【摘 要】
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为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的c DNA序列。该序列含有一个长度为1
【机 构】
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江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/国家油料作物改良中心南京分中心;
【基金项目】
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国家自然科学基金(31671731);国家重点研发计划(2016YFD0101300);国家现代农业产业技术体系(CARS-13);江苏省自然科学基金(BK20151369);江苏省农业科学院基本科研业务专项[ZX(15)1004]
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为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的c DNA序列。该序列含有一个长度为1 959bp的开放阅读框,编码蛋白为652个氨基酸,在N端含有一个由49个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列。将该信号肽序列构建至植物表达载体35S::BnALS3-GFP,利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达,结果显示BnALS3蛋白定位在叶绿体中。构建去除叶绿体信号肽序列的BnALS3原核表达载体p Czn1-BnALS3,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测显示,在11℃条件下以终浓度为0.2mmol·L-1的IPTG诱导8h后,p Czn1-BnALS3基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白His-BnALS3呈部分可溶性,分子量约为67k D。酶活分析表明,原核表达的His-BnALS3最适反应p H值为7.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为6.55mmol·L-1和6.40μmol·mg-1·h-1。
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