论文部分内容阅读
摘 要：该研究优化了SDS的DNA提取方法，采用SSR分子标记技术建立了一种准确、稳定、快捷、规模化的杂交水稻种子纯度检测流程，为大规模杂交水稻种子纯度检测提供了高效简便的方法。
关键词：纯度鉴定;水稻品种;SSR分子标记
中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）05-0009-02
种子质量不仅是决定农作物收成的关键，也是种业企业在竞争中处于不败之地的重要因素，是种业企业生存的根本。杂交种子纯度是种子质量检测的重要指标之一，加强种子纯度检测对于水稻生产销售至关重要。种子纯度检测主要有海南鉴定、正季种植鉴定以及SSR分子标记鉴定方法。海南鉴定具有相对准确、时间相对提前的优点，但海南冬季属短日照低温条件，感光类型及两系不育系均表现为正常结实，对杂交水稻尤其是两系杂交水稻种子纯度的鉴定结果往往失真。正季鉴定结果与大田生产实际吻合度高的优点，但时间明显滞后。从历年发生的重大种子纯度事故来看，绝大多数是在得知种子纯度不合格之前，种子已经销售到千家万户无法召回，从而酿成了无法挽回的损失。SSR分子标记是从DNA水平上检测生物个体差异，具有多态性高、谱带扩增稳定、技术成熟、检测时间短、不受环境影响等特点，在杂交水稻种子纯度鉴定中得到了越来越广泛的应用。为此，本研究建立了一种准确、稳定、快捷、规模化检测的流程，为大量检测杂交水稻种子纯度提供高效简便的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 48对引物，Taq DNA聚合酶，DNTP，十二烷基磺酸钠，10%SDS，2MTris-HCI，250mMEDTA，乙酸铵，40%聚丙烯酰胺凝胶，5*TBE，过硫酸铵，四甲基乙二胺，甲醛，冰醋酸，无水乙醇，氢氧化钠，硝酸银，琼脂糖，溴酚蓝等化学试剂。
1.1.2 主要仪器 研磨仪，高速冷冻离心机，水浴锅，PCR扩增仪，电泳仪，电泳槽，摇床，胶片观察灯，通风橱，超低温冰箱，微波炉，电子天平等仪器。
1.2 方法
1.2.1 种子发芽 每个样品随机取300粒种子，均匀置于发芽床上，放在30℃的发芽箱6d左右。
1.2.2 DNA提取（一种优化的SDS提取法） 随机选取水稻幼苗用镊子放入96孔深孔板中，每个单株在1～5cm，将磁珠放入每个孔中，盖上软盖，做好标记，放入超低温冰箱冷冻1h左右。冷冻结束放在研磨仪研磨1min30s，用高速冷冻离心机离心2min。每个孔中加入280μL的65℃提取液，再用研磨仪研磨30s，离心机离心2min。加入150μL的乙酸铵溶液，充分摇匀，4000r、4℃冷冻离心机离心15min。将上清液200μL转入另一深孔板中，加入400μL的无水乙醇。4000r、4℃冷冻离心机离心15min，弃上清，自然条件下干燥或用吹风机吹干，加入100μL的双蒸水，放置4℃冰箱保存备用。
1.2.3 引物筛选 采用中华人民共和国农业行业标准NY/T1433—2014《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》附录C中推荐的48对SSR引物，对杂交种进行多态性筛选。选用在杂交种中具有较好多态性的SSR引物。
1.2.4 PCR扩增检测 从筛选得到的引物中随机挑选2对引物进行PCR扩增，采用11μL的PCR反应体系，即在PCR反应管中分别加入样品DNA提取液（2.0μL）、10×Buffer（1.0μL）、2.5mMNTP（0.8μL）、25mMMgcl2（0.6μL）正向引物（1μL），反向引物（1μL）、ddH2O（4.35μL）和TaqDNA聚合酶（0.25μL）。PCR反应程序为：先94℃预变性2min;再94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环;72℃延伸8min。反应完成后，加入溴酚蓝，置4°C环境下保存备用。
1.2.5 PCR产物检测 扩增产物采用3%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，使用104孔密型点样梳一次性点样96孔PCR板上的96个样品;在350V、400mA条件下，电泳40min，染色、显影。
2 结果与分析
