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[摘要]目的：研究甘草次酸对光老化人皮肤角质形成细胞（HaCaT）的保护作用及NF-κB信号通路的影响。方法：用30mJ/cm2的UVB照射HaCaT细胞，建立光老化模型；用不同浓度（10-7、10-5、10-5mol·L-1）的甘草次酸处理光老化HaCaT细胞24h。MTT法检测甘草次酸对细胞活性的影响；试剂盒法检测各组细胞上清SOD、GSH活性及MDA含量；Western Blot法检测各组细胞NF-κBP5 0和NF-κBP6 5蛋白表达量。结果：模型组细胞与空白组细胞相比，模型组细胞增殖率显著降低（P<0.01）；GSH、SOD活性显著降低，MDA含量显著升高（P<0.01）；NF-κBP5 0、NF-κBP65蛋白表达量显著升高（P<0.01）。甘草次酸处理的HaCaT细胞与模型组细胞相比，甘草次酸组细胞增殖率显著升高（P<0.01）；GSH、SOD活性显著升高，MDA含量显著降低（P<0.01）；NF-κBP50、NF-κBP65蛋白表达显著下降（P<0.05，P<0.01）。结论：甘草次酸能显著保护UVB诱导的HaCaT细胞光老化，其机制可能与其抑制氧化损伤，阻断NF-κB信号通路，抑制NF-κBP50、NF-κBP65蛋白表达有关。
[关键词]甘草次酸；光老化；HaCaT细胞；NF-κB信号通路
[中图分类号]R285.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）08-0077-03
皮肤位于人体最外层，不仅具有排汗、防寒作用，而且还具有抵御外来刺激的作用，是人体第一道防御系统。内源性老化是人体自然衰老，外源性老化主要是由于物理和化学因素诱发的，其中，uv诱导皮肤老化，称为光老化。近几年来，皮肤光老化现象普遍增多的主要原因是环境污染，臭氧层阻挡UV的能力减弱，到达地球表面的UV逐渐增多。据报道，UVB是皮肤光老化主要诱发因素，长期的UVB辐射将导致皮肤皱缩、无弹性、无光泽、色素沉着及恶性肿瘤发生。近几年，越来越多人关注美容养护，于是，探索皮肤光老化发病机制及从中药中寻找有效成分预防和治疗皮肤光老化成为现代科研重点发展方向。
甘草为豆科甘草属植物的根和根茎，最早出现于《神农本草经》，被列为上品，具有清热解毒、补脾和胃、缓急止痛、祛痰止咳、调和诸药等作用。甘草次酸作为甘草根茎中主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗溃疡、抗心律失常、调节免疫力等功效。人皮肤表层主要由角质形成细胞（HaCaT）组成的，HaCaT细胞是UVB的靶细胞。本实验采用30mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞，建立光老化模型，用不同浓度甘草次酸作用于光老化HaCaT细胞，探讨甘草次酸对光老化HaCaT细胞的保护作用及NF-κB信号通路影响。
1材料和仪器
1.1实验材料：人皮肤角质形成细胞HaCaT（中乔新舟）；胎牛血清FBS（Hyclone公司，批号：NYB0614）；DMEM培养液（Hyclone公司，批号：NZM1301）；双抗（Hyclone公司，批号：20161230）；磷酸盐缓冲液PBS（北京中山金桥有限公司，批号：20160509）；胰蛋白酶（Billab公司，批号：J120028）；四甲基噻唑蓝MTT（Sigma公司，批号：021005）；二甲基亚砜DMSO（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20160716）；SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20170522）；GSH试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20170518）；MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20170520）；RIPA细胞裂解液及PMSF蛋白酶抑制剂（碧云天生物技术研究所）；兔抗人β-actin单克隆抗体（博奥森生物有限公司）；兔抗人NF-κBP50多克隆抗体（南京恩晶生物科技有限公司）；兔抗人NF-κBP65多克隆抗体（南京恩晶生物科技有限公司）；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司）；甘草次酸，经本校陈效忠副教授鉴定纯度为正品（98%，南京泽朗医药科技有限公司，批号ZL00380718）。
