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摘要 目的：探討加味身痛逐瘀汤对骨质疏松模型鼠行为学的影响，同时观察大鼠骨组织的形态学改变。方法：45只雌性SD（Sprague Dawley）大鼠，随机分为空白组、模型组及中药组，每组15只。其中模型组和中药组进行双侧卵巢切除术复制骨质疏松模型，随后中药组接受加味身痛逐瘀汤灌胃，空白组和模型组大鼠接受等剂量生理盐水灌胃，1次/d，5次/周，连续灌胃5周。干预接受后进行生物力学检测和观察骨形态学变化，同时检测各组大鼠外周血微量元素（Fe、Zn、Mg）水平变化。结果：与空白组比较，模型组大鼠股骨最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚性系数、弯曲能量降低，差异有统计学意义（P<0.05），组织形态学显示骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁面积百分比均明显下降（P<0.05）;加味身痛逐瘀汤灌胃5周后中药组大鼠的股骨最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚性系数、弯曲能量较模型组升高，差异有统计学意义（P<0.05），且骨小梁厚度、骨小梁数量等形态学参数也均出现明显改善，差异有统计学意义（P<0.05）。ELISA检测显示模型组大鼠外周血清Fe、Zn、Mg水平均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。加味身痛逐瘀汤灌胃5周后大鼠外周血清Fe、Zn、Mg水平有所升高，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），结论：加味身痛逐瘀汤对骨质疏松模型大鼠骨组织显微结构及生物力学性能均有明显改善效果，这可能通过调节机体金属元素表达有关，可推广应用。
关键词 骨质疏松;大鼠;加味身痛逐瘀汤;生物力学;形态学;HE染色;金属微量元素
Abstract Objective：To investigate the effect of Jiawei Shentong Zhuyu decoction on the behavior of osteoporotic model rats and observe the morphological changes of bone tissue in rats.Methods：A total of 45 female SD （Sprague Dawley） rats were randomly divided into blank group （n=15），model group （n=15） and traditional Chinese medicine group （n=15）.The model group and traditional Chinese medicine group received bilateral ovariectomy to establish the model of osteoporosis，then the traditional Chinese medicine group received Jiawei Shentong Zhuyu decoction，and the rats in the blank group and model group received the same dose of normal saline once a day and 5 times a week for 5 weeks.After intervention，biomechanical examination and morphological changes of bone were observed.At the same time，the levels of trace elements （Fe，Zn，Mg） in peripheral blood of rats in each group were detected.Results：Compared with the blank group，the maximum load，fracture load，elastic load，rigidity coefficient and bending energy of femur in the model group were significantly lower （P<0.05）.Histomorphology showed that the number，thickness and percentage of trabecular area of bone trabeculae decreased significantly （P<0.05）.After oral administration of Jiawei Shentongzhuyu decoction for 5 weeks，the maximum load，fracture load，elastic load，rigidity coefficient and bending energy of femur in the