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摘要：【目的】將耐铝主效基因导入普通玉米自交系，筛选出耐铝玉米株系，为拓宽玉米耐铝种质资源及耐铝育种提供理论参考。【方法】以玉米耐铝材料（CML530、CML532、CML533和CML534）和普通玉米自交系（西1、9058和LX9801）为材料，构建6个回交群体，基于分子标记辅助选择技术，利用与耐铝基因ZmM1、ZmM2、ZmASL和ZmALMT2紧密连锁的分子标记（umc1468、ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496）进行靶基因选择，将耐铝主效基因导入到普通玉米自交系，结合植株田间表现，筛选出耐铝的稳定株系，并对其进行耐铝鉴定。【结果】在分离世代（BC1F1/S1）苗期对6个回交群体共581个株系进行靶基因选择，结果有69个株系中选，结合植株田间表现，最终获得17个稳定株系。基于分子标记检测结果，17个稳定株系的遗传背景恢复率为73.9%～93.8%，平均为83.4%。0.2 mmol/L AlCl3溶液处理下17个稳定株系的根系生长均受到不同程度的抑制，根净增长度平均值为0.81 cm，极显著低于对照（0.5 mmol/L CaCl2溶液）（P<0.01，下同）;稳定株系的根相对伸长率与轮回亲本差异达极显著水平;17个稳定株系的根相对伸长率为64.50%～83.33%，平均为74.74%，均为中等及以上耐铝株系，其中NS1、NS9、NS10、NS15和NS16为高耐铝株系。【结论】通过分子标记辅助选择技术可将耐铝主效基因导入普通玉米自交系，且导入多个耐铝基因株系的耐铝性较同一群体中导入单个耐铝基因的株系均有不同程度提高，表明多个耐铝基因累加可提高耐铝性。可见，该技术可作为耐铝玉米种质创制的有效手段。
关键词： 玉米;分子标记辅助选择;酸性土壤;耐铝性
中图分类号： S513.035.3 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-0908-08
Breeding aluminum-tolerant maize germplasm using
molecular marker-assisted selection
DENG Lei1， PAN Jin-wei1， YANG Wen-peng2， REN Hong2， WANG Wei2*， BAI Guang-xiao1*
（1College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2Institute of Upland Food Crops，
Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 520100， China）
Abstract：【Objective】The main-effect genes for aluminum（Al） tolerance were introgressed into common maize inbred lines， maize germplasms with Al tolerance were selected so as to provide reference for broadening Al-tolerant maize germplasms and breeding of Al-tolerant maize germplasms. 【Method】Six backcross populations were constructed with Al-tolerant maize materials（CML530，CML532，CML533 and CML534） and common maize inbred lines（Xi1，9058 and LX9801）. Based on molecular marker-assisted selection （MAS），the targeted genes were selected using molecular mar-kers（umc1468，ZmMATE1，ZmMATE2，MateF2 and ALMT93496） closely linked to Al-tolerant genes（ZmM1， ZmM2， ZmASL and ZmALMT2）. The main-effect genes for Al tolerance were introgressed into common maize inbred lines， combined with the field performance， the stable lines were selected and Al-resistance was identified. 【Result】In separated generation（BC1F1/S1），581 individuals were screened out from 6 populations at seedling stage using MAS，and a total of 69 individuals were selected. Combined with the field performance，17 stable lines were finally obtained. The recovery rate of genetic background based on molecular markers was 73.9%-93.8%，with an average of 83.4%. Under the treatment of 0.2 mmol/L AlCl3 solution， the growth of the roots of 17 stable lines was inhibited