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摘要 [目的]探究中华鲟B细胞活化因子（CsBAFF）的分子表征及其与免疫反应相关的潜在功能。[方法]通过免疫刺激后获得中华鲟各组织。结合生物信息学分析，构建和筛选CsBAFF的cDNA文库，并采用定量RT-PCR进行验证分析。采用分子生物学的方法进行CsBAFF的质粒构建及重组sCsBAFF的制备。采用MTT试验检测细胞的增殖，以及结合免疫印迹分析相关蛋白的表达。[结果]克隆了CsBAFF的cDNA，包含765个核苷酸的开放阅读框，编码255个氨基酸，分子量为28.9 kD。CsBAFF具有跨膜结构域、TNF结构域、furin蛋白酶裂解位点、长D-E环、1个潜在的N-连接糖基化位点和2个保守的半胱氨酸残基。CsBAFF基因主要表达于头肾和脾脏，且三价灭活疫苗和聚肌苷酸均能诱导CsBAFF基因表达。重组CsBAFF能促进中华鲟和小鼠淋巴细胞的增殖，其中保守的半胱氨酸残基Cys201和Cys214是CsBAFF发挥生理功能必不可少的位点。[结论]B细胞活化因子（BAFF）是肿瘤坏死因子（TNF）家族成员之一，在B淋巴细胞的增殖、存活、分化和成熟过程中起着重要作用。
关键词 中华鲟;B细胞活化因子;免疫应答
中图分类号 S 917.4 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）18-0105-08
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.026
開放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Molecular Characterization of B Cell-Activating Factor from Chinese Sturgeon （Acipenser Sinensis） and Its Potential Function Related to Immune Response
XIA Ao-wen，LIU Liu，LI Xiao-hua et al （College of Life and Environmental Science，Wenzhou University，Wenzhou，Zhejiang 325035）
Abstract [Objective] To explore the molecular characterization of Chinese sturgeon B cell activating factor （CsBAFF） and its potential functions related to immune response.[Method]Various tissues of Chinese sturgeon were obtained after immune stimulation.Combined with bioinformatics analysis，a cDNA library of CsBAFF was constructed and screened，and quantitative RT-PCR was used for verification and analysis.Using molecular biology methods，the plasmid construction of CsBAFF and the preparation of recombinant sCsBAFF were carried out.The MTT experiment was used to detect cell proliferation，and the expression of related proteins was analyzed in combination with western blotting.[Result]In this study，the cDNA of CsBAFF was cloned.It contains an open reading frame of 765 nucleotides，encodes 255 amino acids，and has a molecular weight of 28.9 kDa.CsBAFF has a transmembrane domain，a TNF domain，a furin protease cleavage site，a long D-E loop，a potential N-linked glycosylation site and two conserved cysteine residues.CsBAFF gene is mainly expressed in head kidney and spleen，and both trivalent inactivated vaccine and polyinosinic acid can induce CsBAFF gene expression.Recombinant CsBAFF can promote the proliferation of Chinese sturgeon and mouse lymphocytes，and the conservative cysteine residues Cys201 and Cys214 are essential sites for CsBAFF to exert its physiological functions.[Conclusion]B cell activating factor （BAFF） is a member of the tumor necrosis factor （TNF） family，which plays an important role in the proliferation，survival，differentiation and maturation of B lymphocytes. Key words Chinese sturgeon;B-cell activating factor;Immune response
基金项目 中国国家基础研究项目（2013CB835301）。
作者简介 夏翱文（1997—），女，河南周口人，硕士研究生，研究方向：活性大分子化学生物学。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事肿瘤免疫与分子生物学研究。
鸣 谢 中科院生物化学与细胞生物学研究所刘晓龙教授和浙江大学徐平龙教授提出宝贵建议。
收稿日期 2021-01-21
TNF超家族成员在免疫系统发育和功能中起着重要作用。其中，B细胞活化因子（BAFF，又称TNFSF13b，BLyS，TALL-1和zTNF4），主要由中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞（DC）和活化T细胞等免疫细胞产生[1-3]，对调节淋巴细胞的活化和存活尤其重要[4-5]。脊椎动物中的BAFF蛋白包含1个跨膜结构域和3个保守的半胱氨酸残基，并且在C端细胞外结构域中的furin蛋白酶共有位点进行蛋白水解加工时，可以以膜结合形式或作为可溶性三聚体配体起作用[6-7]。与其他TNF家族相比，BAFF的晶体结构分析表明，BAFF具有异常长的D-E环（“ Flap”），该环的形成可能是受体结合和类病毒组装过程中潜在的重要區域[8-9]。
BAFF参与先天和适应性免疫反应的调节过程。在哺乳动物中，BAFF在B细胞增殖、分化和存活中起着至关重要的作用[10-12]，并且BAFF具有与3种受体结合的功能，即形成B细胞成熟抗原（BCMA）、跨膜激活剂和亲环蛋白配体相互作用物（TACI）和BAFF受体（BAFF-R或BR3）[13-14]。BAFF-R是与BAFF结合的特殊受体[14]，而TACI和BCMA也与增殖诱导配体（APRIL）相互作用，后者是另一种TNF家族成员，其细胞外结构域与BAFF具有33%的统一性[15]。 BAFF-R和BCMA仅在B细胞上表达，而TACI主要在B细胞和活化的T细胞上表达[16-17]。研究表明，BAFF与BAFF-R的结合介导了B细胞的存活并增强了体液免疫反应，BAFF与BCMA的结合对于长期的浆细胞生物学和抗原呈递很重要，而BAFF与TACI的结合可能会对NF-κB和NFAT信号通路产生负调控[18-19]。 BAFF表达失调可能会导致自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮和类风湿关节炎[20-21]。