traditional Chinese medicine group were significantly higher than those in the model group （P<0.05）.The morphological parameters such as trabecular thickness and number of trabeculae were also significantly improved，the difference was statistically significant （P<0.05）.ELISA detection showed that the levels of Fe，Zn and Mg in peripheral serum of rats in the model group decreased significantly，and the difference was statistically significant（P<0.05）.After 5 weeks of oral administration of Jiawei Shentong Zhuyu decoction，the levels of Fe，Zn and Mg in peripheral serum of rats were significantly higher than those of the model group（P<0.05）.Conclusion：Jiawei Shentong Zhuyu decoction can significantly improve the microstructure and biomechanical properties of bone tissue of osteoporotic rats，which may be related to regulating the expression of metal elements in the body and can be popularized and applied. Keywords Osteoporosis; Rat; Jiawei Shentong Zhuyu Decoction; Biomechanics; Morphology; HE staining; Metal trace elements
中图分类号：R285.5 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.010
绝经后妇女卵巢的功能逐渐减退，导致雌激素水平日趋减少，破坏了骨吸收活动与成骨细胞的骨形成活动间的动态平衡，导致骨吸收大于骨形成量，最终出现骨质疏松[1-2]。古籍中对“骨痹”“骨痿”“骨蚀”“痛症”“骨枯”的描述与现代医学骨质疏松的病因病机极为相似，中医认为肾为先天之本，主骨生髓，肝在体合筋，主藏血，连接骨节，故从肝肾入手治疗骨质疏松的根本，肝肾不足，因虚致瘀，脉络瘀滞不畅，瘀血阻滞筋骨脉络而出现骨质疏松一系列临床表现[3-4]。
身痛逐瘀汤首载于《医林改错注释》，有补益肝肾、活血化瘀之功。近年来，以身痛逐瘀汤为基本的加减方除用于瘀血痹阻经络证所致的各类疼痛症外，临床应用范围也不断拓宽，尤其是在骨伤科疾病的治疗中效果显著。骨质疏松症好发于绝经后女性，疼痛是其主要临床症状，本团队前期发现身痛逐瘀汤可明显改善骨质疏松患者的临床症状，但其作用机制目前尚不明确，本团队利用去势大鼠作为研究对象，进行身痛逐瘀汤干预，以观察其对模型大鼠骨组织显微结构及生物力学性能的作用，具体情况如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 45只6个月龄雌性清洁级SD大鼠纳入研究，体质量180～210 g，平均体质量（200±8.5）g。所有大鼠均只有摄食和饮水。大鼠购自河北医科大学实验动物中心，许可证编号：SCXK（冀）2013-1-003。动物伦理学内容经本院伦理委员会审批通过审批（伦理审批号：29102-A2）
1.1.2 药物 加味身痛逐瘀汤由本院中药研究院提供，中药组成：秦艽12 g、羌活12 g;桃仁9 g、红花9 g、当归9 g、川芎9 g、没药9 g、五灵脂9 g、香附6 g、牛膝12 g、地龙9 g、甘草6 g、续断9 g、狗脊9 g。所饮片来源均由本院中药方统一采购，生产批号：2019-11，药液由药剂科统一煎煮。
1.1.3 试剂与仪器 10%水合氯醛（青島宇龙海藻有限公司，货号：S2832）、4%多聚甲醛溶液（青岛宇龙海藻有限公司，货号：D23424）、无水乙醇（青岛宇龙海藻有限公司，货号：Y2932）、苏木素染色液（福州沃森生物技术有限公司，货号：291121）、HM325石蜡切片机（Thereto公司，美国，型号：HM325）、生物组织石蜡包埋机（上海精宏实验设备有限公司，型号：YB-6LF），生物显微镜[尼康仪器（上海）有限公司，型号：NikonY5100]，材料试验机（济南辰鑫试验机制造有限公司，型号：858 Mini Bionix）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 45只大鼠按照数字随机法分为空白组、模型组及中药组，每组15只。模型制备：参照参考文献[5]将45只大鼠适应性喂养7 d后利用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉，待大鼠充分麻醉后将其固定于手术台上，术区备皮消毒后于正中腹部偏下2 cm处做一大小与2 cm的切口，逐层钝性分离后进去腹腔，分离出子宫角，充分暴露被脂肪包裹的粉红色菜花状卵巢，将周围相连的血管和输卵巢结扎后切除双侧卵巢，止血后逐层缝合，撒以青霉素粉，缝合皮肤，采取侧卧式放回笼中，正常饮水。空白组大鼠仅切除卵巢周围等量的脂肪组织。