to varying degrees. The average net growth of the roots was 0.81 cm， which was extremely significantly lower（P<0.01， the same below） than that of the control（0.5 mmol/L CaCl2 solution）. The relative elongation of the roots of the stable lines showed extremely significant difference from that of the recurrent parent. The identification of Al tolerance at seedling stage showed that the relative root elongation rate of 17 selected lines ranged from 64.50% to 83.33%，with an average of 74.74%. All of them were medium or above Al-tolerant lines，NS1，NS9，NS10，NS14 and NS16 of which were highly Al-tolerant lines. 【Conclusion】Molecular marker-assisted selection technique helps introgress the Al-tolerant major-effect genes into the normal maize inbred line. Moreover， the Al tolerance of inbred lines taking in more than one Al-tolerant genes is better than lines in the same population taking in a single Al-tolerant gene. Therefore， the accumulation of multiple Al-tolerant genes enhances the level of Al tolerance. The technology can serve as an effective method for the breeding of Al-tolerant maize germplasm. Key words： maize; molecular marker-assisted selection; acid soil; aluminum tolerance
Foundation item： Science and Technology Plan Project of Guizhou（QKHZC〔2020〕1Y050）; Guizhou High-level Innovative Talent Cultivation Object Project（20154017）
0 引言
【研究意义】玉米是世界上分布最广的作物之一。铝毒害胁迫是生长于酸性土壤中玉米产量的主要限制因子，其危害仅次于干旱胁迫，严重影响玉米产业的发展（Liu et al.，2014）。世界上酸性土壤面积约占全世界陆地总面积的35%，占耕地总面积的50%（Ryan and Delhaize，2010;廖红和严小龙，2013）。我国酸性土壤面积达2.04×108 ha，约占耕地面积的21%，主要集中在长江以南的热带、亚热带地区（秦松等，2009;赵天龙等，2013）。研究发现，当土壤pH<5时，铝溶解变成Al3+，经Ca2+通道进入作物根细胞内，诱导细胞产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）并造成细胞壁僵化，导致根的生长受到抑制，从而阻碍作物生长发育（肖厚军和王正银，2006;林郑和和肖荣冰，2009;Ryan et al.，2011）。生产上迫切需要耐铝玉米种质，但目前自然界中几乎不存在天然的耐铝种质，主要通过人工选择获得耐铝突变体。因此，利用分子标记辅助选择技术创制耐铝玉米种质，对玉米产业发展具有重要意义。【前人研究进展】近年来，玉米耐铝毒的分子遗传学研究发展非常迅速。研究发现，玉米的耐铝性是数量性状，受多基因累加影响（Borrero et al.，1995）。研究较多的耐铝基因为苹果酸和柠檬酸的转运蛋白基因，分别属于铝激活苹果酸转运蛋白（Al-Activated Malate Transporter，ALMT）和多药及毒性复合物排出转运蛋白（Multidrug and toxin extrusion，MATE）家族（Yan et al.，2020;宋鑫等，2021）。Ninamango-Cárdenas等（2003）利用QTL作图定位了5个与玉米耐铝毒相关的QTL，可解释60%的遗传变异。解光宁（2012）研究发现ZmSTAR1和ZmSTAR2基因编码耐铝毒ABC转运蛋白，参与玉米中的铝毒胁迫响应，是与玉米耐铝性相关的转录因子。目前获得耐铝玉米种质的途径较少，部分学者通过从自交系和地方特色品種中寻找基因资源，并结合耐铝性鉴定筛选获得（许玉凤等，2005;Coelho et al.，2016;林金利等，2020），关于耐铝新种质创制的报道较少。为了加快玉米耐铝性育种进程，拓宽耐铝玉米种质，国内外学者在玉米耐铝分子标记方面开展了大量研究。Maron等（2010）根据玉米耐铝性的主效基因ZmM1和ZmM2，开发出2个Indel分子标记即ZmMATE1和ZmMATE2。王伟等（2014）将ZmM1和ZmM2基因附近的分子标记进行整合，并结合分子标记的多态性和遗传连锁关系进行分析，结果发现通过ZmM1和ZmM2基因进行分子标记辅助选择时，宜选择ZmMATE1、ZmMATE2和umc1468分子标记进行检测。