有关研究显示，在不同的硬骨鱼[22-30]和软骨鱼[31]中鉴定了BAFF的 cDNA序列。但是，对于中华鲟中BAFF特征和功能知之甚少。中华鲟（Acipenser sinensis）是最原始的物种之一，因其维持软骨鱼类和硬骨鱼类之间的进化特征而被称为水生生物化石。由于中华鲟长期遭到过度捕捞，产卵地破坏及其他人为干扰的威胁，被列为国家一级保护动物[32]。为了进一步了解中华鲟中的BAFF分子进化和免疫应答的调控，笔者进行了中华鲟中的BAFF分子克隆、系统发育分析、表达和生物活性的分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原材料。中华鲟，购自中华鲟繁殖基地，重（315±30） g。小鼠淋巴细胞（RAW264.7），购自中国科学院上海生物科学研究所细胞资源中心。
1.1.2 主要试剂。感受态细胞、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司;cDNA文库构建试剂盒，购自美国Clontech有限公司;MTT试剂盒、Trizol试剂盒、脱脂奶粉、SDS-PAGE凝胶试剂盒、灭菌DEPC水、PVDF膜、RIPA裂解液、小鼠抗His抗体，购自上海碧云天生物技术有限公司;细胞培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、无菌PBS，购自美国Gbico生物技术公司;快速定点诱变试剂盒，购自美国Stratagene公司;RNA吸附柱、卡纳/氨苄霉素、无水乙醇，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.1.3 主要仪器。高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂;超净工作台，苏州市洁新空调净化设备有限公司;水平脱色摇床，江苏海门其林贝尔仪器公司;多功能酶标仪，美国BioTek公司;细胞培养箱，松下健康医疗器械株式会社;烘箱，上海龙跃仪器设备有限公司;荧光定量PCR仪，瑞士Roche公司;恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫刺激。参考文献[33]，将鱼随机分组（每组5只），并通过腹膜内注射200 μL溶于PBS的1.0 mg/mL多肌苷酸聚胞苷酸（ploy（I∶C））（GE，美国）刺激，或用200 μL灭活3价细菌疫苗鳗弧菌（1.0×108集落形成单位/mL），该疫苗是根据前人报道的方法制备[34]。以注射无菌PBS的中华鲟作为对照。在免疫刺激后的预设时间内，从中华鲟（每个时间点5条鱼）中解剖出包括头肾、脾、心脏、肠，脑和肝在内的组织，并立即储存于液氮中，以进行RNA提取和实时定量RT -PCR分析。
1.2.2 cDNA文库的构建和筛选。按照试剂的使用说明，从中华鲟脾脏中分离总RNA，构建中华鲟脾脏的cDNA文库，将所有大于500 bp的cDNA片段插入pDNR-LIB载体，然后转化到DH10B感受态细胞。随机挑选cDNA克隆，在37 ℃下培养过夜，提取含有各种cDNA的质粒。使用T7引物在自动ABI Prism 3730测序仪中对每个cDNA进行5′端测序。
1.2.3 生物信息学分析。使用美国国家生物技术信息中心的BLAST程序分析了中华鲟BAFF（CsBAFF）的cDNA和氨基酸序列（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/），以及CsBAFF的多序列比对使用BioEdit软件执行。使用简单的模块化体系结构研究工具SMART 4.0版（http：//www.Smart.Emblheidelberg.de/）预测蛋白质结构域。预测的furin蛋白酶切割位点用ProP 1.0 Server进行鉴定（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProP/）。系统发育树是使用MEGA 7.0版[35]构建的。 1.2.4 定量RT-PCR分析。按照试剂的使用说明，从实验中华鲟的各种组织中提取总RNA，并用不含RNase的DNase I处理。反转录后，设置 RT-PCR反应程序为50 ℃，30 min;94 ℃，5 min;94 ℃，20 s，30个循环;60 ℃，20 s;72 ℃，20 s。在每次PCR结束时进行扩增产物的熔解曲线分析，以确认仅扩增了一种特异性PCR产物。使用比较阈值循环法（Δct），以β-肌动蛋白作为内部对照，分析CsBAFF表达水平。每个RNA样品重复3次进行qRT-PCR测定。引物序列详见表1。
1.2.5 质粒构建。使用表1中列出的引物，通过PCR扩增CsBAFF的细胞外片段（可溶性CsBAFF，sCsBAFF）的编码序列。PCR产物用Xho I和EcoR V酶消化，并插入到pRSET-α-His载体中以分别构建pRSET-α-His-sCsBAFF质粒。使用快速定点诱变试剂盒将Cys201和Cys210（表1）突变为Ala。所有序列均经生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证。
1.2.6 重组sCsBAFF的制备。用His标签的野生型或突变的sCsBAFF质粒转化到大肠杆菌。在LB培养基中于37 ℃下生长至OD600为0.8，然后在25 ℃下用1 mmol/L异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导12 h。通过以10 000 r/min 离心5 min沉淀细胞，然后在4 ℃的裂解缓冲液（10 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris，1%Triton X-100、0.1 mmol/L PMSF，pH 8.0）中进行超声处理。通过以10 000 r/min 离心30 min去除细胞碎片，并使用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白。通过在4 ℃的PBS中透析过夜，使纯化的重组蛋白复性。将纯化的蛋白质去除内毒素，并将蛋白质浓缩，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后使用小鼠抗His抗体进行蛋白质印迹分析。
1.2.7 细胞培养。使用淋巴细胞分离培养基从脾脏匀浆中分离中华鲟脾细胞。制备的脾细胞在25 ℃的DMEM中培养，DMEM中添加了10%胎牛血清，1%谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素。将小鼠淋巴细胞（RAW264.7）在37 ℃的CO 2培养箱中及添加有10%FBS、100 μg/mL青霉素/链霉素的DMEM中培养。
1.2.8 免疫印迹分析。纯化的重组sCsBAFF蛋白通过10%非变性SDS-PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜上。将膜与小鼠抗His抗体在4 ℃孵育过夜。洗涤3遍后，加入与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体，并在37 ℃下孵育1 h。将膜洗涤3遍，然后检测化学发光增强的蛋白质。
1.2.9 MTT 试验。参考文献[36]，测定中华鲟脾细胞和小鼠淋巴细胞在不同刺激条件下的存活率。使细胞（96孔板中每孔105个细胞）在200 μL培养基中生长，并分别用重组野生型或突变的sCsBAFF蛋白处理48 h。向每个孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL），反应4 h。以1 000 r/min离心10 min后，除去上清液，然后向每孔中加入150 μL DMSO。使用酶标仪在570 nm下测量光密度（OD）值。
1.2.10 数据分析。通过单向方差分析进行数据分析，使用SPSS 20.0软件进行数据处理。在P<0.05水平考虑具有统计学差异。
2 结果与分析
2.1 CsBAFF 的cDNA分析 BAFF作为一种TNF样的细胞因子，对于B淋巴细胞的存活和体内稳态至关重要[37]。通过对中华鲟脾脏的cDNA库进行测序，分离了CsBAFF的全长cDNA克隆（GenBank登录号MH753007）。该cDNA包含1个30 bp的5′-非翻译末端区域（5′-UTR），1个768 bp的开放阅读框和1个845 bp的3′-UTR，其中存在5个潜在的mRNA不稳定基序（ATTTA或ATTTTA）和2个聚腺苷酸化信号（AATAAA），最后1个5 bp位于聚（A）尾巴的上游（图1）。这些序列特征都表明获得了全长cDNA。推导的CsBAFF具有255个氨基酸残基，分子量为28.9 kD。哺乳动物BAFF是一种II型跨膜蛋白，在特征序列基序内由furin蛋白酶加工而成，从而释放了具有生物活性的可溶性BAFF蛋白[38]。 CsBAFF的细胞外存在一个与预测的跨膜结构域（残基15-37）接近的furin蛋白酶切割位点（RTRR），这表明CsBAFF可能以类似于哺乳动物BAFF的方式进行加工。特别是CsBAFF具有保守的长D-E环（称为“ Flap”），这是TNF家族中BAFF独有的[39]。D-E环特异性参与形成BAFF的60聚体复合物，以通过与B细胞上的适当受体结合来实现其生物学活性[19]，这表明CsBAFF可能以多聚体形式发挥作用。并且确定了潜在的N-糖基化位点67NPT69，表明CsBAFF可能需要翻译后的糖基化修饰。