1.2.2 给药方法 中药组大鼠接受加味身痛逐瘀汤灌胃，按大鼠与人体间等效剂量换算将加味身痛逐瘀汤灌胃剂量设置为0.66 g/（m·kg）。1次/d，连续干预5周;空白组和模型组大鼠接受0.9%NaCl灌胃，连续干预5周。
1.2.3 检测指标及检测方法
1.2.3.1 股骨生物力学测定 干预结束后各组随机选3只大鼠，充分麻醉后断头处死，快速取出大鼠左侧股骨，利用0.9% NaCl复湿后将股骨置于858 Mini Bionix型材料试验机上进行三点弯曲实验，参数如下：加载速度：2 mm/min，跨距17 mm，精度0.01 N，对载荷-变形曲线进行记录，根据从而计算出最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚性系数、弯曲能量[6]。
1.2.3.2 左侧股骨骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁面积百分比的变化 干预结束后各组随机选3只大鼠，充分麻醉后断头处死，快速取出大鼠左侧股骨，使用显微CT（Micro CT）对各组大鼠左侧股骨远端进行扫描，利用相应软件对图像进行处理后测定静态参数：骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁面积百分比（%Tb.Ar）。
1.2.3.3 ELISA检测各组金属元素的水平变化 干预结束后各组随机选3只大鼠，利用水合氯醛腹腔注射麻醉后取腹主动脉血，充分离心后分离出上清液，采用ELISA检测法进行钙、磷浓度测定，用碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至适量浓度后加至反应孔中加0.1 mL，4 ℃孵育过夜，随后用PBS冲洗3次，2 min/次，随后加入待测样品，室温下反应1 h，随后用PBS冲洗3次，2 min/次，加入新鲜稀释的酶标抗体，室温下孵育1 h后洗涤。随后与每个反应孔中加入TMB底物溶液0.1 mL，充分反应后加入2 mol/L硫酸0.05 mL显色，在酶标仪中进行显色测定，计算出OD值，操作过程严格按照说明书进行。
1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较根据方差齐性检验结果选择LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 各组生物力学指标结果 与空白组比较，模型组大鼠股骨最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚性系数、弯曲能量降低，差异有统计学意义（P<0.05）;加味身痛逐瘀汤灌胃5周后中药组大鼠的股骨最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚性系数、弯曲能量较模型组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 各组骨组织HE染色结果 HE染色显示空白组大鼠骨小梁排列有序且紧密，粗大走形大致一致，连续性良好;模型组大鼠骨小梁排列紊乱，变细且稀疏，同时存在大片骨小梁缺失区域;经过加味身痛逐瘀汤干预后骨小梁排列紊乱，变细且稀疏的征象明显减轻，结构大致清晰，偶见骨小梁断裂。见图1。
2.3 各组股骨组织形态计量学结果 与空白组比较，模型组大鼠组织形态学显示骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁面积百分比均明显下降（P<0.05），加味身痛逐瘀汤灌胃5周后中药组大鼠的骨小梁厚度、骨小梁数量等形态学参数也均出现明显改善，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.4 各组大鼠外周血微量元素水平比较 ELISA检测显示模型组大鼠外周血清Fe、Zn、Mg水平均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。加味身痛逐瘀汤灌胃5周后大鼠外周血清Fe、Zn、Mg水平有所升高，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
3 讨论
骨质疏松是以骨量减少、骨脆性升高以及骨组织形态结构受破坏为主要特征的临床慢性疾病，大量研究显示炎性反应、胰岛素抵抗、免疫功能缺陷以及其他内分泌激素代谢异常疾病均是骨质疏松发生发展的病理因素[6-9]。本研究制备骨质疏松模型鼠，经过HE染色显示成模大鼠股骨骨小梁排列紊乱，变细且稀疏，同时存在大片骨小梁缺失区域，并且在骨组织形态计量学研究中证实骨质疏松模型大鼠不但在骨结构力学（最大载荷、弹性载荷、断裂载荷和弯曲能量）而且材料力学（刚性系数）性能均较正常大鼠明显下降，这提示骨质疏松模型大鼠骨组织不论是宏观力学还是微观形态学结构方面均出现典型改变，这与国内外诸多文献所得结果一致[10-12]，亦证实本研究造模成功。