Krill等（2017）通过关联分析筛选出4个与玉米耐铝性相关的基因，即玉米AltsB蛋白类似物基因（Zea mays AltSB like，ZmASL）、玉米铝激活苹果酸2号转运蛋白基因（Zea mays aluminum-activated malate transporter2，ZmALMT2）、S-腺苷-L-高半胱氨酸酶基因（S-adenosyl-L-homocysteinase，SAHH）和苹果酸酶基因（Malic enzyme，ME），并开发了对应的Indel分子标记，可用于耐铝玉米材料的分子标记辅助选择。Matonyei等（2014）在选育玉米耐铝材料时发现，应将多个耐铝基因进行聚合，而不是单一基因渗入。【本研究切入点】虽然通过分子生物学手段可提高玉米在酸性土壤中的耐铝性能并拓宽耐铝玉米种质，但目前鲜见利用分子标记辅助选择技术创制玉米耐铝种质的研究报道。【拟解决的关键问题】以玉米耐铝材料和普通玉米自交系为材料，利用分子标记辅助选择技术将耐铝主效基因导入普通玉米自交系中，从中筛选获得耐铝的新材料，为拓宽玉米耐铝种质资源及耐铝育种提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
4份玉米耐铝材料来源于国际玉米小麦改良中心（CIMMYT），3份普通玉米自交系来源于贵州省旱粮研究所（表1）。以玉米耐铝材料为供体亲本，普通玉米自交系为轮回亲本，构建6个回交群体：CML530/LX9801//LX9801、CML532/西1//西1、CML532/9058// 9058、CML533/西1//西1、CML533/9058//9058和CML 534/LX9801//LX9801。主要试剂：CTAB、无水乙醇、异丙醇、氯仿/异戊醇（24∶1）、TBE、Bis-acrylamide和Acrylamide等均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，6×Loading Buffer和DL500 DNA Marker购自重庆擎科兴业生物技术有限公司。主要设备仪器：移液器（Eppendorf，德国）、高速冷冻离心机（Beckman，美国）、恒温水浴锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、NanoDrop One型超微量紫外分光光度计（Thermo，美国）、Bio-6000型扫描仪（上海中晶企业发展有限公司）、SimpliAmp PCR仪（ABI，美国）、垂直电泳槽[京昌科仪（北京）生物科技有限公司]和DYY-10C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。 1. 2 试验方法
1. 2. 1 DNA提取 采用王伟等（2008）改良的CTAB法提取基因组DNA，用NanoDrop One型超微量紫外分光光度计检测DNA浓度和质量。
1. 2. 2 靶基因选择及遗传背景分析 于苗期取分离世代幼嫩叶片，提取基因组DNA。参考前人（Maron et al.，2010;王伟，2014;Krill et al.，2017）的研究结果，利用SSR分子标记（umc1468）和Indel分子标记（ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496）进行耐铝主效基因选择及鉴定，筛选出稳定株系，参照农业标准NY/T 1432─2014《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》，利用40对SSR分子标记引物进行其遗传背景分析，筛选出耐铝的稳定株系。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。耐铝主效基因及其分子标记（Maron et al.，2010;王伟等，2014;Krill et al.，2017）如表2所示。SSR和Indel分子标记的PCR反应体系、扩增程序、电泳检测和染色参考王伟等（2008，2014）的方法进行。
1. 2. 3 耐铝性鉴定 参考李德华等（2004）的方法对稳定株系进行耐铝性鉴定：以0.5 mmol/L CaCl2溶液（pH 4.5）处理的株系为对照组（CK）、0.2 mmol/L AlCl3溶液（含0.5 mmol/L CaCl2，pH 4.5）处理的株系为处理组，每样品设3个重复，每个重复5株幼苗，测量处理前后主根长度，计算根净增长度（LNSR）和根相对伸长率（LRSR），计算公式为：LNSR=L处理后-L处理前，LRSR=LNSR（Al）/LNSR（CK）×100。根据根的相对伸长率将耐铝性分为3个等级：高耐铝（LRSR≥80.0%）、中等耐铝（60.0%≤LRSR<80.0%）和铝敏感（LRSR<60.0%）。
1. 3 统计分析
基于分子标记的遗传背景恢复率采用公式G（g）=[L+X（g）]/（2L）计算，理论背景恢复率按公式E[G（g）]=1-（1/2）g+1计算（方明镜等，2005）。式中，g指回交世代数;G（g）指在回交g代的遗传背景恢复率;X（g）指在回交g代表现为受体亲本带型的分子标记数量;L指所参与分析的分子标记数量。利用Excel 2019和IBM SPSS Statistics 23进行数据整理分析。
2 结果与分析
2. 1 耐铝主效基因的分子标记多态性检测及筛选
