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摘 要：对单胞藻的扩大培养技术进行综述，并对贝类育苗生产过程中的单胞藻培养实践经验进行总结，为大规模单胞藻培养提供参考。
关键词：单胞藻 扩大培养 生产应用
中图分类号：S963.21 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）06（b）-0228-02
单胞藻是水产育苗和养殖的基础饵料，具有营养丰富、适应性强、生长快速和易培养等特点[1-3]。单胞藻种类繁多，富含蛋白质、维生素、多不饱和脂肪酸、活性多糖等，目前也应用于食品业、能源产业等，市场前景十分广阔。
随着养殖产业日趋成熟，大规模的生产性育苗养殖正在开展，对配套的基础饵料单胞藻培养技术提出较高要求。但在单胞藻培养过程中，往往因为各种原因而失败，给生产带来直接影响，严重时致生产无法开展。查阅文献发现，目前研究重点多集中在保种和小规模的培养阶段，对培养条件等做了诸多的阐述[4]，但针对大规模生产性扩大培养具体操作的技术要领鲜少报道。本文对文献中人工育苗生产过程中的单胞藻扩大培养技术进行归纳总结，从单胞藻的扩大培养方法、敌害防治和生产应用情况三个方面做详细阐述。
1 扩大培养方法
1.1 培养用海水
培养用海水需经过消毒杀菌处理后才能使用。过滤海水，即外海海水经沉淀沙滤黑暗处理后导入单胞藻培育车间，经300目以上筛绢袋过滤后加入培育池。接种前用50 g/m3漂白粉处理24 h。池中连续充气，气量小且均匀为好，接种前加入等量的Na2S2O3中和余氯，将气量调大，使其快速溶解中和[5]。一般放置40 min～1 h即可，准确测定使用简易的淀粉碘化钾试剂测定余氯。余氯清除后加入肥料，使用植物生长素50～70 g/m3，溶解后泼洒于培养水中。陈怀定[6]研究发现在单胞藻培养液中添加有机肥，例如酵母膏、发酵鱼粉和鱼汁等，可加长藻类稳定周期。
1.2 培养设施
扩大培养的车间顶为透明的塑料薄膜，两面玻璃，车间内用黑帘等调节光照。培养容器规格小的水泥池或黑桶和规格较大的水泥池等。水泥池内壁及上边缘涂有防水漆，光滑提高吸光性。欧俊新[7]研究提出使用全封闭式塑料薄膜培养金藻的方式，具有节约便宜、易于管理和不易污染的特点，在实践中取得较好效果。
1.3 培养方法
选择晴朗天气，一次性接种即培养容器加满水用于接种藻液，这样既起到池壁消毒的作用又充分利用了培育空间。
选择处于指数生长期的藻种进行接种。将保种室中藻种液接入小规格的培养容器，池底充气，开始气要小，以培养液面有微波为准，通过调整培育池上方的黑色网帘降低光照强度。随着培育时间延长，藻液颜色逐渐变深，可适当调大充气，增强光照强度，但是在天气炎热的正中午，应适当调整光照，防止光线过强引起藻液变质死亡。小池培养一般3～5 d。
用水泵将小池中的藻液接种到大规格的水泥池中，一般为一对一接种。有研究表明培养条件较优时可分扩两池亦能培养，藻液浓度较深要持续培养时，要适当添加肥料，保证营养供给[8]。较浓的藻液可重复增加培养用海水继续培养，实施补充肥料即可。为提高藻类的光合作用效率，适当加入NaHCO3和NaSiO3。大池培养一般3～6d。
金藻类对环境要求较高，严格要求每个接种过程，与其他藻种隔离较好[9-11]。角毛藻类由于其喜光的特性，应在培养过程中加大光照强度，充气不必太大或停止充气，其接种密度也可降低，在光线充足的情况下，角毛藻生长迅速，且不易污染[12-13]。小球藻类由于其沉降性和喜氮的特性，培养过程中始终保持较大气量并在培养过程中加入适量尿素，提高水体中的氮含量[14-15]。扁藻喜磷，培养过程中添加磷肥，提高水体中的磷含量[16]。扁藻在培养条件较好时，可根据生产需求进行高密度的同级扩种，这样既能快速扩大培养又能有效的利用生产空间。
1.4 培养管理措施