中医并无骨质疏松病名记载，但其病因病机与“骨痹”“骨痿”“骨蚀”“痛症”“骨枯”等高度一致，故骨质疏松属于中医上述疾病范畴。中医古籍记载肾主骨生髓，与骨疾病关系密切[13-14]。肾为先天之本，主骨生髓而养骨，肾精充盛则骨髓生化有源，骨髓充足則骨骼得养，从而坚劲有力、耐久立而强劳作，如若肾精亏虚，肾精生发乏源，骨骼疲软无力。此外，肾虚气血生化乏源，元气不足而气血运化不畅而致瘀，瘀血阻滞于络脉，水谷精微布散障碍，骨髓由此无法濡养骨骼而出现骨痛、脊柱变形、脆性骨折等骨质疏松相关性临床症状[15-16]，就如《医林改错》书中描述：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”;《黄帝内经》亦认为：“老者之气血衰，其肌肉枯，气道涩”，由此肾虚是骨质疏松发病之本，血瘀是发病之标，本病乃本虚标实。因此治疗本病的关键在于“补肾化瘀”，基于此，王清任创立了身痛逐瘀汤以实现从气血入手治疗“诸痹症疼痛”。方中桃仁、红花共奏活血化瘀之功，共为君药;五灵脂、没药、香附是行气活血之品，共为臣药;羌活、秦艽可祛风除湿，牛膝有活血通络止痛的作用，地龙可加强通络舒筋之功，川芎、当归加强君药活血通络作用的同时可养血润燥，续断、狗脊以补肝肾，续筋骨，调血脉。整方共奏活血化瘀、通痹止痛、补肾强骨之功。在本研究中我们发现经过加味身痛逐瘀汤干预后大鼠骨结构力学及材料力学性能均出现明显提升，形态学研究亦显示大鼠骨组织骨小梁排列紊乱，变细且稀疏的征象明显减轻，结构大致清晰，偶见骨小梁断裂，这说明加味身痛逐瘀汤确对骨质疏松有明显疗效。
目前有研究显示微量元素与骨质疏松关系密切，金属微量元素（铁、锌、镁等）微量元素维持机体骨代谢、骨转换正常进行的重要因素，有研究显示绝经后妇女多存在下丘脑-垂体-性腺轴功能减退，下丘脑-垂体-性腺轴是调节机体内分泌代谢的关键部位，而微量元素又广泛参与调节机体的内分泌代谢过程，二者相辅相成[17]。在诸多微量元素中锌、镁、铁是重要因子，锌的缺乏会影响垂体促性腺激素的分泌释放，使垂体中促生长激素减少，进而出现性功能低和成骨作用减弱。Fe广泛参与调节机体新骨形成及骨转化环节，Fe的表达高低直接影响骨矿物质形成和骨基质合成程度，从而影响骨质疏松的发病发展。有研究人员通过实验研究证实补充微量元素可促进成骨细胞的增殖和分化，促进骨质疏松的改善[18]。因此调节微量元素的表达是改善骨质疏松的关键。本研究显示模型组大鼠外周血清Fe、Zn、Mg水平均显著下降，这证实了骨质疏松发生发展过程中金属元素水平确发生变化，而经过加味身痛逐瘀汤干预后大鼠外周血Fe、Zn、Mg水平明显提高，这说明加味身痛逐瘀汤对骨质疏松模型大鼠骨组织显微结构及生物力学性能的作用可能通过调节机体金属元素表达而实现的。
参考文献
[1]王潇潇，罗之柱，刘昊为.杜仲摄入结合振动训练干预去卵巢联合地塞米松骨质疏松模型大鼠骨密度、骨代谢及骨生物力学的变化[J].中国组织工程研究，2019，23（31）：4998-5004.
[2]席永斌，颜春鲁，孙仕华，等.从Wnt/β-catenin信号通路研究地黄饮子汤剂对去卵巢骨质疏松模型大鼠的防治作用[J].中医研究，2019，6（8）：67-70.
[3]李娜，杜丽坤，王冰梅.原发性骨质疏松症的中医证素辨证法[J].中国骨质疏松杂志，2019，25（7）：1010-1014.
[4]谢兴文，李建国，黄晋，等.血管内皮生长因子防治骨质疏松的研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2019，25（7）：1030-1033.
[5]沈健，陈秋晴，曹兰兰，等.吡格列酮对去卵巢大鼠骨代谢指标的影响及机制[J].中国临床药理学杂志，2019，35（13）：1359-1362.
[6]陈丹丹，欧国峰，董博，等.太白楤木与珠子参不同配伍对骨质疏松大鼠模型骨代谢指标及骨生物力学的影响[J].河北中医，2019，41（12）：1862-1867.
[7]赵航，马慧娟，王超.骨质疏松症相关基因研究进展[J].实用老年医学，2019，33（6）：523-527.
[8]李娜，方红丽，邓苙.原发性骨质疏松影响因素及健康干预研究进展[J].昆明医科大学学报，2019，40（6）：135-139.
[9]闫子惠，张金梅，银艳.骨质疏松症的中医诊治研究进展[J].世界最新医学信息文摘，2019，19（42）：82，86.
[10]姚毅，郑德禄，于萌，等.骨质疏松发病机制研究进展[J].心理月刊，2019，14（9）：194.
[11]马江涛，柴爽，万雷，等.维生素D缺乏对骨和骨外作用研究进展[J].中国骨质疏松杂志：2019，5（13）：1-10.
[12]李明，李宁宁.维生素D受体基因多态性与骨质疏松症相关性的研究进展[J].右江医学，2019，47（4）：245-249.
[13]彭勋潜，李艳利，莫枢，辛灵.原发性骨质疏松症的中医研究近况[J].临床医学研究与实践，2019，4（9）：197-198.
[14]金瑜.中医药治疗骨质疏松症的疗效分析[J].临床医药文献（连续型电子期刊），2019，6（20）：72-73.
