高的囊胚率.本实验首次采用HMC方法体外条件下生产小鼠克隆胚胎,通过摸索透明带消化时间、电激活参数、化学激活试剂及培养液,尝试小鼠体外生产克隆胚胎的新方法,并取得了初步成果,技术优化及效率提高问题仍需要更进一步的研究.
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