1.2实验仪器：生物洁净工作台（BCM-1000A型），苏州安泰空气技术有限公司；Olympus倒置显微镜（IX-71-21PH型），日本Olympus株式会社；二氧化碳培养箱（HF90型），上海智城分析仪器有限公司；酶标仪（MK3型），上海热电仪器有限公司；高速台式冷冻离心机（TCL6G-C），上海安亭科学仪器厂；DYY-10C型电泳仪，北京六一仪器厂；Smart Chemi500型一体式微型化学发光成像仪，北京赛智创业有限公司。
2实验方法
2.1 10%DMEM培养液的配制：DMEM培养基：PBS：P/S=89：10：1，混匀，4℃保存。
2.2药物配制：通过预实验确定甘草次酸浓度大于10-5mol·L-1时对HaCaT细胞产生毒性，本实验将甘草次酸加入DMEM培养液中，配制成10-5、10-6、10-7mool·L-13个浓度，调至pH 7.0，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存待用。
2.3細胞培养：细胞生长至对数期，胰酶消化，离心，并使用计数板计数，以1×1042个/孔将细胞接种至96孔板，每组6个复孔，1×106个/孔将细胞接种至6孔板，于37℃，5%CO2培养箱培养。
2.4 MTT法检测甘草次酸对HaCaT细胞活性的影响：96孔板内细胞随机分为空白组、模型组、（10-7、10-6、10-5mol·L-1）甘草次酸组。细胞培养24h后，吸弃培养液，PBS冲洗2次，每孔加200μl PBS，使用铝箔纸将空白组覆盖，用30mJ/cm2UVB照射模型组和甘草次酸组，照射完毕，弃去PBS，甘草次酸组加入不同梯度浓度的甘草次酸，模型组和空白组加入等量培养液，孵育24h后，每孔加入20μl MTT（5mg/ml），孵育4h，吸弃培养液，每孔加入150μl DM80，37℃恒温培养震荡器上震荡10min，在酶标仪492nm波长处测定吸光度值。 2.5试剂盒检测HaCaT细胞中GSH、SOD活性及MDA含量：6孔板细胞参照2.4方式建立光老化模型。待细胞生长密度达80%～90%时，收集6孔板中各组细胞，PBS冲洗2次，RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF以99：1混匀，按照100μl/孔加入混合液，冰盒上静置30min，4℃ 13200rpm的条件下离心15min，在冰盒上收集上清液于离心管中，按照试剂盒说明书检测各组细胞中GSH、SOD活性及MDA含量。
2.6 Western Blot法检测HaCaT中NF-κ BP50和NF-κ BP65蛋白表达量：收集6孔板中各组细胞，使用RIPA和PMSF混合液提取蛋白，BCA法测定各组细胞蛋白浓度，每孔加样20μl，8DS-PAGE电泳60min，半干转膜30min，室温封闭2h，加入一抗孵育，4℃过夜，TBST洗膜三次，加二抗室温孵育1h，TBST洗膜三次，加入ECL显色，使用发光成像仪拍摄，利用Lane ID凝胶软件分析各条带的灰度值，以目的条带灰度值和内参条带灰度值的比值，反映目的蛋白的表达水平。
2.7统计学分析：数据均用x±s表示，采用SPSS 21.0软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析，若P<0.05，则具有统计学意义。
3结果
3.1甘草次酸对HaCaT细胞活性的影响：与空白组相比，模型组细胞增殖率显著降低（P<0.01）；与模型组相比，10-7、10-6、10-5mol·L。甘草次酸组细胞增殖率显著升高（P<0.01）。见表1。
