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摘要：为了进一步完善麻黄-桂枝药对的质量评价方法，利用HPLC法，分别在2种波长条件下，同时测定麻黄-桂枝水煎液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5种成分的含量。采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，波长分别为210，280 nm。结果表明，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸和桂皮醛的进样量分别为0.292 6～2.926 0，0.205 6～2.056 0，0.016 2～0.162 0 ，0.021 8～0.218 0，0.052 6～0.526 0 μg时，均呈现出良好的线性关系（r≥0.999 1）;平均加样回收率为96.24%～104.03%（RSD<3%，n=9）。建立的检测方法准确、可靠，可为麻黄-桂枝药对的质量控制及配伍研究提供参考。
关键词：中药化学;高效液相色谱;波长切换;含量测定;麻黄;桂枝;药对
中图分类号：R284.1文献标识码：ADOI： 10.7535/hbgykj.2021yx03005
Abstract：In order to further improve the quality evaluation method of Ephedra-Cinnamomi Ramulus drug pair， the contents of ephedrine hydrochloride， pseudoephedrine hydrochloride， coumarin， cinnamic acid and cinnamaldehyde in the decoction of Ephedra-Cinnamomi Ramulus were determined by HPLC at two wavelengths. The analysis was carried out on a Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） by gradient elution with acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was controlled at 35 ℃.The detection wavelength was 210 nm and 280 nm respectively. The results show that it has a good linearity in the ranges of 0.292 6～2.926 0， 0.205 6～2.056 0， 0.016 2～0.162 0， 0.021 8～0.218 0 and 0.052 6～0.526 0 μg for ephedrine hydrochloride， pseudoephedrine hydrochloride， coumarin， cinnamic acid and cinnamaldehyde， respectively （r≥0.999 1）. The average recovery rates are 96.24%～104.03% （RSD<3%， n=9）. The established detection method is accurate and reliable， which can provide reference for the quality control and compatibility research of Ephedra-Cinnamomi Ramulus drug pair.
Keywords：chemistry of Chinese material medical; HPLC; wavelength switching; content determination; Ephedra; Cinnamomi Ramulus; drug pair
麻黃-桂枝药对出自《伤寒论》麻黄汤，为辛温解表的常用组合[1]。麻黄味辛、微苦，性温，具有发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿之功效;桂枝味辛、甘，性温，具有发汗解肌，温通经脉，助阳化气，平冲降气之功效[2]。麻黄善行肌表卫分，乃发汗之要药，桂枝透营达卫，助麻黄解表散邪，麻黄、桂枝相须为用[3-5]。麻黄的化学成分主要包括生物碱类、挥发油类等[6]，桂枝主要含有挥发油类、有机酸类等[7-8]。查阅文献，对麻黄-桂枝药对的研究多集中在药理活性等方面[9-12]，对其化学成分研究较少。徐文杰等[13]研究不同配伍配比对麻黄-桂枝药对有效成分含量的影响，分别采用GC-MS测定水煎液中麻黄类生物碱含量，采用HPLC测定水煎液中香豆素、桂皮醇、桂皮醛的含量。李晓如等[14]利用气相色谱-质谱对麻黄-桂枝的挥发油成分进行测定。目前未见HPLC法同时测定麻黄-桂枝水煎液中麻黄类生物碱和肉桂酸、桂皮醛等主要成分的报道。本实验建立HPLC法同时测定麻黄-桂枝药对水煎液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸和桂皮醛5种成分的含量，为麻黄-桂枝药对的质量控制及配伍的研究提供参考。第3期王迎春，等：HPLC法同时测定麻黄-桂枝药对水煎液中5种成分的含量河北工业科技第38卷