利用SSR和Indel分子标记对供试材料在4个耐铝主效基因的分子标记进行多态性检测，结果如图1所示。供试材料中，不同的耐铝主效基因的分子标记多态性存在明显差异。在ZmMATE1位点，CML530与LX9801间、CML533与9058间及CML532与西1间均存在多态性，CML532与9058间、CML533与西1间及CML534与LX9801间均无多态性;在ZmMATE2位点，CML530和CML534分别与LX9801无多态性，CML532和CML533分别与西1具有多态性，CML532和CML533分别与9058具有多态性;在umc1468、MateF2和ALMT93496位点，CML530和CML534分别与LX9801具有多态性，CML532和CML533分别与西1，CML532和CML533分别与9058具有多态性。根据多态性检测结果，选择SSR分子标记umc1468对群体CML532/西1//西1、CML533/9058//9058和CML534/LX9801//LX9801进行靶基因选择，分别利用Indel分子标记ZmMATE2、MateF2和ALMT93496对群体CML532/9058//9058、CML530/LX9801//LX9801和CML533/西1//西1进行靶基因选择。
2. 2 分離世代靶基因选择
利用玉米耐铝材料和普通玉米自交系杂交获得F1，用普通玉米自交系回交获得BC1F1群体。种植BC1F1，于盛花期进行人工混合授粉，获得分离世代（BC1F1/S1）。种植BC1F1/S1，于苗期取样，利用SSR分子标记umc1468和Indel分子标记ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496进行靶基因选择，结果如图2所示。在6个群体581个株系中，共有69个株系电泳带型与非轮回亲本一致，称为中选株系，根据田间植株性状表现，去除雌雄不协调未能授粉的株系，共获得17个稳定株系。其中，以LX9801为轮回亲本的2个群体（CML530/LX9801//LX9801和CML534/LX9801//LX9801）中，中选株系18个，实际收获6个稳定株系;以西1为轮回亲本的2个群体（CML532/西1//西1和CML533/西1//西1）中，中选株系17个，实际收获7个稳定株系;以9058为轮回亲本的2个群体（CML532/9058//9058和CML533/9058//9058）中，中选株系34个，实际收获4个稳定株系（表3），继续种植自交加代直至稳定。
利用Indel分子标记ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496鉴定17个稳定株系的耐铝基因型，结果如图3所示。在17个稳定株系中，有5个株系渗入ZmMATE1位点，8个株系导入ZmMATE2位点，4个株系渗入MateF2位点，3个株系导入ALMT93496位点，其中株系NS1导入ZmMATE1和MateF2 2个耐铝位点，NS8渗入ZmMATE1和ZmMATE2 2个耐铝位点，NS15渗入ZmMATE2和ALMT93496 2个耐铝位点（表4）。
2. 3 遗传背景分析
利用获得的稳定株系对40对SSR分子标记进行多态性筛选，选择在亲本间具有明显多态性且带型清晰可辨的分子标记，对17个稳定株系进行遗传背景分析，结果如表5所示。分离世代的遗传背景恢复率理论值为75.0%。在17个稳定株系中，基于分子标记的遗传背景恢复率为73.9%～93.8%，平均为83.4%，比理论值高8.4%（绝对值）;多数稳定株系的遗传背景恢复率高于理论值，最高的是来自群体CML532/西1//西1的NS5和NS7及群体CML532/9058//9058的NS9，背景恢复率均为93.8%。 2. 4 稳定株系的耐铝性鉴定
根尖是铝毒作用的主要位点，铝毒害胁迫下根伸长受抑制程度是评价植物耐铝性的重要指标（张莉丽等，2007）。对获得的稳定株系进行耐铝性鉴定，结果如表6所示。处理组17个稳定株系的根系生长均受到不同程度的抑制，根净增长度平均值为0.81 cm，极显著低于对照（1.10 cm）（P<0.01，下同）;稳定株系的根相对伸长率与轮回亲本差异达极显著水平。17个稳定株系的根相对伸长率为64.50%～83.33%，平均为74.74%，根相对伸长率最低的株系是来自CML532/西1//西1群体的NS5，根相对伸长率最高的株系是来自群体CML532/9058//9058的NS9。17个稳定株系耐铝性均达到中等及以上水平，其中NS1、NS9、NS10、NS15和NS16耐铝性最强，为高耐铝株系。
3 讨论
对于酸性土壤地区，鉴选和创制玉米耐铝种质是提高玉米产量的有效途径。Matonyei等（2014）通过检测112份肯尼亚玉米种质的根相对伸长率、根尖铝含量及玉米铝耐性基因ZmMATE1的表达水平，共获得1个高耐铝的玉米自交系。Coelho等（2016）通过对102份玉米种质进行耐铝性鉴定，获得17份耐铝基因型种质。本研究利用分子标记辅助选择技术将耐铝主效基因导入到普通玉米自交系中，获得了17个稳定耐铝材料，经苗期鉴定发现，其均达中等及以上耐铝等级，可为玉米耐铝育种提供基础材料。
玉米耐铝性是数量性状，受多基因累加影响（Borrero et al.，1995）。Matonyei等（2014）对112份肯尼亚玉米种质进行耐铝基因ZmMATE1表达分析及耐铝性鉴定，结果发现CON5和Cateto 2个种质的耐铝性均较好，但CON5中ZmMATE1基因的表达量只有Cateto的50%，推测CON5中存在多个耐铝基因。本研究中，稳定株系NS1、NS8和NS15均渗入2个耐铝位点，相较同一群体中导入单个耐铝位点的株系，其耐铝性均有不同程度提高，表明多个耐铝基因累加可提高耐铝性，与Matonyei等（2014）的研究结果相似。
作物受到铝毒害的主要表现为根生长受到抑制，因此根的生长受抑制程度是评价作物耐铝性的重要指标（熊洁等，2015;刑承华等，2017）。李德华等（2004）研究发现，玉米自交系根净增长度与耐铝性相关性较差，而根相对伸长率与其耐铝性呈显著相关性，耐铝基因型种子根相对伸长率较大。唐新莲等（2015）以56个玉米品种（包含普通玉米、甜玉米和糯玉米）为材料，经10～30 μmol/L Al3+溶液（含0.5 mmol/L CaCl2，pH 4.5）处理后，玉米幼苗根净增长量均较对照（0 μmol/L Al3+，0.5 mmol/L CaCl2，pH 4.5）显著降低，且Al3+浓度与根系受抑制程度呈显著正相关，不同玉米品种的耐铝性存在显著差异。林雪琼等（2021）研究发现，在铝胁迫下甜玉米根系相对伸长量明显下降，表明其根系伸长受到Al3+的明显抑制，而耐铝性较强的甜玉米自交系，其根系相对伸长率有所上升。本研究中，铝处理后17个稳定株系根相对伸长率均极显著高于轮回亲本，但高耐铝株系NS9的根净增长度低于中等耐铝株系NS5，与李德华等（2004）的研究结果一致。因此，在利用分子标记辅助选择技术创制耐铝种质时，不仅要考虑耐铝主效QTL（或基因）的分子标记检测的准确性，还应对获得的稳定株系进行耐铝性鉴定，二者结合才能获得更优异的耐铝种质。