3.2甘草次酸对HaCaT细胞中SOD、GSH及MDA活性的影响：见表2。模型组与空白组相比，模型组细胞中GSH、SOD活性显著降低，MDA含量显著升高（P<0.01）；甘草次酸组与模型组相比，不同浓度（10-7、10-6、10-5mol·L-1）甘草次酸组细胞中GSH、SOD活性显著升高，MDA含量显著降低（P<0.01）。随着浓度的增大，SOD、GSH活性逐渐升高，MDA含量逐渐降低。由此可知，10-7、10-6、10-5mol·L-2的甘草次酸对光老化HaCaT細胞具有较好的保护作用，且这种保护作用对甘草次酸的浓度有一定的依耐性。
3.3甘草次酸对光老化HaCaT细胞中NF-κ BP50和NF κ BP65蛋白表达量的影响：如表3和图1所示，模型组与空白组相比，模型组细胞中NF-κ BP50、NF-κ BP65蛋白表达显著升高（P<0.01）；甘草次酸组与模型组相比，浓度为10-7mol·L-1的甘草次酸组细胞中NF-κ BP50、NF-κ BP65蛋白表达显著下降（P<0.05，P<0.01），浓度为10 6mol·L-1和浓度为10-5mol·L-1的甘草次酸组细胞中NF-κ BP50、NF-κ BP65蛋白表达均显著下降（P<0.01）。由此可知，不同浓度10-7、10-6、10-5mol·L-1的甘草次酸能够显著的降低光老化细胞中NF-κ BP50和NF-κBP65蛋白的表达。
4讨论
目前关于UVB诱导人皮肤角质形成细胞光老化机制的探索，除了炎症因子的研究，体内的信号通路参与也是研究的重点。近年来研究显示，NF-κB信号通路参与了UV诱导皮肤炎症因子分泌过程。UVB辐射HaCaT细胞，导致多种炎症因子的产生，如TNF-α、IL-1α、IL-β、IL-8、IL-6、IL-10等，进而引起皮肤光老化。UV诱导HaCaT细胞产生的细胞因子不仅可以作用于细胞因子受体，也可以激活AP 1及NF-κB通路，促进光老化产生。NF-κB主要是NF-κ BP50、NF-κ BP65组成的二聚体。无刺激的条件下，NF-κB（P50和P65）与IκB蛋白结合，保持无活性状态，当UVB照射HaCaT时，刺激I-κB分离，细胞质中NF-κB进入细胞核，促进下游基因的表达，同时，也会激活相关细胞因子，生长因子以及相关蛋白酶的表达等。另外，UVB诱导光老化角质形成细胞过程中，NF-κB信号通路参与IL-1、TNF-α等炎症因子的产生，IL-1、TNF-α又可以激活NF-κB信号通路，形成一个恶性循环系统。因此，NF-κB不仅对维持正常表皮细胞起重要作用，还参与免疫及炎症等相关细胞因子表达，也参与了UV诱导皮肤癌发生和发展的过程。
本实验结果显示，UVB可以显著升高光老化HaCaT细胞中NF-κ BP50/NF-κ BP65蛋白的表达，但加入甘草次酸后可显著降低了NF-κBP50、NF-κBP65蛋白的表达，由此可知，甘草次酸可通过提高GSH、SOD活性和降低MDA含量，减轻氧化损伤，抑制NF-κB信号通路的表达，进而减少皮肤光老化的发生。
[关键词]甘草次酸；光老化；HaCaT细胞；NF-κB信号通路
[中图分类号]R285.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）08-0077-03
皮肤位于人体最外层，不仅具有排汗、防寒作用，而且还具有抵御外来刺激的作用，是人体第一道防御系统。内源性老化是人体自然衰老，外源性老化主要是由于物理和化学因素诱发的，其中，uv诱导皮肤老化，称为光老化。近几年来，皮肤光老化现象普遍增多的主要原因是环境污染，臭氧层阻挡UV的能力减弱，到达地球表面的UV逐渐增多。据报道，UVB是皮肤光老化主要诱发因素，长期的UVB辐射将导致皮肤皱缩、无弹性、无光泽、色素沉着及恶性肿瘤发生。近几年，越来越多人关注美容养护，于是，探索皮肤光老化发病机制及从中药中寻找有效成分预防和治疗皮肤光老化成为现代科研重点发展方向。
甘草为豆科甘草属植物的根和根茎，最早出现于《神农本草经》，被列为上品，具有清热解毒、补脾和胃、缓急止痛、祛痰止咳、调和诸药等作用。甘草次酸作为甘草根茎中主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗溃疡、抗心律失常、调节免疫力等功效。人皮肤表层主要由角质形成细胞（HaCaT）组成的，HaCaT细胞是UVB的靶细胞。本实验采用30mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞，建立光老化模型，用不同浓度甘草次酸作用于光老化HaCaT细胞，探讨甘草次酸对光老化HaCaT细胞的保护作用及NF-κB信号通路影响。