1仪器与材料
1.1仪器
LC-15C高效液相色谱仪（SPD-15C型紫外检测器，日本岛津公司提供）;TB-215D电子分析天平（十万分之一）、BSA224S-CW电子分析天平（万分之一）（德国赛多利斯集团提供）;KQ-250E型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司提供）。
1.2材料 盐酸麻黄碱（批号为171241-201508，纯度为99.8%）、盐酸伪麻黄碱（批号为171237-201510，纯度为99.8%）、肉桂酸（批号为110786-201604，纯度为98.8%），中国食品药品检定研究院提供;香豆素（批号为MUST-18040901，纯度为99.99%），成都曼思特生物科技有限公司提供;桂皮醛（批号为151119，纯度大于等于98.0%），成都普菲德生物技术有限公司提供。甲醇、乙腈（色谱纯），Fisher公司提供;磷酸（分析纯），天津市北方天医化学试剂厂提供;水为超纯水。实验所用中药饮片均为市售中药饮片，3批麻黄、桂枝饮片分别购自石家庄乐仁堂（麻黄批号为19111001，桂枝批号为20022101）、神威大药房（麻黄批号为19050101，桂枝批号为19031617）和新兴大药房（麻黄批号为2002121，桂枝批号为190902cp256），经河北省药品检验院孙宝惠（主任）鉴定，麻黄为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf.的干燥草质茎，桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥嫩枝。
2方法与结果
2.1麻黄-桂枝水煎液制备
称取麻黄饮片12.0 g，桂枝饮片8.0 g，加10倍量水，麻黄浸泡30 min，先煎煮20 min，加入桂枝继续煎煮，煮沸后保持微沸30 min，过滤;药渣加8倍量水，煮沸后保持微沸20 min，过滤;合并2次滤液，定容至300 mL，得麻黄-桂枝水煎液。
2.2溶液制备
2.2.1对照品溶液
分别精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为1.219，0.514，1.017，0.546，0.526 mg/mL的单一对照品储备液。分别精密量取一定量的上述储备液，置于同一量瓶中，加甲醇制成每1 mL含盐酸麻黄碱146.3 μg、盐酸伪麻黄碱102.8 μg、香豆素8.1 μg、肉桂酸10.9 μg、桂皮醛28.4 μg的混合对照品溶液。
2.2.2供试品溶液
精密吸取2.1项中麻黄-桂枝水煎液4 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2.3色譜条件
色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1，检测波长分别为210 nm（0～20 min）、280 nm（20～60 min），流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为10 μL。混合对照品和供试品溶液的HPLC色谱图如图1所示。
2.4方法学考察
2.4.1线性关系考察
分别精密吸取混合对照品溶液2，4，6，10，15，20 μL，按2.3项中色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归，回归方程与线性范围结果见表2。
2.4.2精密度试验
精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.3项中色谱条件连续进样6次，计算各成分峰面积的RSD，依次为0.51%，0.63%，0.78%，0.52%，0.47%。结果表明仪器的精密度良好。
2.4.3稳定性试验
取同一份供试品溶液，分别在0，4，8，12，16，24 h按2.3项中色谱条件测定，计算各成分峰面积的RSD，依次为1.23%，0.82%，0.94%，0.59%，1.60%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.4重复性试验
取同一批麻黄-桂枝水煎液，按2.2.2制备6份供试品溶液，按2.3中色谱条件测定，计算各成分的平均质量浓度，分别为0.319 2，0.246 8，0.020 1，0.029 4，0.054 1 mg/mL，RSD分别为2.08%，1.75%，1.83%，1.68%，1.82%。结果表明该方法的重复性良好。
2.4.5加样回收试验
精密吸取已测得含量的麻黄-桂枝水煎液2.0 mL，平行吸取9份，分别精密加入等同于样品中各成分含有量50%，100%，150%的各单一对照品储备液，按照2.2.2项制备供试品溶液，按2.3项中色谱条件测定，计算加样回收率及RSD，结果见表3。
2.5样品测定
取3批次麻黄、桂枝饮片，按2.1项中制备麻黄-桂枝水煎液，按2.2.2项制备供试品溶液，按2.3项中色谱条件测定，平行3次，计算3批水煎液样品中各成分的含量，结果见表4。