4 结论
通过分子标记辅助选择技术可将耐铝主效基因导入普通玉米自交系，且渗入多个耐铝基因株系的耐铝性较同一群体中导入单个耐铝基因的株系均有不同程度提高，表明多个耐铝基因累加可提高耐铝性。可见，该技术可作为耐铝玉米种质创制的有效手段。
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： 玉米;分子标记辅助选择;酸性土壤;耐铝性
中图分类号： S513.035.3 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-0908-08
Breeding aluminum-tolerant maize germplasm using
molecular marker-assisted selection
DENG Lei1， PAN Jin-wei1， YANG Wen-peng2， REN Hong2， WANG Wei2*， BAI Guang-xiao1*
（1College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2Institute of Upland Food Crops，
Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 520100， China）
Abstract：【Objective】The main-effect genes for aluminum（Al） tolerance were introgressed into common maize inbred lines， maize germplasms with Al tolerance were selected so as to provide reference for broadening Al-tolerant maize germplasms and breeding of Al-tolerant maize germplasms. 【Method】Six backcross populations were constructed with Al-tolerant maize materials（CML530，CML532，CML533 and CML534） and common maize inbred lines（Xi1，9058 and LX9801）. Based on molecular marker-assisted selection （MAS），the targeted genes were selected using molecular mar-kers（umc1468，ZmMATE1，ZmMATE2，MateF2 and ALMT93496） closely linked to Al-tolerant genes（ZmM1， ZmM2， ZmASL and ZmALMT2）. The main-effect genes for Al tolerance were introgressed into common maize inbred lines， combined with the field performance， the stable lines were selected and Al-resistance was identified. 【Result】In separated generation（BC1F1/S1），581 individuals were screened out from 6 populations at seedling stage using MAS，and a total of 69 individuals were selected. Combined with the field performance，17 stable lines were finally obtained. The recovery rate of genetic background based on molecular markers was 73.9%-93.8%，with an average of 83.4%. Under the treatment of 0.2 mmol/L AlCl3 solution， the growth of the roots of 17 stable lines was inhibited to varying degrees. The average net growth of the roots was 0.81 cm， which was extremely significantly lower（P<0.01， the same below） than that of the control（0.5 mmol/L CaCl2 solution）. The relative elongation of the roots of the stable lines showed extremely significant difference from that of the recurrent parent. The identification of Al tolerance at seedling stage showed that the relative root elongation rate of 17 selected lines ranged from 64.50% to 83.33%，with an average of 74.74%. All of them were medium or above Al-tolerant lines，NS1，NS9，NS10，NS14 and NS16 of which were highly Al-tolerant lines. 