单胞藻是利用CO2进行光自养的，通入不同浓度的CO2浓度培养的藻细胞，其pH通过CO2-HCO3-调节，CO2浓度越高pH下降越明显，而pH值对细胞中酶的活性有一定影响，包括亲和CO2的酶，所以适当的CO2浓度可促进藻细胞生长[17-19]。本研究组在藻类培养过程中，通过加入一定浓度的NaHCO3来增加水中CO2浓度，取得了良好的效果。
水温是影响单胞藻生长的最重要因素之一，而华南地区高温天气持续时间较长，所以必须提出有效应对高温的措施。采用低温地下水对藻液进行降温[20-21]，此种方法适用于一、二级藻种，可以保证用于扩种的藻种质量，有一定的借鉴价值，但大规模的藻类培养无法实现。本研究组通过生产实践尝试了几种方法来降低高温影响：适时给封闭车间通风，调整黒帘遮挡强光，加大充气，在车间中间走道泼洒淡水。这些措施一般在天气较炎热、晴朗的时候采用，而且应针对不同的藻种做相应的调整，因为每种藻都有各自的适温范围和最适温度范围。
2 敌害生物防治方法
2.1 培养用车间内的清理消毒
培育设备和工具用洗洁精刷洗干净后用漂白粉融水泼洒或浸泡消毒，2～3 d后淡水冲洗干净，暴晒；在藻类培育前，可对封闭性的车间使用化学性的蒸汽消毒，此类消毒较彻底并且效果较好，但要严格处理方法，操作人员需保护措施，以免造成自身伤害。
2.2 培养用水的消毒
培养用水除了化学处理消毒，用水操作过程应该严格预防污染[22]。加水时过滤用的筛绢袋使用过后一定要仔细清洗消毒，集中放在较干燥通风的位置，每隔一段时间进行一次彻底消毒。营养盐溶解泼洒使用器具也要严格消毒，泼洒操作既要保证均匀又要仔细小心，避免造成很大水浪。培育水尽量避免交叉使用，减少使用步骤，如需间接使用时必须保证对运送工具的消毒。
2.3 接种
为了更好的培养效果，应该选择密度高质量好的藻种和较高的接种量[23]。操作过程中，人工操作较多，要求操作者保持自身清洁，搬运之前用75% （v/v）酒精喷雾消毒，倾倒要快但要防止四溅。而抽水泵扩种则要对水泵和水管严格消毒，在水管头用筛绢袋再次过滤处理，防止原生虫等污染。 2.4 培养管理
首先要避免不同藻种间的污染，做不到分车间培养可分区培养。在蚊虫较多的时候，可在车间使用纱窗，或直接在培育池或桶上方加盖防蚊虫纱网。大规模藻类培养过程亦要以防为主，一旦出现个别池污染，如果达到投喂标准立即使用，否则立即采用化学方法处理并对培育设备进行彻底消毒。
3 生产应用情况
单胞藻的培养是贝类人工育苗的基础。目前大范围的贝类人工育苗生产同时展开，饵料生物单胞藻的需求量急剧增加。而不同饵料组合和浓度对厚壳贻贝的亲贝性腺发育、幼虫和稚贝生长发育产生影响[24]。在目前的贝类人工育苗过程中几种单胞藻的混合投喂效果明显[25]。
4 生产实践总结
目前的单胞藻生产性培养过程中往往混合使用培养容器，在消毒不彻底的情况下导致后面所接藻种被污染。本研究组在生产中将培养容器分类专门使用，在充分利用现有资源的基础上应用的，如1 m3的小池和0.5 m3的黑桶。小池经过防水漆的喷刷，池子内壁较光滑，而且所在车间光线和封闭性较好，故用于培养条件较严格的金藻和角毛藻。在小池数量有限的情况下，黑桶相对的小容积易于存放，其所放车间较通风，可根据实际生产过程进行摆放，对于容易培养的小球藻和扁藻非常有利。根据单胞藻的培养时限，金藻变浓后极易污染变质，不适合长期高浓度培养，需及时使用，可采用连续扩种的方式，所以使用6 m3水泥池。而小球藻和扁藻培养条件比较容易维持，对其生长影响较小，故选择10 m3大池。
近年，本研究组在大獭蛤和织锦巴非蛤等贝类的人工育苗生产过程中开展单胞藻培养研究，取得了较好的效果。金藻和角毛藻培养成功率达到80%以上，小球藻和扁藻培养的成功率达到90%以上。贝类育苗生产过程中，单胞藻的投喂原则：首先选藻，从培养时间长的藻开始使用；其次选优，选择质量较好的藻；再次选次，在藻类生长出现问题且藻类不足时选择污染相对较小的单胞藻。本研究组在2012年9月至12月间，大量培育单胞藻供应几种贝类室内人工育苗，成功育得贝类苗种一亿粒以上。
参考文献
[1] 梁英，孙世春，魏建功.海水生物饵料培养技术[M].青岛：青岛海洋大学出版社，1988.