1材料和仪器
1.1实验材料：人皮肤角质形成细胞HaCaT（中乔新舟）；胎牛血清FBS（Hyclone公司，批号：NYB0614）；DMEM培养液（Hyclone公司，批号：NZM1301）；双抗（Hyclone公司，批号：20161230）；磷酸盐缓冲液PBS（北京中山金桥有限公司，批号：20160509）；胰蛋白酶（Billab公司，批号：J120028）；四甲基噻唑蓝MTT（Sigma公司，批号：021005）；二甲基亚砜DMSO（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20160716）；SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20170522）；GSH试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20170518）；MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20170520）；RIPA细胞裂解液及PMSF蛋白酶抑制剂（碧云天生物技术研究所）；兔抗人β-actin单克隆抗体（博奥森生物有限公司）；兔抗人NF-κBP50多克隆抗体（南京恩晶生物科技有限公司）；兔抗人NF-κBP65多克隆抗体（南京恩晶生物科技有限公司）；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司）；甘草次酸，经本校陈效忠副教授鉴定纯度为正品（98%，南京泽朗医药科技有限公司，批号ZL00380718）。
1.2实验仪器：生物洁净工作台（BCM-1000A型），苏州安泰空气技术有限公司；Olympus倒置显微镜（IX-71-21PH型），日本Olympus株式会社；二氧化碳培养箱（HF90型），上海智城分析仪器有限公司；酶标仪（MK3型），上海热电仪器有限公司；高速台式冷冻离心机（TCL6G-C），上海安亭科学仪器厂；DYY-10C型电泳仪，北京六一仪器厂；Smart Chemi500型一体式微型化学发光成像仪，北京赛智创业有限公司。
2实验方法
2.1 10%DMEM培养液的配制：DMEM培养基：PBS：P/S=89：10：1，混匀，4℃保存。
2.2药物配制：通过预实验确定甘草次酸浓度大于10-5mol·L-1时对HaCaT细胞产生毒性，本实验将甘草次酸加入DMEM培养液中，配制成10-5、10-6、10-7mool·L-13个浓度，调至pH 7.0，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存待用。
2.3細胞培养：细胞生长至对数期，胰酶消化，离心，并使用计数板计数，以1×1042个/孔将细胞接种至96孔板，每组6个复孔，1×106个/孔将细胞接种至6孔板，于37℃，5%CO2培养箱培养。
2.4 MTT法检测甘草次酸对HaCaT细胞活性的影响：96孔板内细胞随机分为空白组、模型组、（10-7、10-6、10-5mol·L-1）甘草次酸组。细胞培养24h后，吸弃培养液，PBS冲洗2次，每孔加200μl PBS，使用铝箔纸将空白组覆盖，用30mJ/cm2UVB照射模型组和甘草次酸组，照射完毕，弃去PBS，甘草次酸组加入不同梯度浓度的甘草次酸，模型组和空白组加入等量培养液，孵育24h后，每孔加入20μl MTT（5mg/ml），孵育4h，吸弃培养液，每孔加入150μl DM80，37℃恒温培养震荡器上震荡10min，在酶标仪492nm波长处测定吸光度值。 2.5试剂盒检测HaCaT细胞中GSH、SOD活性及MDA含量：6孔板细胞参照2.4方式建立光老化模型。待细胞生长密度达80%～90%时，收集6孔板中各组细胞，PBS冲洗2次，RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF以99：1混匀，按照100μl/孔加入混合液，冰盒上静置30min，4℃ 13200rpm的条件下离心15min，在冰盒上收集上清液于离心管中，按照试剂盒说明书检测各组细胞中GSH、SOD活性及MDA含量。