【Conclusion】Molecular marker-assisted selection technique helps introgress the Al-tolerant major-effect genes into the normal maize inbred line. Moreover， the Al tolerance of inbred lines taking in more than one Al-tolerant genes is better than lines in the same population taking in a single Al-tolerant gene. Therefore， the accumulation of multiple Al-tolerant genes enhances the level of Al tolerance. The technology can serve as an effective method for the breeding of Al-tolerant maize germplasm. Key words： maize; molecular marker-assisted selection; acid soil; aluminum tolerance
Foundation item： Science and Technology Plan Project of Guizhou（QKHZC〔2020〕1Y050）; Guizhou High-level Innovative Talent Cultivation Object Project（20154017）
0 引言
【研究意义】玉米是世界上分布最广的作物之一。铝毒害胁迫是生长于酸性土壤中玉米产量的主要限制因子，其危害仅次于干旱胁迫，严重影响玉米产业的发展（Liu et al.，2014）。世界上酸性土壤面积约占全世界陆地总面积的35%，占耕地总面积的50%（Ryan and Delhaize，2010;廖红和严小龙，2013）。我国酸性土壤面积达2.04×108 ha，约占耕地面积的21%，主要集中在长江以南的热带、亚热带地区（秦松等，2009;赵天龙等，2013）。研究发现，当土壤pH<5时，铝溶解变成Al3+，经Ca2+通道进入作物根细胞内，诱导细胞产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）并造成细胞壁僵化，导致根的生长受到抑制，从而阻碍作物生长发育（肖厚军和王正银，2006;林郑和和肖荣冰，2009;Ryan et al.，2011）。生产上迫切需要耐铝玉米种质，但目前自然界中几乎不存在天然的耐铝种质，主要通过人工选择获得耐铝突变体。因此，利用分子标记辅助选择技术创制耐铝玉米种质，对玉米产业发展具有重要意义。【前人研究进展】近年来，玉米耐铝毒的分子遗传学研究发展非常迅速。研究发现，玉米的耐铝性是数量性状，受多基因累加影响（Borrero et al.，1995）。研究较多的耐铝基因为苹果酸和柠檬酸的转运蛋白基因，分别属于铝激活苹果酸转运蛋白（Al-Activated Malate Transporter，ALMT）和多药及毒性复合物排出转运蛋白（Multidrug and toxin extrusion，MATE）家族（Yan et al.，2020;宋鑫等，2021）。Ninamango-Cárdenas等（2003）利用QTL作图定位了5个与玉米耐铝毒相关的QTL，可解释60%的遗传变异。解光宁（2012）研究发现ZmSTAR1和ZmSTAR2基因编码耐铝毒ABC转运蛋白，参与玉米中的铝毒胁迫响应，是与玉米耐铝性相关的转录因子。目前获得耐铝玉米种质的途径较少，部分学者通过从自交系和地方特色品種中寻找基因资源，并结合耐铝性鉴定筛选获得（许玉凤等，2005;Coelho et al.，2016;林金利等，2020），关于耐铝新种质创制的报道较少。为了加快玉米耐铝性育种进程，拓宽耐铝玉米种质，国内外学者在玉米耐铝分子标记方面开展了大量研究。Maron等（2010）根据玉米耐铝性的主效基因ZmM1和ZmM2，开发出2个Indel分子标记即ZmMATE1和ZmMATE2。王伟等（2014）将ZmM1和ZmM2基因附近的分子标记进行整合，并结合分子标记的多态性和遗传连锁关系进行分析，结果发现通过ZmM1和ZmM2基因进行分子标记辅助选择时，宜选择ZmMATE1、ZmMATE2和umc1468分子标记进行检测。Krill等（2017）通过关联分析筛选出4个与玉米耐铝性相关的基因，即玉米AltsB蛋白类似物基因（Zea mays AltSB like，ZmASL）、玉米铝激活苹果酸2号转运蛋白基因（Zea mays aluminum-activated malate transporter2，ZmALMT2）、S-腺苷-L-高半胱氨酸酶基因（S-adenosyl-L-homocysteinase，SAHH）和苹果酸酶基因（Malic enzyme，ME），并开发了对应的Indel分子标记，可用于耐铝玉米材料的分子标记辅助选择。Matonyei等（2014）在选育玉米耐铝材料时发现，应将多个耐铝基因进行聚合，而不是单一基因渗入。【本研究切入点】虽然通过分子生物学手段可提高玉米在酸性土壤中的耐铝性能并拓宽耐铝玉米种质，但目前鲜见利用分子标记辅助选择技术创制玉米耐铝种质的研究报道。【拟解决的关键问题】以玉米耐铝材料和普通玉米自交系为材料，利用分子标记辅助选择技术将耐铝主效基因导入普通玉米自交系中，从中筛选获得耐铝的新材料，为拓宽玉米耐铝种质资源及耐铝育种提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