[2] 沈建忠，陆德祥，张耀群，等.单胞藻的培养及在水产养殖中的应用研究[J].江苏农业科学，2009（3）：283-285.
[3] 陈爱华. 单胞藻饵料在泥蚶人工育苗中的应用研究[J].水产养殖，2002（1）：28-33.
[4] 孙成渤，王小华，宓慧菁.单胞藻的生产性培养[J].水产科学，2005，24（8）：39-40.
[5] 魏国重，裴光富.海水动物育苗中骨条藻的培养技术[J].水产科学，2007，26 （3）：173-174.
[6] 陈怀定.应用有机肥进行金藻规模化培育[J].中国水产，2011（5）：44-45.
[7] 欧俊新.全封闭式塑料薄膜袋培养单胞藻技术[J].水产养殖，2002（4）：11-12.
[8] 郑忠明，金春华，冯坚.牟氏角毛藻的生产性培养技术[J].水产科学，2002，21（6）：20-21.
[9] 王雪青，赵培，胡萍，等.金藻3011的培养条件优化及扩大培养研究[J].食品科学，2006，27（12）：252-259.
[10] 孙颖颖，孙利芹，王长海.球等鞭金藻的培养条件研究[J].海洋通报，2005，24（3）：92-96.
[11] 刘东超，谭金顺，蓝露萌，等.湛江等鞭金藻培养基和培养方法的优化[J].福建水产，2006（4）：77-82.
[12] 林丽芬. 牟氏角毛藻培养技术要点[J]. 水产养殖，2006，27（2）：73.
[13] 田治立，王长海，于贞，等.纤细角毛藻培养条件优化[J].海洋科学，2005，29（2）：5-7.
[14] 封丽，张君，穆斌，等.小球藻生长动力学特征研究[J].三峡环境与生态，2011，33（5）：6-46.
[15] 张正洁，汪苹.自养小球藻培养条件的优化[J].北京工商大学学报，2011，29（1）：54-58.
[16] 于贞，王长海.扁藻培养条件初探[J]. 工业微生物，2005，35（3）：19-22.
[17] 郭祯，陈兆安，陆洪斌，等.二氧化碳对亚心形扁藻培养及直接光照产氢的影响[J].西安交通大学学报，2008，42（6）：779-783.
[18] 梁英，麦康森，孙世春，等.NaHCO3浓度对等鞭藻3011、等鞭藻塔溪堤品系和绿色巴夫藻生长的影响[J].中国水产科学，2001，8（1）：37-40.
[19] 李峰，毛玉泽，于守团，等.充气在几种饵料单细胞藻二级培养中的应用[J].中国农业科技导报，2008，10（2）：94-99.
[20] 刘永，张春芳.华南地区高温季节单胞藻培养技术[J].水产养殖，2007，28（4）：35-37.
[21] 郭兵，龚阳敏，万霞，等.光照和温度对球等鞭金藻（Isochrysis sphaerica）生长及其脂肪酸的影响[J].中国油料作物学报，2011，33（3）：295-301.
[22] 郑春波，于诗群，姜启平，等.扁藻与金藻类生产性培养中的敌害生物的防治技术[J].水产养殖，2004，25（3）：33.
[23] 张文革.单胞藻培养中敌害生物的危害及防治[J].河北渔业，2006，4（8）：36-37.
[24] 杜庆玲，陈纪新.厚壳贻贝苗期饵料培养技术[J].渔业现代化，2001（6）：11-12.
[25] 马斌，周海波，徐继林，等.缢蛏稚贝优质微藻饵料的筛选[J].宁波大学学报，2011，24（4）：5-9.