3讨论
麻黄-桂枝为临床上常用的药对，是《伤寒论》中辛温发汗的常用组合。《伤寒论》中涉及麻黄-桂枝配伍的方剂有9方，分别是麻黄汤（3∶2）、葛根汤（3∶2）、葛根加半夏汤（3∶2）、大青龙汤（3∶1）、小青龙汤（1∶1）、桂枝二越婢一汤（1∶1）、桂枝麻黄各半汤（8∶13）、桂枝二麻黄一汤（5∶13）、麻黄升麻汤（10∶1），各方中麻黄-桂枝的配伍比例以3∶2居多[15]。本实验参考《伤寒论》中涉及麻黄-桂枝配伍方剂的煎煮方法，查阅相关文献[16-17]，结合《医疗机构中药煎药室管理规范》要求，确定了2.1项中样品溶液制备方法。
本实验分别考察了乙腈-1%醋酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸3种流动相系统，以各色谱峰的分离度和峰形为指标进行比较，结果发现乙腈-0.1%磷酸作为流动相梯度洗脱时，各色谱峰的分离度及峰形较好，故选择乙腈-0.1%磷酸为流动相。
采用PDA检测器在200～400 nm进行紫外吸收光谱扫描，结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5种化学成分的最大吸收波长分别为205，205，276，276，288 nm，由此选择210 nm作为检测盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的波长，选择280 nm作为检测香豆素、肉桂酸、桂皮醛的波长。 4结语
本实验通过切换波长，建立了HPLC法同时测定麻黄-桂枝药对水煎液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5种化学成分含量的分析方法，共测定了3批麻黄-桂枝水煎液中上述5种成分的含量。结果显示，不同批次麻黄-桂枝水煎液中上述5种成分的含量波动较大，特别是盐酸伪麻黄碱和桂皮醛的含量。这可能与实验用的3批麻黄、桂枝的厂家、采收时间及存放时间不同有关。本实验所建立的方法操作简便，重复性好，可为麻黄-桂枝药对的质量控制与评价及后续研究提供参考。
本实验仅对市售的3批不同厂家的麻黄和桂枝饮片按3∶2配比制备的水煎液进行了5种成分的含量测定，后续将会增加样本数目，分别测定麻黄、桂枝单煎液和麻黄-桂枝合煎液中主要成分的含量，考察麻黄、桂枝配伍前后各成分含量变化情况。不同配伍配比的麻黄-桂枝水煎液中各成分的含量变化规律及药效学考察有待进一步研究。
参考文献/References：
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关键词：中药化学;高效液相色谱;波长切换;含量测定;麻黄;桂枝;药对
中图分类号：R284.1文献标识码：ADOI： 10.7535/hbgykj.2021yx03005
Abstract：In order to further improve the quality evaluation method of Ephedra-Cinnamomi Ramulus drug pair， the contents of ephedrine hydrochloride， pseudoephedrine hydrochloride， coumarin， cinnamic acid and cinnamaldehyde in the decoction of Ephedra-Cinnamomi Ramulus were determined by HPLC at two wavelengths. The analysis was carried out on a Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） by gradient elution with acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was controlled at 35 ℃.The detection wavelength was 210 nm and 280 nm respectively. The results show that it has a good linearity in the ranges of 0.292 6～2.926 0， 0.205 6～2.056 0， 0.016 2～0.162 0， 0.021 8～0.218 0 and 0.052 6～0.526 0 μg for ephedrine hydrochloride， pseudoephedrine hydrochloride， coumarin， cinnamic acid and cinnamaldehyde， respectively （r≥0.999 1）. The average recovery rates are 96.24%～104.03% （RSD<3%， n=9）. The established detection method is accurate and reliable， which can provide reference for the quality control and compatibility research of Ephedra-Cinnamomi Ramulus drug pair.