2.1 判别方法 每个品种用2对引物扩增，分别做96粒，点样时一一对应。如果2对引物都在同一个位置上检测到杂株，则判断为1个杂株;如果2对引物分别在不同位置检测到杂株，检测到几个杂株则判断为几个个杂株。如果其中1对引物在某个位置上检测到亲本带，而另一对引物在这个位置上没有检测到亲本带，则判断为杂株;如果2对引物都在这个位置上检测到亲本带且都是母本带或者都是父本带，则判断为杂母本或者父本。
2.2 纯度判定 图1为品种A在标记RM336和标记RM208第6位置上是都是母本带，则判断品种A杂1粒母本带，纯度为99.0%。2为品种B在标记RM71上第21位置上是母本带;在标记RM339上12位置上是母本带，27位置上是母本带，43位置上是杂株，则判断品种B有4个杂株，纯度为95.8%。
3 讨论
在常规的SSR分子标记检测程序中，DNA提取通常采用的是CTAB法、没有优化的SDS法、快提法和磁珠法。CTAB法和普通的SDS法需要加氯仿和异戊醇，气味很难闻，对人体有害、不安全，快提法DNA的质量不高，且保存时间很短，对PCR扩增产物检测电泳有限制，如毛细管电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测效果不好。磁珠法提取成本高，试剂盒比较贵。本研究优化的SDS法，无需加氯仿和异戊醇，比较安全，提取的DNA质量高，保存时间很长，适合任何电泳，成本低，经济适用。并且用深孔板提取，能够高通量提取，特别是需要大量提取水稻DNA时，优势明显。
引物选择上原则是选择杂合率高，在其双亲中具有共显性的多态性，区分异品种能力强，多态性好，扩增效果好，即可用于杂交种子的纯度检测。但不同SSR引物的杂株辨别率的差距较大，单对SSR引物检测杂株类型构成复杂的样品时可靠性较低。所以应尽可能了解受检样品的生产背景和杂株类型，最好与田间鉴定相结合，选出具有针对性的2对或多对引物供检测。
参考文献
[1]周桂林，刘奇燕，范家萌，等.SSR分子标记高效選择抗稻瘟病双基因Pi-1、Pi-2的技术体系[J].安徽农业科学，2017（7）：123-125.
[2]李婧婧，付求来，戴继侠，等.一种快速鉴定杂交水稻种子纯度的方法[J].种子，2018（4）：125-126，131.
（责编：张宏民）
关键词：纯度鉴定;水稻品种;SSR分子标记
中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）05-0009-02
种子质量不仅是决定农作物收成的关键，也是种业企业在竞争中处于不败之地的重要因素，是种业企业生存的根本。杂交种子纯度是种子质量检测的重要指标之一，加强种子纯度检测对于水稻生产销售至关重要。种子纯度检测主要有海南鉴定、正季种植鉴定以及SSR分子标记鉴定方法。海南鉴定具有相对准确、时间相对提前的优点，但海南冬季属短日照低温条件，感光类型及两系不育系均表现为正常结实，对杂交水稻尤其是两系杂交水稻种子纯度的鉴定结果往往失真。正季鉴定结果与大田生产实际吻合度高的优点，但时间明显滞后。从历年发生的重大种子纯度事故来看，绝大多数是在得知种子纯度不合格之前，种子已经销售到千家万户无法召回，从而酿成了无法挽回的损失。SSR分子标记是从DNA水平上检测生物个体差异，具有多态性高、谱带扩增稳定、技术成熟、检测时间短、不受环境影响等特点，在杂交水稻种子纯度鉴定中得到了越来越广泛的应用。为此，本研究建立了一种准确、稳定、快捷、规模化检测的流程，为大量检测杂交水稻种子纯度提供高效简便的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 48对引物，Taq DNA聚合酶，DNTP，十二烷基磺酸钠，10%SDS，2MTris-HCI，250mMEDTA，乙酸铵，40%聚丙烯酰胺凝胶，5*TBE，过硫酸铵，四甲基乙二胺，甲醛，冰醋酸，无水乙醇，氢氧化钠，硝酸银，琼脂糖，溴酚蓝等化学试剂。
1.1.2 主要仪器 研磨仪，高速冷冻离心机，水浴锅，PCR扩增仪，电泳仪，电泳槽，摇床，胶片观察灯，通风橱，超低温冰箱，微波炉，电子天平等仪器。
1.2 方法
1.2.1 种子发芽 每个样品随机取300粒种子，均匀置于发芽床上，放在30℃的发芽箱6d左右。