2.2 CsBAFF的系统发育树及生物信息学分析
BLAST分析表明，CsAFF在氨基酸序列水平上与鱼BAFF具有显著同源性，与鱼BAFF同源物具有最高的序列同一性，为56.1%（表2）。不同BAFF分子的系统发育树（图2）表明，所选BAFF蛋白可以分为5个主要的明确定义的簇，其中CsBAFF与鱼类BAFF一起簇集。哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类BAFF之间不同程度的差异可能反映它们的系统发育差异。
CsBAFF與其他脊椎动物BAFF的多序列比对显示了BAFF的比对氨基酸序列之间的差异（图3A），即使对于可能与BAFF的结构和功能潜在相关的关键残基也是如此。例如，一个D/E残基（红色）由于其负电荷而被认为对受体结合很重要[40]，但在对齐的BAFF中并没有那么保守。尽管在整个比对的BAFF中有2个保守Cys残基，但仅在CsBAFF和软骨鱼BAFF中缺失了另一个Cys残基（图3A），考虑到这些保守的Cys，其重要性仍有待研究。BAFF C末端的残基可以在BAFF受体与BAFF三聚体中的每个单体配体之间形成连接[40-41]。尽管在氨基酸水平上存在差异，但是sCsBAFF单体的3D预测结构与人类的非常相似，并且重要的结构氨基酸在相同的空间位置上保守（图3B），进一步表明CsBAFF可能具有与哺乳动物BAFF相似的体内生物学功能。 2.3 CsBAFF 对免疫刺激的反应
使用实时定量RT-PCR检测CsBAFF mRNA在各种组织中的表達（图4）。结果显示，CsBAFF在脾脏、头肾和肠中高表达（P <0.05），而在心脏中的表达很低。据报道，哺乳动物的BAFF基因主要在单核/巨噬细胞和树突状细胞中表达[4]。研究表明，鱼类中BAFF基因通常在脾脏和肾脏中以最高水平表达，如日本海鲈[22]和鱼中[29]，而其他鱼类中的BAFF基因则以普遍存在的方式表达，如日本的草鱼[23]和大黄鱼[24]。硬骨鱼的头部、肾脏和脾脏是淋巴器官，是分化粒细胞、B细胞、T细胞、单核细胞和自然杀伤细胞的主要部位[42-43]。这些器官通过激活淋巴细胞来启动适应性免疫反应，被认为是先天性和适应性免疫反应的主要部位。因此，CsBAFF的组织分布提示CsBAFF参与免疫应答。
为了进一步研究CsBAFF对微生物病原体感染的潜在免疫反应，用灭活的3价细菌疫苗鳗弧菌和被认为是双链RNA合成类似物的聚肌胞苷酸（Poly A∶C）处理了中华鲟。
在免疫激发后的不同时间段分析了CsBAFF基因在头肾、肠、肝和脾中的表达模式。免疫激发后以组织特异性方式显著诱导CsBAFF表达（图5、6）。结果显示，响应于2种免疫刺激，头肾、脾脏和肠中的CsBAFF mRNA差异性表达，并在免疫刺激后72 h达到最高水平，但在肝脏中均不显著上调。与对照相比（图5），疫苗诱导的mRNA表达水平在脾脏中分别增加了750%（P<0.05），在头肾中增加了550%（P<0.05），在肠中增加了390%（P<0.05）。由图6可知，由poly（I∶C）诱导的CsBAFF mRNA表达在脾脏中增加了480%（P<0.05），在头肾中增加了730%（P<0.05），在肠中增加了170%（P<0.05）。在达到最高水平后，诱导的CsBAFF mRNA表达随后下降。在该研究中，细菌和病毒感染导致CsBAFF表达增加的发现表明，CsBAFF是多种病原体的重要免疫基因，在对病原体入侵的免疫反应中起着与哺乳动物BAFF类似的作用[44]。
2.4 sCsBAFF 刺激淋巴细胞增殖
BAFF是一种II型膜蛋白，可以通过furin蛋白酶在细胞表面形成可溶形式。多聚体形式的细胞外片段（可溶性BAFF）具有与膜结合BAFF相似的生物学活性[1-2]。为了研究CsBAFF蛋白的活性，笔者用pET28a质粒在大肠杆菌中表达了CsBAFF（sCsBAFF）的可溶性成熟部分。纯化的sCsBAFF蛋白质印迹分析显示，在未变性的条件下，在约22 kD处有一条明显的条带（单体形式的sCsBAFF），但纯化的sCsBAFF变性后出现了多聚sCsBAFF的条带（图7A），表明成功制备了sCsBAFF可溶性形式的重组sCsBAFF蛋白。用未变性或变性的sCsBAFF处理从中华鲟和小鼠脾脏B细胞中分离出的脾淋巴细胞。结果显示，与对照培养物相比，经sCsBAFF处理的中华鲟脾淋巴细胞的绝对数量要多于对照培养物（图7B），在经过重组sCsBAFF处理的小鼠脾脏B细胞培养物中也可发现相似的结果（图7C）。但是，未变性的sCsBAFF对这些淋巴细胞的增殖没有明显的影响（图7B、图7C）。因此可以得出结论，sCsBAFF可能会提高存活率或诱导脾脏B细胞的选择性增殖。这些发现与先前的研究吻合，表明BAFF-BAFFR相互作用对于脾脏B细胞的存活和成熟必不可少[45]。另外，该同时突变了CsBAFF中的Cys201和Cys214残基，其在所有比对的BAFF分子中高度保守。出乎意料的是，甚至在复性后也几乎没有多聚sCsBAFF带（图7A）。因此，变性或未变性的sCsBAFF都不会刺激中华鲟脾脏淋巴细胞和小鼠脾脏B细胞的增殖（图7B、图7C）。这些结果进一步证明，sCsBAFF主要以多聚体的形式起作用，并证明了2个保守的半胱氨酸残基在BAFF功能中具有重要作用。
3 结论
该研究克隆了中华鲟 BAFF的全长cDNA，根据该序列分析了蛋白质的结构，证明了其在正常组织中的表达以及对细菌和病毒感染的抵抗力，并研究了其在体外促进淋巴细胞增殖的生物活性。该研究结果表明，CsBAFF可能是通过调节淋巴细胞增殖来抵抗细菌和病毒感染的重要免疫基因，为鱼免疫系统研究提供了新见解。
参考文献
[1]
MOORE P A，BELVEDERE O，ORR A，et al.BLyS：Member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator[J].Science，1999，285（5425）：260-263.
[2] NARDELLI B，BELVEDERE O，ROSCHKE V，et al.Synthesis and release of B-lymphocyte stimulator from myeloid cells[J].Blood，2001，97（1）：198-204.
[3] MACKAY F，SILVEIRA P A，BRINK R.B cells and the BAFF/APRIL axis：Fast-forward on autoimmunity and signaling[J].Curr Opin Immunol，2007，19（3）：327-336.
[4] SCHNEIDER P，MACKAY F，STEINER V，et al.BAFF，a novel ligand of the tumor necrosis factor family，stimulates B cell growth[J].J Exp Med，1999，189（11）：1747-1756. [5] MACKAY F，SCHNEIDER P，RENNERT P，et al.BAFF AND APRIL：A tutorial on B cell survival[J].Annu Rev Immunol，2003，21：231-264.
[6] KALLED S L.Impact of the BAFF/BR3 axis on B cell survival，germinal center maintenance and antibody production[J].Semin Immunol，2006，18（5）：290-296.
[7] CUI X W，LI J F，XIAO W，et al.Molecular cloning，expression and functional analysis of TNF13b （BAFF） in Japanese sea perch，Lateolabrax japonicus[J].Int Immunopharmacol，2012，12（1）：34-41.
[8] KARPUSAS M，CACHERO T G，QIAN F，et al.Crystal structure of extracellular human BAFF，a TNF family member that stimulates B lymphocytes[J].J Mol Biol，2002，315（5）：1145-1154.