2.6 Western Blot法检测HaCaT中NF-κ BP50和NF-κ BP65蛋白表达量：收集6孔板中各组细胞，使用RIPA和PMSF混合液提取蛋白，BCA法测定各组细胞蛋白浓度，每孔加样20μl，8DS-PAGE电泳60min，半干转膜30min，室温封闭2h，加入一抗孵育，4℃过夜，TBST洗膜三次，加二抗室温孵育1h，TBST洗膜三次，加入ECL显色，使用发光成像仪拍摄，利用Lane ID凝胶软件分析各条带的灰度值，以目的条带灰度值和内参条带灰度值的比值，反映目的蛋白的表达水平。
2.7统计学分析：数据均用x±s表示，采用SPSS 21.0软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析，若P<0.05，则具有统计学意义。
3结果
3.1甘草次酸对HaCaT细胞活性的影响：与空白组相比，模型组细胞增殖率显著降低（P<0.01）；与模型组相比，10-7、10-6、10-5mol·L。甘草次酸组细胞增殖率显著升高（P<0.01）。见表1。
3.2甘草次酸对HaCaT细胞中SOD、GSH及MDA活性的影响：见表2。模型组与空白组相比，模型组细胞中GSH、SOD活性显著降低，MDA含量显著升高（P<0.01）；甘草次酸组与模型组相比，不同浓度（10-7、10-6、10-5mol·L-1）甘草次酸组细胞中GSH、SOD活性显著升高，MDA含量显著降低（P<0.01）。随着浓度的增大，SOD、GSH活性逐渐升高，MDA含量逐渐降低。由此可知，10-7、10-6、10-5mol·L-2的甘草次酸对光老化HaCaT細胞具有较好的保护作用，且这种保护作用对甘草次酸的浓度有一定的依耐性。
3.3甘草次酸对光老化HaCaT细胞中NF-κ BP50和NF κ BP65蛋白表达量的影响：如表3和图1所示，模型组与空白组相比，模型组细胞中NF-κ BP50、NF-κ BP65蛋白表达显著升高（P<0.01）；甘草次酸组与模型组相比，浓度为10-7mol·L-1的甘草次酸组细胞中NF-κ BP50、NF-κ BP65蛋白表达显著下降（P<0.05，P<0.01），浓度为10 6mol·L-1和浓度为10-5mol·L-1的甘草次酸组细胞中NF-κ BP50、NF-κ BP65蛋白表达均显著下降（P<0.01）。由此可知，不同浓度10-7、10-6、10-5mol·L-1的甘草次酸能够显著的降低光老化细胞中NF-κ BP50和NF-κBP65蛋白的表达。
4讨论
目前关于UVB诱导人皮肤角质形成细胞光老化机制的探索，除了炎症因子的研究，体内的信号通路参与也是研究的重点。近年来研究显示，NF-κB信号通路参与了UV诱导皮肤炎症因子分泌过程。UVB辐射HaCaT细胞，导致多种炎症因子的产生，如TNF-α、IL-1α、IL-β、IL-8、IL-6、IL-10等，进而引起皮肤光老化。UV诱导HaCaT细胞产生的细胞因子不仅可以作用于细胞因子受体，也可以激活AP 1及NF-κB通路，促进光老化产生。NF-κB主要是NF-κ BP50、NF-κ BP65组成的二聚体。无刺激的条件下，NF-κB（P50和P65）与IκB蛋白结合，保持无活性状态，当UVB照射HaCaT时，刺激I-κB分离，细胞质中NF-κB进入细胞核，促进下游基因的表达，同时，也会激活相关细胞因子，生长因子以及相关蛋白酶的表达等。另外，UVB诱导光老化角质形成细胞过程中，NF-κB信号通路参与IL-1、TNF-α等炎症因子的产生，IL-1、TNF-α又可以激活NF-κB信号通路，形成一个恶性循环系统。因此，NF-κB不仅对维持正常表皮细胞起重要作用，还参与免疫及炎症等相关细胞因子表达，也参与了UV诱导皮肤癌发生和发展的过程。
本实验结果显示，UVB可以显著升高光老化HaCaT细胞中NF-κ BP50/NF-κ BP65蛋白的表达，但加入甘草次酸后可显著降低了NF-κBP50、NF-κBP65蛋白的表达，由此可知，甘草次酸可通过提高GSH、SOD活性和降低MDA含量，减轻氧化损伤，抑制NF-κB信号通路的表达，进而减少皮肤光老化的发生。