[15]李志远，吴泽莉，方坚.中医辨证论治原发性骨质疏松症疗效观察[J].中医药临床杂志，2019，31（2）：323-326.
[16]杨宗德.中医药治疗骨质疏松症研究进展[J].系统医学，2019，4（4）：193-195.
[17]陈凌志，王力，郭永强，等.补肾健骨中药改善肾虚型骨质疏松症的作用机制探讨[J].实用中西医结合临床，2019，19（10）：179-181.
[18]林上进，程群，邵云潮，等.血骨代谢指标及骨密度与骨组织钙、磷及金属微量元素含量的相关性[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2017，10（6）：513-518.
（2019-10-16收稿 责任编辑：芮莉莉）
关键词 骨质疏松;大鼠;加味身痛逐瘀汤;生物力学;形态学;HE染色;金属微量元素
Abstract Objective：To investigate the effect of Jiawei Shentong Zhuyu decoction on the behavior of osteoporotic model rats and observe the morphological changes of bone tissue in rats.Methods：A total of 45 female SD （Sprague Dawley） rats were randomly divided into blank group （n=15），model group （n=15） and traditional Chinese medicine group （n=15）.The model group and traditional Chinese medicine group received bilateral ovariectomy to establish the model of osteoporosis，then the traditional Chinese medicine group received Jiawei Shentong Zhuyu decoction，and the rats in the blank group and model group received the same dose of normal saline once a day and 5 times a week for 5 weeks.After intervention，biomechanical examination and morphological changes of bone were observed.At the same time，the levels of trace elements （Fe，Zn，Mg） in peripheral blood of rats in each group were detected.Results：Compared with the blank group，the maximum load，fracture load，elastic load，rigidity coefficient and bending energy of femur in the model group were significantly lower （P<0.05）.Histomorphology showed that the number，thickness and percentage of trabecular area of bone trabeculae decreased significantly （P<0.05）.After oral administration of Jiawei Shentongzhuyu decoction for 5 weeks，the maximum load，fracture load，elastic load，rigidity coefficient and bending energy of femur in the traditional Chinese medicine group were significantly higher than those in the model group （P<0.05）.The morphological parameters such as trabecular thickness and number of trabeculae were also significantly improved，the difference was statistically significant （P<0.05）.ELISA detection showed that the levels of Fe，Zn and Mg in peripheral serum of rats in the model group decreased significantly，and the difference was statistically significant（P<0.05）.After 5 weeks of oral