[9] LIU Y，XU L，OPALKA N，et al.Crystal structure of sTALL-1 reveals a virus-like assembly of TNF family ligands[J].Cell，2002，108（3）：383-394.
[10] BOSSEN C，SCHNEIDER P.BAFF，APRIL and their receptors：Structure，function and signaling[J].Semin Immunol，2006，18（5）：263-275.
[11] BATTEN M，GROOM J，CACHERO T G，et al.BAFF mediates survival of peripheral immature B lymphocytes[J].J Exp Med，2000，192（10）：1453-1466.
[12] KHARE S D，SAROSI I，XIA X Z，et al.Severe B cell hyperplasia and autoimmune disease in TALL-1 transgenic mice[J].PNAS，2000，97（7）：3370-3375.
[13] GROSS J A，JOHNSTON J，MUDRI S，et al.TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease[J].Nature，2000，404（6781）：995-999.
[14] THOMPSON J S，BIXLER S A，QIAN F，et al.BAFF-R，a newly identified TNF receptor that specifically interacts with BAFF[J].Sciece，2001，293（5537）：2108-2111.
[15] MARSTERS S A，YAN M H，PITTI R M，et al.Interaction of the TNF homologues BLyS and APRIL with the TNF receptor homologues BCMA and TACI[J].Curr Biol，2000，10（13）：785-788.
[16] SALAZAR-CAMARENA D C，ORT Z-LAZARENO P，MAR N-ROSALES M，et al.BAFF-R and TACI expression on CD3+ T cells：Interplay among BAFF，APRIL and T helper cytokines profile in systemic lupus erythematosus[J].Cytokine，2019，114：115-127.
[17] NG L G，SUTHERLAND A P R，NEWTON R，et al.B cell-activating factor belonging to the TNF family （BAFF）-R is the principal BAFF receptor facilitating BAFF costimulation of circulating T and B cells[J].J Immunol，2004，173（2）：807-817.
[18] NGUYEN T G，MORRIS J M.Signals from activation of B-cell receptor with anti-IgD can override the stimulatory effects of excess BAFF on mature B cells in vivo[J].Immunol Lett，2014，161（1）：157-164.
[19] BOSSEN C，SCHNEIDER P.BAFF，APRIL and their receptors：Structure，function and signaling[J].Semin Immunol，2006，18（5）：263-275. [20] STERI M，ORR V，IDDA M L，et al.Overexpression of the cytokine BAFF and autoimmunity risk[J].N Engl J Med，2017，376（17）：1615-1626.
[21] COMABELLA M.Neuroimmunology：B cells and variant BAFF in autoimmune disease[J].Nat Rev Neurol，2017，13（8）：453-454.
[22] LIANG Z，KONG Y，LUO C，et al.Molecular cloning，functional characterization and phylogenetic analysis of B-cell activating factor in zebrafish （Danio rerio）[J].Fish Shellfish Immunol，2010，29（2）：233-240.
[23] GODAHEWA G I，PERERA N C N，UMASUTHAN N，et al.Molecular characterization and expression analysis of B cell activating factor from rock bream （Oplegnathus fasciatus）[J].Dev Comp Immunol，2016，55：1-11.
[24] PANDIT P，SHEN Y B，WANG W J，et al.Identification of TNF13b （BAFF） gene from grass carp （Ctenopharyngodon idella） and its immune response to bacteria and virus[J].Dev Comp Immunol，2013，39（4）：460-464.
[25] XIAO W，LONG W，LIU G Y，et al.Molecular cloning，expression and functional analysis of B-cell activating factor （BAFF） in yellow grouper，Epinephelus awoara[J].Mol Immunol，2014，59（1）：64-70.
[26] MENG F Q，SUN Y N，XU T J.Comparative genomic of the BAFF and BAFF-like genes and immune response to bacteria of miiuy croaker （Miichthys miiuy）[J].Fish Shellfish Immunol，2015，43（1）：191-199.
[27] LIU H，ZHANG J，LI J，et al.Molecular structure，distribution，and immunology function of TNFSF13B （BAFF） in Nile tilapia （Oreochromis niloticus）[J].Fish Shellfish Immunol，2016，51：240-250.
[28] BASU M，LENKA S S，PAICHHA M，et al.B cell activating factor is induced by toll-like receptor and NOD-like receptor-ligands and plays critical role in IgM synthesis in Labeo rohita[J].Mol Immunol，2016，78：9-26.
[29] GRANJA A G，HOLLAND J W，PIGNATELLI J，et al.Characterization of BAFF and APRIL subfamily receptors in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）.Potential role of the BAFF/APRIL axis in the pathogenesis of proliferative kidney disease[J].PLoS One，2017，12（3）：1-24.
[30] AI H X，SHEN Y F，MIN C，et al.Molecular structure，expression and bioactivity characterization of TNF13B （BAFF） gene in mefugu，Takifugu obscurus[J].Fish Shellfish Immunol，2011，30（6）：1265-1274.
[31] LI R G，DOOLEY H，WANG T H，et al.Characterisation and expression analysis of B-cell activating factor （BAFF） in spiny dogfish （Squalus acanthias）：Cartilaginous fish BAFF has a unique extra exon that may impact receptor binding[J].Dev Comp Immunol，2012，36（4）：707-717.
[32] BIRSTEIN V J，BEMIS W E，WALDMAN J R.The threatened status of acipenseriform species：A summary[J].Environ Biol Fishes，1997，48：427-435. [33] LIAO Z Y，CHEN X J，NIE D S，et al.A RING finger protein 114 （RNF114） homolog from Chinese sturgeon （Acipenser sinensis） possesses immune-regulation properties via modulating RIG-I signaling pathway-mediated interferon expression[J].Fish Shellfish Immunol，2014，41（2）：507-516.
[34] ZHENG W B，TIAN C，CHEN X H.Molecular characterization of goose-type lysozyme homologue of large yellow croaker and its involvement in immune response induced by trivalent bacterial vaccine as an acute-phase protein[J].Immunol Lett，2007，113（2）：107-116.
[35] KUMAR S，STECHER G，TAMURA K.MEGA7：Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J].Mol Biol Evol，2016，33（7）：1870-1874.
[36] SPINNER D M.MTT growth assays in ovarian cancer[J].Methods Mol Med，2001，39：175-177.
[37] FIGGETT W A，VINCENT F B，SAULEP-EASTON D，et al.Roles of ligands from the TNF superfamily in B cell development，function，and regulation[J].Semin Immunol，2014，26（3）：191-202.
[38] MEINL E，THALER F S，LICHTENTHALER S F.Shedding of BAFF/APRIL receptors controls B cells[J].Trends Immunol，2018，39（9）：673-676.
[39] VIGOLO M，CHAMBERS M G，WILLEN L，et al.A loop region of BAFF controls B cell survival and regulates recognition by different inhibitors[J].Nat Commun，2018，9（1199）：1-15.
[40] KIM H M，YU K S，LEE M E，et al.Crystal structure of the BAFF-BAFF-R complex and its implications for receptor activation[J].Nat Struct Biol，2003，10（5）：342-348.
[41] BRINK R.Regulation of B cell self-tolerance by BAFF[J].Semin Immunol，2006，18（5）：276-283.
[42] SALINAS I，ZHANG Y A，SUNYER J O.Mucosal immunoglobulins and B cells of teleost fish[J].Dev Comp Immunol，2011，35（12）：1346-1365.
