【摘 要】
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【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）NS5A基因，获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析，以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列（GenBank登录号：KX170647）设计并合成1对特异性引物，以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模
【基金项目】
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甘肃省自然科学基金（20JR5RA505）； 校企横向科研项目（2021西民合（科研）第175号）；
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【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）NS5A基因，获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析，以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列（GenBank登录号：KX170647）设计并合成1对特异性引物，以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板，PCR扩增NS5A基因片段，并克隆至表达载体pET-28a（+）中，构建重组原核表达载体pET28a-NS5A。经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，然后利用IPTG诱导表达。经10%SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达，并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树，利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性，并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测。【结果】PCR扩增NS5A目的基因片段为1 488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明，重组质粒pET28a-NS5A构建成功。经10%SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白，表达出了大小为55 ku的目的蛋白，大小与预期结果相符。通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树，显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型。NS5A蛋白的亲水性主要位于12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463、469—495位氨基酸处，表面可塑性主要位于14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸处，柔性区域较多，主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸处。NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸处。【结论】成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型，NS5A蛋白具有良好的抗原性，为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考。
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