1.2.2 DNA提取（一种优化的SDS提取法） 随机选取水稻幼苗用镊子放入96孔深孔板中，每个单株在1～5cm，将磁珠放入每个孔中，盖上软盖，做好标记，放入超低温冰箱冷冻1h左右。冷冻结束放在研磨仪研磨1min30s，用高速冷冻离心机离心2min。每个孔中加入280μL的65℃提取液，再用研磨仪研磨30s，离心机离心2min。加入150μL的乙酸铵溶液，充分摇匀，4000r、4℃冷冻离心机离心15min。将上清液200μL转入另一深孔板中，加入400μL的无水乙醇。4000r、4℃冷冻离心机离心15min，弃上清，自然条件下干燥或用吹风机吹干，加入100μL的双蒸水，放置4℃冰箱保存备用。
1.2.3 引物筛选 采用中华人民共和国农业行业标准NY/T1433—2014《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》附录C中推荐的48对SSR引物，对杂交种进行多态性筛选。选用在杂交种中具有较好多态性的SSR引物。
1.2.4 PCR扩增检测 从筛选得到的引物中随机挑选2对引物进行PCR扩增，采用11μL的PCR反应体系，即在PCR反应管中分别加入样品DNA提取液（2.0μL）、10×Buffer（1.0μL）、2.5mMNTP（0.8μL）、25mMMgcl2（0.6μL）正向引物（1μL），反向引物（1μL）、ddH2O（4.35μL）和TaqDNA聚合酶（0.25μL）。PCR反应程序为：先94℃预变性2min;再94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环;72℃延伸8min。反应完成后，加入溴酚蓝，置4°C环境下保存备用。
1.2.5 PCR产物检测 扩增产物采用3%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，使用104孔密型点样梳一次性点样96孔PCR板上的96个样品;在350V、400mA条件下，电泳40min，染色、显影。
2 结果与分析
2.1 判别方法 每个品种用2对引物扩增，分别做96粒，点样时一一对应。如果2对引物都在同一个位置上检测到杂株，则判断为1个杂株;如果2对引物分别在不同位置检测到杂株，检测到几个杂株则判断为几个个杂株。如果其中1对引物在某个位置上检测到亲本带，而另一对引物在这个位置上没有检测到亲本带，则判断为杂株;如果2对引物都在这个位置上检测到亲本带且都是母本带或者都是父本带，则判断为杂母本或者父本。
2.2 纯度判定 图1为品种A在标记RM336和标记RM208第6位置上是都是母本带，则判断品种A杂1粒母本带，纯度为99.0%。2为品种B在标记RM71上第21位置上是母本带;在标记RM339上12位置上是母本带，27位置上是母本带，43位置上是杂株，则判断品种B有4个杂株，纯度为95.8%。
3 讨论
在常规的SSR分子标记检测程序中，DNA提取通常采用的是CTAB法、没有优化的SDS法、快提法和磁珠法。CTAB法和普通的SDS法需要加氯仿和异戊醇，气味很难闻，对人体有害、不安全，快提法DNA的质量不高，且保存时间很短，对PCR扩增产物检测电泳有限制，如毛细管电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测效果不好。磁珠法提取成本高，试剂盒比较贵。本研究优化的SDS法，无需加氯仿和异戊醇，比较安全，提取的DNA质量高，保存时间很长，适合任何电泳，成本低，经济适用。并且用深孔板提取，能够高通量提取，特别是需要大量提取水稻DNA时，优势明显。
引物选择上原则是选择杂合率高，在其双亲中具有共显性的多态性，区分异品种能力强，多态性好，扩增效果好，即可用于杂交种子的纯度检测。但不同SSR引物的杂株辨别率的差距较大，单对SSR引物检测杂株类型构成复杂的样品时可靠性较低。所以应尽可能了解受检样品的生产背景和杂株类型，最好与田间鉴定相结合，选出具有针对性的2对或多对引物供检测。
参考文献
[1]周桂林，刘奇燕，范家萌，等.SSR分子标记高效選择抗稻瘟病双基因Pi-1、Pi-2的技术体系[J].安徽农业科学，2017（7）：123-125.
[2]李婧婧，付求来，戴继侠，等.一种快速鉴定杂交水稻种子纯度的方法[J].种子，2018（4）：125-126，131.
（责编：张宏民）