[43] ROMANO N，CECCARIGLIA S，ABELLI L，et al.Lymphomyeloid organs of the Antarctic fish Trematomus nicolai and Chionodraco hamatus （Teleostei：Notothenioidea）：A comparative histological study[J].Polar Biol，2000，23：321-328.
[44] SAKAI J，AKKOYUNLU M.The role of BAFF system molecules in host response to pathogens[J].Clin Microbiol Rev，2017，30：991-1014.
[45] SMULSKI C R，EIBEL H.BAFF and BAFF-receptor in B cell selection and survival[J].Front Immunol，2018，9：1-10.
关键词 中华鲟;B细胞活化因子;免疫应答
中图分类号 S 917.4 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）18-0105-08
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.026
開放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Molecular Characterization of B Cell-Activating Factor from Chinese Sturgeon （Acipenser Sinensis） and Its Potential Function Related to Immune Response
XIA Ao-wen，LIU Liu，LI Xiao-hua et al （College of Life and Environmental Science，Wenzhou University，Wenzhou，Zhejiang 325035）
Abstract [Objective] To explore the molecular characterization of Chinese sturgeon B cell activating factor （CsBAFF） and its potential functions related to immune response.[Method]Various tissues of Chinese sturgeon were obtained after immune stimulation.Combined with bioinformatics analysis，a cDNA library of CsBAFF was constructed and screened，and quantitative RT-PCR was used for verification and analysis.Using molecular biology methods，the plasmid construction of CsBAFF and the preparation of recombinant sCsBAFF were carried out.The MTT experiment was used to detect cell proliferation，and the expression of related proteins was analyzed in combination with western blotting.[Result]In this study，the cDNA of CsBAFF was cloned.It contains an open reading frame of 765 nucleotides，encodes 255 amino acids，and has a molecular weight of 28.9 kDa.CsBAFF has a transmembrane domain，a TNF domain，a furin protease cleavage site，a long D-E loop，a potential N-linked glycosylation site and two conserved cysteine residues.CsBAFF gene is mainly expressed in head kidney and spleen，and both trivalent inactivated vaccine and polyinosinic acid can induce CsBAFF gene expression.Recombinant CsBAFF can promote the proliferation of Chinese sturgeon and mouse lymphocytes，and the conservative cysteine residues Cys201 and Cys214 are essential sites for CsBAFF to exert its physiological functions.[Conclusion]B cell activating factor （BAFF） is a member of the tumor necrosis factor （TNF） family，which plays an important role in the proliferation，survival，differentiation and maturation of B lymphocytes. Key words Chinese sturgeon;B-cell activating factor;Immune response
基金项目 中国国家基础研究项目（2013CB835301）。
作者简介 夏翱文（1997—），女，河南周口人，硕士研究生，研究方向：活性大分子化学生物学。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事肿瘤免疫与分子生物学研究。
鸣 谢 中科院生物化学与细胞生物学研究所刘晓龙教授和浙江大学徐平龙教授提出宝贵建议。
收稿日期 2021-01-21
TNF超家族成员在免疫系统发育和功能中起着重要作用。其中，B细胞活化因子（BAFF，又称TNFSF13b，BLyS，TALL-1和zTNF4），主要由中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞（DC）和活化T细胞等免疫细胞产生[1-3]，对调节淋巴细胞的活化和存活尤其重要[4-5]。脊椎动物中的BAFF蛋白包含1个跨膜结构域和3个保守的半胱氨酸残基，并且在C端细胞外结构域中的furin蛋白酶共有位点进行蛋白水解加工时，可以以膜结合形式或作为可溶性三聚体配体起作用[6-7]。与其他TNF家族相比，BAFF的晶体结构分析表明，BAFF具有异常长的D-E环（“ Flap”），该环的形成可能是受体结合和类病毒组装过程中潜在的重要區域[8-9]。
BAFF参与先天和适应性免疫反应的调节过程。在哺乳动物中，BAFF在B细胞增殖、分化和存活中起着至关重要的作用[10-12]，并且BAFF具有与3种受体结合的功能，即形成B细胞成熟抗原（BCMA）、跨膜激活剂和亲环蛋白配体相互作用物（TACI）和BAFF受体（BAFF-R或BR3）[13-14]。BAFF-R是与BAFF结合的特殊受体[14]，而TACI和BCMA也与增殖诱导配体（APRIL）相互作用，后者是另一种TNF家族成员，其细胞外结构域与BAFF具有33%的统一性[15]。 BAFF-R和BCMA仅在B细胞上表达，而TACI主要在B细胞和活化的T细胞上表达[16-17]。研究表明，BAFF与BAFF-R的结合介导了B细胞的存活并增强了体液免疫反应，BAFF与BCMA的结合对于长期的浆细胞生物学和抗原呈递很重要，而BAFF与TACI的结合可能会对NF-κB和NFAT信号通路产生负调控[18-19]。 BAFF表达失调可能会导致自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮和类风湿关节炎[20-21]。
有关研究显示，在不同的硬骨鱼[22-30]和软骨鱼[31]中鉴定了BAFF的 cDNA序列。但是，对于中华鲟中BAFF特征和功能知之甚少。中华鲟（Acipenser sinensis）是最原始的物种之一，因其维持软骨鱼类和硬骨鱼类之间的进化特征而被称为水生生物化石。由于中华鲟长期遭到过度捕捞，产卵地破坏及其他人为干扰的威胁，被列为国家一级保护动物[32]。为了进一步了解中华鲟中的BAFF分子进化和免疫应答的调控，笔者进行了中华鲟中的BAFF分子克隆、系统发育分析、表达和生物活性的分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原材料。中华鲟，购自中华鲟繁殖基地，重（315±30） g。小鼠淋巴细胞（RAW264.7），购自中国科学院上海生物科学研究所细胞资源中心。