4份玉米耐铝材料来源于国际玉米小麦改良中心（CIMMYT），3份普通玉米自交系来源于贵州省旱粮研究所（表1）。以玉米耐铝材料为供体亲本，普通玉米自交系为轮回亲本，构建6个回交群体：CML530/LX9801//LX9801、CML532/西1//西1、CML532/9058// 9058、CML533/西1//西1、CML533/9058//9058和CML 534/LX9801//LX9801。主要试剂：CTAB、无水乙醇、异丙醇、氯仿/异戊醇（24∶1）、TBE、Bis-acrylamide和Acrylamide等均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，6×Loading Buffer和DL500 DNA Marker购自重庆擎科兴业生物技术有限公司。主要设备仪器：移液器（Eppendorf，德国）、高速冷冻离心机（Beckman，美国）、恒温水浴锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、NanoDrop One型超微量紫外分光光度计（Thermo，美国）、Bio-6000型扫描仪（上海中晶企业发展有限公司）、SimpliAmp PCR仪（ABI，美国）、垂直电泳槽[京昌科仪（北京）生物科技有限公司]和DYY-10C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。 1. 2 试验方法
1. 2. 1 DNA提取 采用王伟等（2008）改良的CTAB法提取基因组DNA，用NanoDrop One型超微量紫外分光光度计检测DNA浓度和质量。
1. 2. 2 靶基因选择及遗传背景分析 于苗期取分离世代幼嫩叶片，提取基因组DNA。参考前人（Maron et al.，2010;王伟，2014;Krill et al.，2017）的研究结果，利用SSR分子标记（umc1468）和Indel分子标记（ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496）进行耐铝主效基因选择及鉴定，筛选出稳定株系，参照农业标准NY/T 1432─2014《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》，利用40对SSR分子标记引物进行其遗传背景分析，筛选出耐铝的稳定株系。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。耐铝主效基因及其分子标记（Maron et al.，2010;王伟等，2014;Krill et al.，2017）如表2所示。SSR和Indel分子标记的PCR反应体系、扩增程序、电泳检测和染色参考王伟等（2008，2014）的方法进行。
1. 2. 3 耐铝性鉴定 参考李德华等（2004）的方法对稳定株系进行耐铝性鉴定：以0.5 mmol/L CaCl2溶液（pH 4.5）处理的株系为对照组（CK）、0.2 mmol/L AlCl3溶液（含0.5 mmol/L CaCl2，pH 4.5）处理的株系为处理组，每样品设3个重复，每个重复5株幼苗，测量处理前后主根长度，计算根净增长度（LNSR）和根相对伸长率（LRSR），计算公式为：LNSR=L处理后-L处理前，LRSR=LNSR（Al）/LNSR（CK）×100。根据根的相对伸长率将耐铝性分为3个等级：高耐铝（LRSR≥80.0%）、中等耐铝（60.0%≤LRSR<80.0%）和铝敏感（LRSR<60.0%）。
1. 3 统计分析
基于分子标记的遗传背景恢复率采用公式G（g）=[L+X（g）]/（2L）计算，理论背景恢复率按公式E[G（g）]=1-（1/2）g+1计算（方明镜等，2005）。式中，g指回交世代数;G（g）指在回交g代的遗传背景恢复率;X（g）指在回交g代表现为受体亲本带型的分子标记数量;L指所参与分析的分子标记数量。利用Excel 2019和IBM SPSS Statistics 23进行数据整理分析。
2 结果与分析
2. 1 耐铝主效基因的分子标记多态性检测及筛选
利用SSR和Indel分子标记对供试材料在4个耐铝主效基因的分子标记进行多态性检测，结果如图1所示。供试材料中，不同的耐铝主效基因的分子标记多态性存在明显差异。在ZmMATE1位点，CML530与LX9801间、CML533与9058间及CML532与西1间均存在多态性，CML532与9058间、CML533与西1间及CML534与LX9801间均无多态性;在ZmMATE2位点，CML530和CML534分别与LX9801无多态性，CML532和CML533分别与西1具有多态性，CML532和CML533分别与9058具有多态性;在umc1468、MateF2和ALMT93496位点，CML530和CML534分别与LX9801具有多态性，CML532和CML533分别与西1，CML532和CML533分别与9058具有多态性。根据多态性检测结果，选择SSR分子标记umc1468对群体CML532/西1//西1、CML533/9058//9058和CML534/LX9801//LX9801进行靶基因选择，分别利用Indel分子标记ZmMATE2、MateF2和ALMT93496对群体CML532/9058//9058、CML530/LX9801//LX9801和CML533/西1//西1进行靶基因选择。
2. 2 分離世代靶基因选择