administration of Jiawei Shentong Zhuyu decoction，the levels of Fe，Zn and Mg in peripheral serum of rats were significantly higher than those of the model group（P<0.05）.Conclusion：Jiawei Shentong Zhuyu decoction can significantly improve the microstructure and biomechanical properties of bone tissue of osteoporotic rats，which may be related to regulating the expression of metal elements in the body and can be popularized and applied. Keywords Osteoporosis; Rat; Jiawei Shentong Zhuyu Decoction; Biomechanics; Morphology; HE staining; Metal trace elements
中图分类号：R285.5 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.010
绝经后妇女卵巢的功能逐渐减退，导致雌激素水平日趋减少，破坏了骨吸收活动与成骨细胞的骨形成活动间的动态平衡，导致骨吸收大于骨形成量，最终出现骨质疏松[1-2]。古籍中对“骨痹”“骨痿”“骨蚀”“痛症”“骨枯”的描述与现代医学骨质疏松的病因病机极为相似，中医认为肾为先天之本，主骨生髓，肝在体合筋，主藏血，连接骨节，故从肝肾入手治疗骨质疏松的根本，肝肾不足，因虚致瘀，脉络瘀滞不畅，瘀血阻滞筋骨脉络而出现骨质疏松一系列临床表现[3-4]。
身痛逐瘀汤首载于《医林改错注释》，有补益肝肾、活血化瘀之功。近年来，以身痛逐瘀汤为基本的加减方除用于瘀血痹阻经络证所致的各类疼痛症外，临床应用范围也不断拓宽，尤其是在骨伤科疾病的治疗中效果显著。骨质疏松症好发于绝经后女性，疼痛是其主要临床症状，本团队前期发现身痛逐瘀汤可明显改善骨质疏松患者的临床症状，但其作用机制目前尚不明确，本团队利用去势大鼠作为研究对象，进行身痛逐瘀汤干预，以观察其对模型大鼠骨组织显微结构及生物力学性能的作用，具体情况如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 45只6个月龄雌性清洁级SD大鼠纳入研究，体质量180～210 g，平均体质量（200±8.5）g。所有大鼠均只有摄食和饮水。大鼠购自河北医科大学实验动物中心，许可证编号：SCXK（冀）2013-1-003。动物伦理学内容经本院伦理委员会审批通过审批（伦理审批号：29102-A2）
1.1.2 药物 加味身痛逐瘀汤由本院中药研究院提供，中药组成：秦艽12 g、羌活12 g;桃仁9 g、红花9 g、当归9 g、川芎9 g、没药9 g、五灵脂9 g、香附6 g、牛膝12 g、地龙9 g、甘草6 g、续断9 g、狗脊9 g。所饮片来源均由本院中药方统一采购，生产批号：2019-11，药液由药剂科统一煎煮。
1.1.3 试剂与仪器 10%水合氯醛（青島宇龙海藻有限公司，货号：S2832）、4%多聚甲醛溶液（青岛宇龙海藻有限公司，货号：D23424）、无水乙醇（青岛宇龙海藻有限公司，货号：Y2932）、苏木素染色液（福州沃森生物技术有限公司，货号：291121）、HM325石蜡切片机（Thereto公司，美国，型号：HM325）、生物组织石蜡包埋机（上海精宏实验设备有限公司，型号：YB-6LF），生物显微镜[尼康仪器（上海）有限公司，型号：NikonY5100]，材料试验机（济南辰鑫试验机制造有限公司，型号：858 Mini Bionix）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 45只大鼠按照数字随机法分为空白组、模型组及中药组，每组15只。模型制备：参照参考文献[5]将45只大鼠适应性喂养7 d后利用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉，待大鼠充分麻醉后将其固定于手术台上，术区备皮消毒后于正中腹部偏下2 cm处做一大小与2 cm的切口，逐层钝性分离后进去腹腔，分离出子宫角，充分暴露被脂肪包裹的粉红色菜花状卵巢，将周围相连的血管和输卵巢结扎后切除双侧卵巢，止血后逐层缝合，撒以青霉素粉，缝合皮肤，采取侧卧式放回笼中，正常饮水。空白组大鼠仅切除卵巢周围等量的脂肪组织。
1.2.2 给药方法 中药组大鼠接受加味身痛逐瘀汤灌胃，按大鼠与人体间等效剂量换算将加味身痛逐瘀汤灌胃剂量设置为0.66 g/（m·kg）。1次/d，连续干预5周;空白组和模型组大鼠接受0.9%NaCl灌胃，连续干预5周。
1.2.3 检测指标及检测方法