1.1.2 主要试剂。感受态细胞、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司;cDNA文库构建试剂盒，购自美国Clontech有限公司;MTT试剂盒、Trizol试剂盒、脱脂奶粉、SDS-PAGE凝胶试剂盒、灭菌DEPC水、PVDF膜、RIPA裂解液、小鼠抗His抗体，购自上海碧云天生物技术有限公司;细胞培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、无菌PBS，购自美国Gbico生物技术公司;快速定点诱变试剂盒，购自美国Stratagene公司;RNA吸附柱、卡纳/氨苄霉素、无水乙醇，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.1.3 主要仪器。高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂;超净工作台，苏州市洁新空调净化设备有限公司;水平脱色摇床，江苏海门其林贝尔仪器公司;多功能酶标仪，美国BioTek公司;细胞培养箱，松下健康医疗器械株式会社;烘箱，上海龙跃仪器设备有限公司;荧光定量PCR仪，瑞士Roche公司;恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫刺激。参考文献[33]，将鱼随机分组（每组5只），并通过腹膜内注射200 μL溶于PBS的1.0 mg/mL多肌苷酸聚胞苷酸（ploy（I∶C））（GE，美国）刺激，或用200 μL灭活3价细菌疫苗鳗弧菌（1.0×108集落形成单位/mL），该疫苗是根据前人报道的方法制备[34]。以注射无菌PBS的中华鲟作为对照。在免疫刺激后的预设时间内，从中华鲟（每个时间点5条鱼）中解剖出包括头肾、脾、心脏、肠，脑和肝在内的组织，并立即储存于液氮中，以进行RNA提取和实时定量RT -PCR分析。
1.2.2 cDNA文库的构建和筛选。按照试剂的使用说明，从中华鲟脾脏中分离总RNA，构建中华鲟脾脏的cDNA文库，将所有大于500 bp的cDNA片段插入pDNR-LIB载体，然后转化到DH10B感受态细胞。随机挑选cDNA克隆，在37 ℃下培养过夜，提取含有各种cDNA的质粒。使用T7引物在自动ABI Prism 3730测序仪中对每个cDNA进行5′端测序。
1.2.3 生物信息学分析。使用美国国家生物技术信息中心的BLAST程序分析了中华鲟BAFF（CsBAFF）的cDNA和氨基酸序列（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/），以及CsBAFF的多序列比对使用BioEdit软件执行。使用简单的模块化体系结构研究工具SMART 4.0版（http：//www.Smart.Emblheidelberg.de/）预测蛋白质结构域。预测的furin蛋白酶切割位点用ProP 1.0 Server进行鉴定（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProP/）。系统发育树是使用MEGA 7.0版[35]构建的。 1.2.4 定量RT-PCR分析。按照试剂的使用说明，从实验中华鲟的各种组织中提取总RNA，并用不含RNase的DNase I处理。反转录后，设置 RT-PCR反应程序为50 ℃，30 min;94 ℃，5 min;94 ℃，20 s，30个循环;60 ℃，20 s;72 ℃，20 s。在每次PCR结束时进行扩增产物的熔解曲线分析，以确认仅扩增了一种特异性PCR产物。使用比较阈值循环法（Δct），以β-肌动蛋白作为内部对照，分析CsBAFF表达水平。每个RNA样品重复3次进行qRT-PCR测定。引物序列详见表1。
1.2.5 质粒构建。使用表1中列出的引物，通过PCR扩增CsBAFF的细胞外片段（可溶性CsBAFF，sCsBAFF）的编码序列。PCR产物用Xho I和EcoR V酶消化，并插入到pRSET-α-His载体中以分别构建pRSET-α-His-sCsBAFF质粒。使用快速定点诱变试剂盒将Cys201和Cys210（表1）突变为Ala。所有序列均经生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证。
1.2.6 重组sCsBAFF的制备。用His标签的野生型或突变的sCsBAFF质粒转化到大肠杆菌。在LB培养基中于37 ℃下生长至OD600为0.8，然后在25 ℃下用1 mmol/L异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导12 h。通过以10 000 r/min 离心5 min沉淀细胞，然后在4 ℃的裂解缓冲液（10 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris，1%Triton X-100、0.1 mmol/L PMSF，pH 8.0）中进行超声处理。通过以10 000 r/min 离心30 min去除细胞碎片，并使用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白。通过在4 ℃的PBS中透析过夜，使纯化的重组蛋白复性。将纯化的蛋白质去除内毒素，并将蛋白质浓缩，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后使用小鼠抗His抗体进行蛋白质印迹分析。
1.2.7 细胞培养。使用淋巴细胞分离培养基从脾脏匀浆中分离中华鲟脾细胞。制备的脾细胞在25 ℃的DMEM中培养，DMEM中添加了10%胎牛血清，1%谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素。将小鼠淋巴细胞（RAW264.7）在37 ℃的CO 2培养箱中及添加有10%FBS、100 μg/mL青霉素/链霉素的DMEM中培养。
1.2.8 免疫印迹分析。纯化的重组sCsBAFF蛋白通过10%非变性SDS-PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜上。将膜与小鼠抗His抗体在4 ℃孵育过夜。洗涤3遍后，加入与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体，并在37 ℃下孵育1 h。将膜洗涤3遍，然后检测化学发光增强的蛋白质。
1.2.9 MTT 试验。参考文献[36]，测定中华鲟脾细胞和小鼠淋巴细胞在不同刺激条件下的存活率。使细胞（96孔板中每孔105个细胞）在200 μL培养基中生长，并分别用重组野生型或突变的sCsBAFF蛋白处理48 h。向每个孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL），反应4 h。以1 000 r/min离心10 min后，除去上清液，然后向每孔中加入150 μL DMSO。使用酶标仪在570 nm下测量光密度（OD）值。
1.2.10 数据分析。通过单向方差分析进行数据分析，使用SPSS 20.0软件进行数据处理。在P<0.05水平考虑具有统计学差异。
2 结果与分析
2.1 CsBAFF 的cDNA分析 BAFF作为一种TNF样的细胞因子，对于B淋巴细胞的存活和体内稳态至关重要[37]。通过对中华鲟脾脏的cDNA库进行测序，分离了CsBAFF的全长cDNA克隆（GenBank登录号MH753007）。该cDNA包含1个30 bp的5′-非翻译末端区域（5′-UTR），1个768 bp的开放阅读框和1个845 bp的3′-UTR，其中存在5个潜在的mRNA不稳定基序（ATTTA或ATTTTA）和2个聚腺苷酸化信号（AATAAA），最后1个5 bp位于聚（A）尾巴的上游（图1）。这些序列特征都表明获得了全长cDNA。推导的CsBAFF具有255个氨基酸残基，分子量为28.9 kD。哺乳动物BAFF是一种II型跨膜蛋白，在特征序列基序内由furin蛋白酶加工而成，从而释放了具有生物活性的可溶性BAFF蛋白[38]。 CsBAFF的细胞外存在一个与预测的跨膜结构域（残基15-37）接近的furin蛋白酶切割位点（RTRR），这表明CsBAFF可能以类似于哺乳动物BAFF的方式进行加工。特别是CsBAFF具有保守的长D-E环（称为“ Flap”），这是TNF家族中BAFF独有的[39]。D-E环特异性参与形成BAFF的60聚体复合物，以通过与B细胞上的适当受体结合来实现其生物学活性[19]，这表明CsBAFF可能以多聚体形式发挥作用。并且确定了潜在的N-糖基化位点67NPT69，表明CsBAFF可能需要翻译后的糖基化修饰。
2.2 CsBAFF的系统发育树及生物信息学分析
BLAST分析表明，CsAFF在氨基酸序列水平上与鱼BAFF具有显著同源性，与鱼BAFF同源物具有最高的序列同一性，为56.1%（表2）。不同BAFF分子的系统发育树（图2）表明，所选BAFF蛋白可以分为5个主要的明确定义的簇，其中CsBAFF与鱼类BAFF一起簇集。哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类BAFF之间不同程度的差异可能反映它们的系统发育差异。