利用玉米耐铝材料和普通玉米自交系杂交获得F1，用普通玉米自交系回交获得BC1F1群体。种植BC1F1，于盛花期进行人工混合授粉，获得分离世代（BC1F1/S1）。种植BC1F1/S1，于苗期取样，利用SSR分子标记umc1468和Indel分子标记ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496进行靶基因选择，结果如图2所示。在6个群体581个株系中，共有69个株系电泳带型与非轮回亲本一致，称为中选株系，根据田间植株性状表现，去除雌雄不协调未能授粉的株系，共获得17个稳定株系。其中，以LX9801为轮回亲本的2个群体（CML530/LX9801//LX9801和CML534/LX9801//LX9801）中，中选株系18个，实际收获6个稳定株系;以西1为轮回亲本的2个群体（CML532/西1//西1和CML533/西1//西1）中，中选株系17个，实际收获7个稳定株系;以9058为轮回亲本的2个群体（CML532/9058//9058和CML533/9058//9058）中，中选株系34个，实际收获4个稳定株系（表3），继续种植自交加代直至稳定。
利用Indel分子标记ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496鉴定17个稳定株系的耐铝基因型，结果如图3所示。在17个稳定株系中，有5个株系渗入ZmMATE1位点，8个株系导入ZmMATE2位点，4个株系渗入MateF2位点，3个株系导入ALMT93496位点，其中株系NS1导入ZmMATE1和MateF2 2个耐铝位点，NS8渗入ZmMATE1和ZmMATE2 2个耐铝位点，NS15渗入ZmMATE2和ALMT93496 2个耐铝位点（表4）。
2. 3 遗传背景分析
利用获得的稳定株系对40对SSR分子标记进行多态性筛选，选择在亲本间具有明显多态性且带型清晰可辨的分子标记，对17个稳定株系进行遗传背景分析，结果如表5所示。分离世代的遗传背景恢复率理论值为75.0%。在17个稳定株系中，基于分子标记的遗传背景恢复率为73.9%～93.8%，平均为83.4%，比理论值高8.4%（绝对值）;多数稳定株系的遗传背景恢复率高于理论值，最高的是来自群体CML532/西1//西1的NS5和NS7及群体CML532/9058//9058的NS9，背景恢复率均为93.8%。 2. 4 稳定株系的耐铝性鉴定
根尖是铝毒作用的主要位点，铝毒害胁迫下根伸长受抑制程度是评价植物耐铝性的重要指标（张莉丽等，2007）。对获得的稳定株系进行耐铝性鉴定，结果如表6所示。处理组17个稳定株系的根系生长均受到不同程度的抑制，根净增长度平均值为0.81 cm，极显著低于对照（1.10 cm）（P<0.01，下同）;稳定株系的根相对伸长率与轮回亲本差异达极显著水平。17个稳定株系的根相对伸长率为64.50%～83.33%，平均为74.74%，根相对伸长率最低的株系是来自CML532/西1//西1群体的NS5，根相对伸长率最高的株系是来自群体CML532/9058//9058的NS9。17个稳定株系耐铝性均达到中等及以上水平，其中NS1、NS9、NS10、NS15和NS16耐铝性最强，为高耐铝株系。
3 讨论
对于酸性土壤地区，鉴选和创制玉米耐铝种质是提高玉米产量的有效途径。Matonyei等（2014）通过检测112份肯尼亚玉米种质的根相对伸长率、根尖铝含量及玉米铝耐性基因ZmMATE1的表达水平，共获得1个高耐铝的玉米自交系。Coelho等（2016）通过对102份玉米种质进行耐铝性鉴定，获得17份耐铝基因型种质。本研究利用分子标记辅助选择技术将耐铝主效基因导入到普通玉米自交系中，获得了17个稳定耐铝材料，经苗期鉴定发现，其均达中等及以上耐铝等级，可为玉米耐铝育种提供基础材料。
玉米耐铝性是数量性状，受多基因累加影响（Borrero et al.，1995）。Matonyei等（2014）对112份肯尼亚玉米种质进行耐铝基因ZmMATE1表达分析及耐铝性鉴定，结果发现CON5和Cateto 2个种质的耐铝性均较好，但CON5中ZmMATE1基因的表达量只有Cateto的50%，推测CON5中存在多个耐铝基因。本研究中，稳定株系NS1、NS8和NS15均渗入2个耐铝位点，相较同一群体中导入单个耐铝位点的株系，其耐铝性均有不同程度提高，表明多个耐铝基因累加可提高耐铝性，与Matonyei等（2014）的研究结果相似。
作物受到铝毒害的主要表现为根生长受到抑制，因此根的生长受抑制程度是评价作物耐铝性的重要指标（熊洁等，2015;刑承华等，2017）。李德华等（2004）研究发现，玉米自交系根净增长度与耐铝性相关性较差，而根相对伸长率与其耐铝性呈显著相关性，耐铝基因型种子根相对伸长率较大。唐新莲等（2015）以56个玉米品种（包含普通玉米、甜玉米和糯玉米）为材料，经10～30 μmol/L Al3+溶液（含0.5 mmol/L CaCl2，pH 4.5）处理后，玉米幼苗根净增长量均较对照（0 μmol/L Al3+，0.5 mmol/L CaCl2，pH 4.5）显著降低，且Al3+浓度与根系受抑制程度呈显著正相关，不同玉米品种的耐铝性存在显著差异。林雪琼等（2021）研究发现，在铝胁迫下甜玉米根系相对伸长量明显下降，表明其根系伸长受到Al3+的明显抑制，而耐铝性较强的甜玉米自交系，其根系相对伸长率有所上升。本研究中，铝处理后17个稳定株系根相对伸长率均极显著高于轮回亲本，但高耐铝株系NS9的根净增长度低于中等耐铝株系NS5，与李德华等（2004）的研究结果一致。因此，在利用分子标记辅助选择技术创制耐铝种质时，不仅要考虑耐铝主效QTL（或基因）的分子标记检测的准确性，还应对获得的稳定株系进行耐铝性鉴定，二者结合才能获得更优异的耐铝种质。
4 结论
通过分子标记辅助选择技术可将耐铝主效基因导入普通玉米自交系，且渗入多个耐铝基因株系的耐铝性较同一群体中导入单个耐铝基因的株系均有不同程度提高，表明多个耐铝基因累加可提高耐铝性。可见，该技术可作为耐铝玉米种质创制的有效手段。
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（責任编辑 陈 燕）