1.2.3.1 股骨生物力学测定 干预结束后各组随机选3只大鼠，充分麻醉后断头处死，快速取出大鼠左侧股骨，利用0.9% NaCl复湿后将股骨置于858 Mini Bionix型材料试验机上进行三点弯曲实验，参数如下：加载速度：2 mm/min，跨距17 mm，精度0.01 N，对载荷-变形曲线进行记录，根据从而计算出最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚性系数、弯曲能量[6]。
1.2.3.2 左侧股骨骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁面积百分比的变化 干预结束后各组随机选3只大鼠，充分麻醉后断头处死，快速取出大鼠左侧股骨，使用显微CT（Micro CT）对各组大鼠左侧股骨远端进行扫描，利用相应软件对图像进行处理后测定静态参数：骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁面积百分比（%Tb.Ar）。
1.2.3.3 ELISA检测各组金属元素的水平变化 干预结束后各组随机选3只大鼠，利用水合氯醛腹腔注射麻醉后取腹主动脉血，充分离心后分离出上清液，采用ELISA检测法进行钙、磷浓度测定，用碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至适量浓度后加至反应孔中加0.1 mL，4 ℃孵育过夜，随后用PBS冲洗3次，2 min/次，随后加入待测样品，室温下反应1 h，随后用PBS冲洗3次，2 min/次，加入新鲜稀释的酶标抗体，室温下孵育1 h后洗涤。随后与每个反应孔中加入TMB底物溶液0.1 mL，充分反应后加入2 mol/L硫酸0.05 mL显色，在酶标仪中进行显色测定，计算出OD值，操作过程严格按照说明书进行。
1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较根据方差齐性检验结果选择LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 各组生物力学指标结果 与空白组比较，模型组大鼠股骨最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚性系数、弯曲能量降低，差异有统计学意义（P<0.05）;加味身痛逐瘀汤灌胃5周后中药组大鼠的股骨最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚性系数、弯曲能量较模型组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 各组骨组织HE染色结果 HE染色显示空白组大鼠骨小梁排列有序且紧密，粗大走形大致一致，连续性良好;模型组大鼠骨小梁排列紊乱，变细且稀疏，同时存在大片骨小梁缺失区域;经过加味身痛逐瘀汤干预后骨小梁排列紊乱，变细且稀疏的征象明显减轻，结构大致清晰，偶见骨小梁断裂。见图1。
2.3 各组股骨组织形态计量学结果 与空白组比较，模型组大鼠组织形态学显示骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁面积百分比均明显下降（P<0.05），加味身痛逐瘀汤灌胃5周后中药组大鼠的骨小梁厚度、骨小梁数量等形态学参数也均出现明显改善，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.4 各组大鼠外周血微量元素水平比较 ELISA检测显示模型组大鼠外周血清Fe、Zn、Mg水平均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。加味身痛逐瘀汤灌胃5周后大鼠外周血清Fe、Zn、Mg水平有所升高，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
3 讨论
骨质疏松是以骨量减少、骨脆性升高以及骨组织形态结构受破坏为主要特征的临床慢性疾病，大量研究显示炎性反应、胰岛素抵抗、免疫功能缺陷以及其他内分泌激素代谢异常疾病均是骨质疏松发生发展的病理因素[6-9]。本研究制备骨质疏松模型鼠，经过HE染色显示成模大鼠股骨骨小梁排列紊乱，变细且稀疏，同时存在大片骨小梁缺失区域，并且在骨组织形态计量学研究中证实骨质疏松模型大鼠不但在骨结构力学（最大载荷、弹性载荷、断裂载荷和弯曲能量）而且材料力学（刚性系数）性能均较正常大鼠明显下降，这提示骨质疏松模型大鼠骨组织不论是宏观力学还是微观形态学结构方面均出现典型改变，这与国内外诸多文献所得结果一致[10-12]，亦证实本研究造模成功。
