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为防控猪流行性腹泻病毒(PEDV)病的流行,构建了靶向PEDV NB3-NB6-Fc纳米抗体融合蛋白的真核表达载体,并探究能否在毕赤酵母中分泌表达.通过实验室保存的pUC57-NB3-NB6-Fc质粒,成功构建分泌表达载体pPIC9 K-NB3-NB6-Fc,经SacⅠ酶将其线性化并电转化入毕赤酵母GS115菌株.经过MD、梯度G418-YPD平板和PCR方法筛选多拷贝阳性重组转化子.经鉴定为阳性重组菌株用8 mL/L甲醇在29℃条件下诱导72 h,用SDS-PAGE和Western blot方法检测上清液中重组蛋白的表达情况.结果显示,成功诱导出大小为53.2 ku的分泌型重组蛋白,经Swiss-model在线预测该蛋白具有相对紧密的空间结构.成功获得pPIC9 K-NB3-NB6-Fc-GS115分泌表达菌株,可为PED的预防和治疗提供材料.