关键词：单胞藻 扩大培养 生产应用
中图分类号：S963.21 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）06（b）-0228-02
单胞藻是水产育苗和养殖的基础饵料，具有营养丰富、适应性强、生长快速和易培养等特点[1-3]。单胞藻种类繁多，富含蛋白质、维生素、多不饱和脂肪酸、活性多糖等，目前也应用于食品业、能源产业等，市场前景十分广阔。
随着养殖产业日趋成熟，大规模的生产性育苗养殖正在开展，对配套的基础饵料单胞藻培养技术提出较高要求。但在单胞藻培养过程中，往往因为各种原因而失败，给生产带来直接影响，严重时致生产无法开展。查阅文献发现，目前研究重点多集中在保种和小规模的培养阶段，对培养条件等做了诸多的阐述[4]，但针对大规模生产性扩大培养具体操作的技术要领鲜少报道。本文对文献中人工育苗生产过程中的单胞藻扩大培养技术进行归纳总结，从单胞藻的扩大培养方法、敌害防治和生产应用情况三个方面做详细阐述。
1 扩大培养方法
1.1 培养用海水
培养用海水需经过消毒杀菌处理后才能使用。过滤海水，即外海海水经沉淀沙滤黑暗处理后导入单胞藻培育车间，经300目以上筛绢袋过滤后加入培育池。接种前用50 g/m3漂白粉处理24 h。池中连续充气，气量小且均匀为好，接种前加入等量的Na2S2O3中和余氯，将气量调大，使其快速溶解中和[5]。一般放置40 min～1 h即可，准确测定使用简易的淀粉碘化钾试剂测定余氯。余氯清除后加入肥料，使用植物生长素50～70 g/m3，溶解后泼洒于培养水中。陈怀定[6]研究发现在单胞藻培养液中添加有机肥，例如酵母膏、发酵鱼粉和鱼汁等，可加长藻类稳定周期。
1.2 培养设施
扩大培养的车间顶为透明的塑料薄膜，两面玻璃，车间内用黑帘等调节光照。培养容器规格小的水泥池或黑桶和规格较大的水泥池等。水泥池内壁及上边缘涂有防水漆，光滑提高吸光性。欧俊新[7]研究提出使用全封闭式塑料薄膜培养金藻的方式，具有节约便宜、易于管理和不易污染的特点，在实践中取得较好效果。
1.3 培养方法
选择晴朗天气，一次性接种即培养容器加满水用于接种藻液，这样既起到池壁消毒的作用又充分利用了培育空间。
选择处于指数生长期的藻种进行接种。将保种室中藻种液接入小规格的培养容器，池底充气，开始气要小，以培养液面有微波为准，通过调整培育池上方的黑色网帘降低光照强度。随着培育时间延长，藻液颜色逐渐变深，可适当调大充气，增强光照强度，但是在天气炎热的正中午，应适当调整光照，防止光线过强引起藻液变质死亡。小池培养一般3～5 d。
用水泵将小池中的藻液接种到大规格的水泥池中，一般为一对一接种。有研究表明培养条件较优时可分扩两池亦能培养，藻液浓度较深要持续培养时，要适当添加肥料，保证营养供给[8]。较浓的藻液可重复增加培养用海水继续培养，实施补充肥料即可。为提高藻类的光合作用效率，适当加入NaHCO3和NaSiO3。大池培养一般3～6d。
金藻类对环境要求较高，严格要求每个接种过程，与其他藻种隔离较好[9-11]。角毛藻类由于其喜光的特性，应在培养过程中加大光照强度，充气不必太大或停止充气，其接种密度也可降低，在光线充足的情况下，角毛藻生长迅速，且不易污染[12-13]。小球藻类由于其沉降性和喜氮的特性，培养过程中始终保持较大气量并在培养过程中加入适量尿素，提高水体中的氮含量[14-15]。扁藻喜磷，培养过程中添加磷肥，提高水体中的磷含量[16]。扁藻在培养条件较好时，可根据生产需求进行高密度的同级扩种，这样既能快速扩大培养又能有效的利用生产空间。
1.4 培养管理措施
单胞藻是利用CO2进行光自养的，通入不同浓度的CO2浓度培养的藻细胞，其pH通过CO2-HCO3-调节，CO2浓度越高pH下降越明显，而pH值对细胞中酶的活性有一定影响，包括亲和CO2的酶，所以适当的CO2浓度可促进藻细胞生长[17-19]。本研究组在藻类培养过程中，通过加入一定浓度的NaHCO3来增加水中CO2浓度，取得了良好的效果。