中医并无骨质疏松病名记载，但其病因病机与“骨痹”“骨痿”“骨蚀”“痛症”“骨枯”等高度一致，故骨质疏松属于中医上述疾病范畴。中医古籍记载肾主骨生髓，与骨疾病关系密切[13-14]。肾为先天之本，主骨生髓而养骨，肾精充盛则骨髓生化有源，骨髓充足則骨骼得养，从而坚劲有力、耐久立而强劳作，如若肾精亏虚，肾精生发乏源，骨骼疲软无力。此外，肾虚气血生化乏源，元气不足而气血运化不畅而致瘀，瘀血阻滞于络脉，水谷精微布散障碍，骨髓由此无法濡养骨骼而出现骨痛、脊柱变形、脆性骨折等骨质疏松相关性临床症状[15-16]，就如《医林改错》书中描述：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”;《黄帝内经》亦认为：“老者之气血衰，其肌肉枯，气道涩”，由此肾虚是骨质疏松发病之本，血瘀是发病之标，本病乃本虚标实。因此治疗本病的关键在于“补肾化瘀”，基于此，王清任创立了身痛逐瘀汤以实现从气血入手治疗“诸痹症疼痛”。方中桃仁、红花共奏活血化瘀之功，共为君药;五灵脂、没药、香附是行气活血之品，共为臣药;羌活、秦艽可祛风除湿，牛膝有活血通络止痛的作用，地龙可加强通络舒筋之功，川芎、当归加强君药活血通络作用的同时可养血润燥，续断、狗脊以补肝肾，续筋骨，调血脉。整方共奏活血化瘀、通痹止痛、补肾强骨之功。在本研究中我们发现经过加味身痛逐瘀汤干预后大鼠骨结构力学及材料力学性能均出现明显提升，形态学研究亦显示大鼠骨组织骨小梁排列紊乱，变细且稀疏的征象明显减轻，结构大致清晰，偶见骨小梁断裂，这说明加味身痛逐瘀汤确对骨质疏松有明显疗效。
目前有研究显示微量元素与骨质疏松关系密切，金属微量元素（铁、锌、镁等）微量元素维持机体骨代谢、骨转换正常进行的重要因素，有研究显示绝经后妇女多存在下丘脑-垂体-性腺轴功能减退，下丘脑-垂体-性腺轴是调节机体内分泌代谢的关键部位，而微量元素又广泛参与调节机体的内分泌代谢过程，二者相辅相成[17]。在诸多微量元素中锌、镁、铁是重要因子，锌的缺乏会影响垂体促性腺激素的分泌释放，使垂体中促生长激素减少，进而出现性功能低和成骨作用减弱。Fe广泛参与调节机体新骨形成及骨转化环节，Fe的表达高低直接影响骨矿物质形成和骨基质合成程度，从而影响骨质疏松的发病发展。有研究人员通过实验研究证实补充微量元素可促进成骨细胞的增殖和分化，促进骨质疏松的改善[18]。因此调节微量元素的表达是改善骨质疏松的关键。本研究显示模型组大鼠外周血清Fe、Zn、Mg水平均显著下降，这证实了骨质疏松发生发展过程中金属元素水平确发生变化，而经过加味身痛逐瘀汤干预后大鼠外周血Fe、Zn、Mg水平明显提高，这说明加味身痛逐瘀汤对骨质疏松模型大鼠骨组织显微结构及生物力学性能的作用可能通过调节机体金属元素表达而实现的。
参考文献
[1]王潇潇，罗之柱，刘昊为.杜仲摄入结合振动训练干预去卵巢联合地塞米松骨质疏松模型大鼠骨密度、骨代谢及骨生物力学的变化[J].中国组织工程研究，2019，23（31）：4998-5004.
[2]席永斌，颜春鲁，孙仕华，等.从Wnt/β-catenin信号通路研究地黄饮子汤剂对去卵巢骨质疏松模型大鼠的防治作用[J].中医研究，2019，6（8）：67-70.
[3]李娜，杜丽坤，王冰梅.原发性骨质疏松症的中医证素辨证法[J].中国骨质疏松杂志，2019，25（7）：1010-1014.
[4]谢兴文，李建国，黄晋，等.血管内皮生长因子防治骨质疏松的研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2019，25（7）：1030-1033.
[5]沈健，陈秋晴，曹兰兰，等.吡格列酮对去卵巢大鼠骨代谢指标的影响及机制[J].中国临床药理学杂志，2019，35（13）：1359-1362.
[6]陈丹丹，欧国峰，董博，等.太白楤木与珠子参不同配伍对骨质疏松大鼠模型骨代谢指标及骨生物力学的影响[J].河北中医，2019，41（12）：1862-1867.
[7]赵航，马慧娟，王超.骨质疏松症相关基因研究进展[J].实用老年医学，2019，33（6）：523-527.
[8]李娜，方红丽，邓苙.原发性骨质疏松影响因素及健康干预研究进展[J].昆明医科大学学报，2019，40（6）：135-139.
[9]闫子惠，张金梅，银艳.骨质疏松症的中医诊治研究进展[J].世界最新医学信息文摘，2019，19（42）：82，86.
[10]姚毅，郑德禄，于萌，等.骨质疏松发病机制研究进展[J].心理月刊，2019，14（9）：194.
[11]马江涛，柴爽，万雷，等.维生素D缺乏对骨和骨外作用研究进展[J].中国骨质疏松杂志：2019，5（13）：1-10.
[12]李明，李宁宁.维生素D受体基因多态性与骨质疏松症相关性的研究进展[J].右江医学，2019，47（4）：245-249.
[13]彭勋潜，李艳利，莫枢，辛灵.原发性骨质疏松症的中医研究近况[J].临床医学研究与实践，2019，4（9）：197-198.
[14]金瑜.中医药治疗骨质疏松症的疗效分析[J].临床医药文献（连续型电子期刊），2019，6（20）：72-73.
[15]李志远，吴泽莉，方坚.中医辨证论治原发性骨质疏松症疗效观察[J].中医药临床杂志，2019，31（2）：323-326.
[16]杨宗德.中医药治疗骨质疏松症研究进展[J].系统医学，2019，4（4）：193-195.
[17]陈凌志，王力，郭永强，等.补肾健骨中药改善肾虚型骨质疏松症的作用机制探讨[J].实用中西医结合临床，2019，19（10）：179-181.
[18]林上进，程群，邵云潮，等.血骨代谢指标及骨密度与骨组织钙、磷及金属微量元素含量的相关性[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2017，10（6）：513-518.
（2019-10-16收稿 责任编辑：芮莉莉）