CsBAFF與其他脊椎动物BAFF的多序列比对显示了BAFF的比对氨基酸序列之间的差异（图3A），即使对于可能与BAFF的结构和功能潜在相关的关键残基也是如此。例如，一个D/E残基（红色）由于其负电荷而被认为对受体结合很重要[40]，但在对齐的BAFF中并没有那么保守。尽管在整个比对的BAFF中有2个保守Cys残基，但仅在CsBAFF和软骨鱼BAFF中缺失了另一个Cys残基（图3A），考虑到这些保守的Cys，其重要性仍有待研究。BAFF C末端的残基可以在BAFF受体与BAFF三聚体中的每个单体配体之间形成连接[40-41]。尽管在氨基酸水平上存在差异，但是sCsBAFF单体的3D预测结构与人类的非常相似，并且重要的结构氨基酸在相同的空间位置上保守（图3B），进一步表明CsBAFF可能具有与哺乳动物BAFF相似的体内生物学功能。 2.3 CsBAFF 对免疫刺激的反应
使用实时定量RT-PCR检测CsBAFF mRNA在各种组织中的表達（图4）。结果显示，CsBAFF在脾脏、头肾和肠中高表达（P <0.05），而在心脏中的表达很低。据报道，哺乳动物的BAFF基因主要在单核/巨噬细胞和树突状细胞中表达[4]。研究表明，鱼类中BAFF基因通常在脾脏和肾脏中以最高水平表达，如日本海鲈[22]和鱼中[29]，而其他鱼类中的BAFF基因则以普遍存在的方式表达，如日本的草鱼[23]和大黄鱼[24]。硬骨鱼的头部、肾脏和脾脏是淋巴器官，是分化粒细胞、B细胞、T细胞、单核细胞和自然杀伤细胞的主要部位[42-43]。这些器官通过激活淋巴细胞来启动适应性免疫反应，被认为是先天性和适应性免疫反应的主要部位。因此，CsBAFF的组织分布提示CsBAFF参与免疫应答。
为了进一步研究CsBAFF对微生物病原体感染的潜在免疫反应，用灭活的3价细菌疫苗鳗弧菌和被认为是双链RNA合成类似物的聚肌胞苷酸（Poly A∶C）处理了中华鲟。
在免疫激发后的不同时间段分析了CsBAFF基因在头肾、肠、肝和脾中的表达模式。免疫激发后以组织特异性方式显著诱导CsBAFF表达（图5、6）。结果显示，响应于2种免疫刺激，头肾、脾脏和肠中的CsBAFF mRNA差异性表达，并在免疫刺激后72 h达到最高水平，但在肝脏中均不显著上调。与对照相比（图5），疫苗诱导的mRNA表达水平在脾脏中分别增加了750%（P<0.05），在头肾中增加了550%（P<0.05），在肠中增加了390%（P<0.05）。由图6可知，由poly（I∶C）诱导的CsBAFF mRNA表达在脾脏中增加了480%（P<0.05），在头肾中增加了730%（P<0.05），在肠中增加了170%（P<0.05）。在达到最高水平后，诱导的CsBAFF mRNA表达随后下降。在该研究中，细菌和病毒感染导致CsBAFF表达增加的发现表明，CsBAFF是多种病原体的重要免疫基因，在对病原体入侵的免疫反应中起着与哺乳动物BAFF类似的作用[44]。
2.4 sCsBAFF 刺激淋巴细胞增殖
BAFF是一种II型膜蛋白，可以通过furin蛋白酶在细胞表面形成可溶形式。多聚体形式的细胞外片段（可溶性BAFF）具有与膜结合BAFF相似的生物学活性[1-2]。为了研究CsBAFF蛋白的活性，笔者用pET28a质粒在大肠杆菌中表达了CsBAFF（sCsBAFF）的可溶性成熟部分。纯化的sCsBAFF蛋白质印迹分析显示，在未变性的条件下，在约22 kD处有一条明显的条带（单体形式的sCsBAFF），但纯化的sCsBAFF变性后出现了多聚sCsBAFF的条带（图7A），表明成功制备了sCsBAFF可溶性形式的重组sCsBAFF蛋白。用未变性或变性的sCsBAFF处理从中华鲟和小鼠脾脏B细胞中分离出的脾淋巴细胞。结果显示，与对照培养物相比，经sCsBAFF处理的中华鲟脾淋巴细胞的绝对数量要多于对照培养物（图7B），在经过重组sCsBAFF处理的小鼠脾脏B细胞培养物中也可发现相似的结果（图7C）。但是，未变性的sCsBAFF对这些淋巴细胞的增殖没有明显的影响（图7B、图7C）。因此可以得出结论，sCsBAFF可能会提高存活率或诱导脾脏B细胞的选择性增殖。这些发现与先前的研究吻合，表明BAFF-BAFFR相互作用对于脾脏B细胞的存活和成熟必不可少[45]。另外，该同时突变了CsBAFF中的Cys201和Cys214残基，其在所有比对的BAFF分子中高度保守。出乎意料的是，甚至在复性后也几乎没有多聚sCsBAFF带（图7A）。因此，变性或未变性的sCsBAFF都不会刺激中华鲟脾脏淋巴细胞和小鼠脾脏B细胞的增殖（图7B、图7C）。这些结果进一步证明，sCsBAFF主要以多聚体的形式起作用，并证明了2个保守的半胱氨酸残基在BAFF功能中具有重要作用。
3 结论
该研究克隆了中华鲟 BAFF的全长cDNA，根据该序列分析了蛋白质的结构，证明了其在正常组织中的表达以及对细菌和病毒感染的抵抗力，并研究了其在体外促进淋巴细胞增殖的生物活性。该研究结果表明，CsBAFF可能是通过调节淋巴细胞增殖来抵抗细菌和病毒感染的重要免疫基因，为鱼免疫系统研究提供了新见解。
参考文献
[1]
MOORE P A，BELVEDERE O，ORR A，et al.BLyS：Member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator[J].Science，1999，285（5425）：260-263.
[2] NARDELLI B，BELVEDERE O，ROSCHKE V，et al.Synthesis and release of B-lymphocyte stimulator from myeloid cells[J].Blood，2001，97（1）：198-204.
[3] MACKAY F，SILVEIRA P A，BRINK R.B cells and the BAFF/APRIL axis：Fast-forward on autoimmunity and signaling[J].Curr Opin Immunol，2007，19（3）：327-336.
[4] SCHNEIDER P，MACKAY F，STEINER V，et al.BAFF，a novel ligand of the tumor necrosis factor family，stimulates B cell growth[J].J Exp Med，1999，189（11）：1747-1756. [5] MACKAY F，SCHNEIDER P，RENNERT P，et al.BAFF AND APRIL：A tutorial on B cell survival[J].Annu Rev Immunol，2003，21：231-264.
[6] KALLED S L.Impact of the BAFF/BR3 axis on B cell survival，germinal center maintenance and antibody production[J].Semin Immunol，2006，18（5）：290-296.
[7] CUI X W，LI J F，XIAO W，et al.Molecular cloning，expression and functional analysis of TNF13b （BAFF） in Japanese sea perch，Lateolabrax japonicus[J].Int Immunopharmacol，2012，12（1）：34-41.
[8] KARPUSAS M，CACHERO T G，QIAN F，et al.Crystal structure of extracellular human BAFF，a TNF family member that stimulates B lymphocytes[J].J Mol Biol，2002，315（5）：1145-1154.
[9] LIU Y，XU L，OPALKA N，et al.Crystal structure of sTALL-1 reveals a virus-like assembly of TNF family ligands[J].Cell，2002，108（3）：383-394.
[10] BOSSEN C，SCHNEIDER P.BAFF，APRIL and their receptors：Structure，function and signaling[J].Semin Immunol，2006，18（5）：263-275.
[11] BATTEN M，GROOM J，CACHERO T G，et al.BAFF mediates survival of peripheral immature B lymphocytes[J].J Exp Med，2000，192（10）：1453-1466.
[12] KHARE S D，SAROSI I，XIA X Z，et al.Severe B cell hyperplasia and autoimmune disease in TALL-1 transgenic mice[J].PNAS，2000，97（7）：3370-3375.