水温是影响单胞藻生长的最重要因素之一，而华南地区高温天气持续时间较长，所以必须提出有效应对高温的措施。采用低温地下水对藻液进行降温[20-21]，此种方法适用于一、二级藻种，可以保证用于扩种的藻种质量，有一定的借鉴价值，但大规模的藻类培养无法实现。本研究组通过生产实践尝试了几种方法来降低高温影响：适时给封闭车间通风，调整黒帘遮挡强光，加大充气，在车间中间走道泼洒淡水。这些措施一般在天气较炎热、晴朗的时候采用，而且应针对不同的藻种做相应的调整，因为每种藻都有各自的适温范围和最适温度范围。
2 敌害生物防治方法
2.1 培养用车间内的清理消毒
培育设备和工具用洗洁精刷洗干净后用漂白粉融水泼洒或浸泡消毒，2～3 d后淡水冲洗干净，暴晒；在藻类培育前，可对封闭性的车间使用化学性的蒸汽消毒，此类消毒较彻底并且效果较好，但要严格处理方法，操作人员需保护措施，以免造成自身伤害。
2.2 培养用水的消毒
培养用水除了化学处理消毒，用水操作过程应该严格预防污染[22]。加水时过滤用的筛绢袋使用过后一定要仔细清洗消毒，集中放在较干燥通风的位置，每隔一段时间进行一次彻底消毒。营养盐溶解泼洒使用器具也要严格消毒，泼洒操作既要保证均匀又要仔细小心，避免造成很大水浪。培育水尽量避免交叉使用，减少使用步骤，如需间接使用时必须保证对运送工具的消毒。
2.3 接种
为了更好的培养效果，应该选择密度高质量好的藻种和较高的接种量[23]。操作过程中，人工操作较多，要求操作者保持自身清洁，搬运之前用75% （v/v）酒精喷雾消毒，倾倒要快但要防止四溅。而抽水泵扩种则要对水泵和水管严格消毒，在水管头用筛绢袋再次过滤处理，防止原生虫等污染。 2.4 培养管理
首先要避免不同藻种间的污染，做不到分车间培养可分区培养。在蚊虫较多的时候，可在车间使用纱窗，或直接在培育池或桶上方加盖防蚊虫纱网。大规模藻类培养过程亦要以防为主，一旦出现个别池污染，如果达到投喂标准立即使用，否则立即采用化学方法处理并对培育设备进行彻底消毒。
3 生产应用情况
单胞藻的培养是贝类人工育苗的基础。目前大范围的贝类人工育苗生产同时展开，饵料生物单胞藻的需求量急剧增加。而不同饵料组合和浓度对厚壳贻贝的亲贝性腺发育、幼虫和稚贝生长发育产生影响[24]。在目前的贝类人工育苗过程中几种单胞藻的混合投喂效果明显[25]。
4 生产实践总结
目前的单胞藻生产性培养过程中往往混合使用培养容器，在消毒不彻底的情况下导致后面所接藻种被污染。本研究组在生产中将培养容器分类专门使用，在充分利用现有资源的基础上应用的，如1 m3的小池和0.5 m3的黑桶。小池经过防水漆的喷刷，池子内壁较光滑，而且所在车间光线和封闭性较好，故用于培养条件较严格的金藻和角毛藻。在小池数量有限的情况下，黑桶相对的小容积易于存放，其所放车间较通风，可根据实际生产过程进行摆放，对于容易培养的小球藻和扁藻非常有利。根据单胞藻的培养时限，金藻变浓后极易污染变质，不适合长期高浓度培养，需及时使用，可采用连续扩种的方式，所以使用6 m3水泥池。而小球藻和扁藻培养条件比较容易维持，对其生长影响较小，故选择10 m3大池。
近年，本研究组在大獭蛤和织锦巴非蛤等贝类的人工育苗生产过程中开展单胞藻培养研究，取得了较好的效果。金藻和角毛藻培养成功率达到80%以上，小球藻和扁藻培养的成功率达到90%以上。贝类育苗生产过程中，单胞藻的投喂原则：首先选藻，从培养时间长的藻开始使用；其次选优，选择质量较好的藻；再次选次，在藻类生长出现问题且藻类不足时选择污染相对较小的单胞藻。本研究组在2012年9月至12月间，大量培育单胞藻供应几种贝类室内人工育苗，成功育得贝类苗种一亿粒以上。
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[14] 封丽，张君，穆斌，等.小球藻生长动力学特征研究[J].三峡环境与生态，2011，33（5）：6-46.
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