[13] GROSS J A，JOHNSTON J，MUDRI S，et al.TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease[J].Nature，2000，404（6781）：995-999.
[14] THOMPSON J S，BIXLER S A，QIAN F，et al.BAFF-R，a newly identified TNF receptor that specifically interacts with BAFF[J].Sciece，2001，293（5537）：2108-2111.
[15] MARSTERS S A，YAN M H，PITTI R M，et al.Interaction of the TNF homologues BLyS and APRIL with the TNF receptor homologues BCMA and TACI[J].Curr Biol，2000，10（13）：785-788.
[16] SALAZAR-CAMARENA D C，ORT Z-LAZARENO P，MAR N-ROSALES M，et al.BAFF-R and TACI expression on CD3+ T cells：Interplay among BAFF，APRIL and T helper cytokines profile in systemic lupus erythematosus[J].Cytokine，2019，114：115-127.
[17] NG L G，SUTHERLAND A P R，NEWTON R，et al.B cell-activating factor belonging to the TNF family （BAFF）-R is the principal BAFF receptor facilitating BAFF costimulation of circulating T and B cells[J].J Immunol，2004，173（2）：807-817.
[18] NGUYEN T G，MORRIS J M.Signals from activation of B-cell receptor with anti-IgD can override the stimulatory effects of excess BAFF on mature B cells in vivo[J].Immunol Lett，2014，161（1）：157-164.
[19] BOSSEN C，SCHNEIDER P.BAFF，APRIL and their receptors：Structure，function and signaling[J].Semin Immunol，2006，18（5）：263-275. [20] STERI M，ORR V，IDDA M L，et al.Overexpression of the cytokine BAFF and autoimmunity risk[J].N Engl J Med，2017，376（17）：1615-1626.
[21] COMABELLA M.Neuroimmunology：B cells and variant BAFF in autoimmune disease[J].Nat Rev Neurol，2017，13（8）：453-454.
[22] LIANG Z，KONG Y，LUO C，et al.Molecular cloning，functional characterization and phylogenetic analysis of B-cell activating factor in zebrafish （Danio rerio）[J].Fish Shellfish Immunol，2010，29（2）：233-240.
[23] GODAHEWA G I，PERERA N C N，UMASUTHAN N，et al.Molecular characterization and expression analysis of B cell activating factor from rock bream （Oplegnathus fasciatus）[J].Dev Comp Immunol，2016，55：1-11.
[24] PANDIT P，SHEN Y B，WANG W J，et al.Identification of TNF13b （BAFF） gene from grass carp （Ctenopharyngodon idella） and its immune response to bacteria and virus[J].Dev Comp Immunol，2013，39（4）：460-464.
[25] XIAO W，LONG W，LIU G Y，et al.Molecular cloning，expression and functional analysis of B-cell activating factor （BAFF） in yellow grouper，Epinephelus awoara[J].Mol Immunol，2014，59（1）：64-70.
[26] MENG F Q，SUN Y N，XU T J.Comparative genomic of the BAFF and BAFF-like genes and immune response to bacteria of miiuy croaker （Miichthys miiuy）[J].Fish Shellfish Immunol，2015，43（1）：191-199.
[27] LIU H，ZHANG J，LI J，et al.Molecular structure，distribution，and immunology function of TNFSF13B （BAFF） in Nile tilapia （Oreochromis niloticus）[J].Fish Shellfish Immunol，2016，51：240-250.
[28] BASU M，LENKA S S，PAICHHA M，et al.B cell activating factor is induced by toll-like receptor and NOD-like receptor-ligands and plays critical role in IgM synthesis in Labeo rohita[J].Mol Immunol，2016，78：9-26.
[29] GRANJA A G，HOLLAND J W，PIGNATELLI J，et al.Characterization of BAFF and APRIL subfamily receptors in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）.Potential role of the BAFF/APRIL axis in the pathogenesis of proliferative kidney disease[J].PLoS One，2017，12（3）：1-24.
[30] AI H X，SHEN Y F，MIN C，et al.Molecular structure，expression and bioactivity characterization of TNF13B （BAFF） gene in mefugu，Takifugu obscurus[J].Fish Shellfish Immunol，2011，30（6）：1265-1274.
[31] LI R G，DOOLEY H，WANG T H，et al.Characterisation and expression analysis of B-cell activating factor （BAFF） in spiny dogfish （Squalus acanthias）：Cartilaginous fish BAFF has a unique extra exon that may impact receptor binding[J].Dev Comp Immunol，2012，36（4）：707-717.
[32] BIRSTEIN V J，BEMIS W E，WALDMAN J R.The threatened status of acipenseriform species：A summary[J].Environ Biol Fishes，1997，48：427-435. [33] LIAO Z Y，CHEN X J，NIE D S，et al.A RING finger protein 114 （RNF114） homolog from Chinese sturgeon （Acipenser sinensis） possesses immune-regulation properties via modulating RIG-I signaling pathway-mediated interferon expression[J].Fish Shellfish Immunol，2014，41（2）：507-516.
[34] ZHENG W B，TIAN C，CHEN X H.Molecular characterization of goose-type lysozyme homologue of large yellow croaker and its involvement in immune response induced by trivalent bacterial vaccine as an acute-phase protein[J].Immunol Lett，2007，113（2）：107-116.
[35] KUMAR S，STECHER G，TAMURA K.MEGA7：Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J].Mol Biol Evol，2016，33（7）：1870-1874.
[36] SPINNER D M.MTT growth assays in ovarian cancer[J].Methods Mol Med，2001，39：175-177.
[37] FIGGETT W A，VINCENT F B，SAULEP-EASTON D，et al.Roles of ligands from the TNF superfamily in B cell development，function，and regulation[J].Semin Immunol，2014，26（3）：191-202.
[38] MEINL E，THALER F S，LICHTENTHALER S F.Shedding of BAFF/APRIL receptors controls B cells[J].Trends Immunol，2018，39（9）：673-676.
[39] VIGOLO M，CHAMBERS M G，WILLEN L，et al.A loop region of BAFF controls B cell survival and regulates recognition by different inhibitors[J].Nat Commun，2018，9（1199）：1-15.
[40] KIM H M，YU K S，LEE M E，et al.Crystal structure of the BAFF-BAFF-R complex and its implications for receptor activation[J].Nat Struct Biol，2003，10（5）：342-348.
[41] BRINK R.Regulation of B cell self-tolerance by BAFF[J].Semin Immunol，2006，18（5）：276-283.
[42] SALINAS I，ZHANG Y A，SUNYER J O.Mucosal immunoglobulins and B cells of teleost fish[J].Dev Comp Immunol，2011，35（12）：1346-1365.
[43] ROMANO N，CECCARIGLIA S，ABELLI L，et al.Lymphomyeloid organs of the Antarctic fish Trematomus nicolai and Chionodraco hamatus （Teleostei：Notothenioidea）：A comparative histological study[J].Polar Biol，2000，23：321-328.
[44] SAKAI J，AKKOYUNLU M.The role of BAFF system molecules in host response to pathogens[J].Clin Microbiol Rev，2017，30：991-1014.
[45] SMULSKI C R，EIBEL H.BAFF and BAFF-receptor in B cell selection and survival[J].Front Immunol，2018，9：1-10.