Keywords：chemistry of Chinese material medical; HPLC; wavelength switching; content determination; Ephedra; Cinnamomi Ramulus; drug pair
麻黃-桂枝药对出自《伤寒论》麻黄汤，为辛温解表的常用组合[1]。麻黄味辛、微苦，性温，具有发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿之功效;桂枝味辛、甘，性温，具有发汗解肌，温通经脉，助阳化气，平冲降气之功效[2]。麻黄善行肌表卫分，乃发汗之要药，桂枝透营达卫，助麻黄解表散邪，麻黄、桂枝相须为用[3-5]。麻黄的化学成分主要包括生物碱类、挥发油类等[6]，桂枝主要含有挥发油类、有机酸类等[7-8]。查阅文献，对麻黄-桂枝药对的研究多集中在药理活性等方面[9-12]，对其化学成分研究较少。徐文杰等[13]研究不同配伍配比对麻黄-桂枝药对有效成分含量的影响，分别采用GC-MS测定水煎液中麻黄类生物碱含量，采用HPLC测定水煎液中香豆素、桂皮醇、桂皮醛的含量。李晓如等[14]利用气相色谱-质谱对麻黄-桂枝的挥发油成分进行测定。目前未见HPLC法同时测定麻黄-桂枝水煎液中麻黄类生物碱和肉桂酸、桂皮醛等主要成分的报道。本实验建立HPLC法同时测定麻黄-桂枝药对水煎液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸和桂皮醛5种成分的含量，为麻黄-桂枝药对的质量控制及配伍的研究提供参考。第3期王迎春，等：HPLC法同时测定麻黄-桂枝药对水煎液中5种成分的含量河北工业科技第38卷
1仪器与材料
1.1仪器
LC-15C高效液相色谱仪（SPD-15C型紫外检测器，日本岛津公司提供）;TB-215D电子分析天平（十万分之一）、BSA224S-CW电子分析天平（万分之一）（德国赛多利斯集团提供）;KQ-250E型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司提供）。
1.2材料 盐酸麻黄碱（批号为171241-201508，纯度为99.8%）、盐酸伪麻黄碱（批号为171237-201510，纯度为99.8%）、肉桂酸（批号为110786-201604，纯度为98.8%），中国食品药品检定研究院提供;香豆素（批号为MUST-18040901，纯度为99.99%），成都曼思特生物科技有限公司提供;桂皮醛（批号为151119，纯度大于等于98.0%），成都普菲德生物技术有限公司提供。甲醇、乙腈（色谱纯），Fisher公司提供;磷酸（分析纯），天津市北方天医化学试剂厂提供;水为超纯水。实验所用中药饮片均为市售中药饮片，3批麻黄、桂枝饮片分别购自石家庄乐仁堂（麻黄批号为19111001，桂枝批号为20022101）、神威大药房（麻黄批号为19050101，桂枝批号为19031617）和新兴大药房（麻黄批号为2002121，桂枝批号为190902cp256），经河北省药品检验院孙宝惠（主任）鉴定，麻黄为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf.的干燥草质茎，桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥嫩枝。
2方法与结果
2.1麻黄-桂枝水煎液制备
称取麻黄饮片12.0 g，桂枝饮片8.0 g，加10倍量水，麻黄浸泡30 min，先煎煮20 min，加入桂枝继续煎煮，煮沸后保持微沸30 min，过滤;药渣加8倍量水，煮沸后保持微沸20 min，过滤;合并2次滤液，定容至300 mL，得麻黄-桂枝水煎液。
2.2溶液制备
2.2.1对照品溶液
分别精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为1.219，0.514，1.017，0.546，0.526 mg/mL的单一对照品储备液。分别精密量取一定量的上述储备液，置于同一量瓶中，加甲醇制成每1 mL含盐酸麻黄碱146.3 μg、盐酸伪麻黄碱102.8 μg、香豆素8.1 μg、肉桂酸10.9 μg、桂皮醛28.4 μg的混合对照品溶液。
2.2.2供试品溶液
精密吸取2.1项中麻黄-桂枝水煎液4 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2.3色譜条件
色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1，检测波长分别为210 nm（0～20 min）、280 nm（20～60 min），流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为10 μL。混合对照品和供试品溶液的HPLC色谱图如图1所示。
2.4方法学考察
2.4.1线性关系考察
分别精密吸取混合对照品溶液2，4，6，10，15，20 μL，按2.3项中色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归，回归方程与线性范围结果见表2。
2.4.2精密度试验
精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.3项中色谱条件连续进样6次，计算各成分峰面积的RSD，依次为0.51%，0.63%，0.78%，0.52%，0.47%。结果表明仪器的精密度良好。
2.4.3稳定性试验
取同一份供试品溶液，分别在0，4，8，12，16，24 h按2.3项中色谱条件测定，计算各成分峰面积的RSD，依次为1.23%，0.82%，0.94%，0.59%，1.60%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.4重复性试验
取同一批麻黄-桂枝水煎液，按2.2.2制备6份供试品溶液，按2.3中色谱条件测定，计算各成分的平均质量浓度，分别为0.319 2，0.246 8，0.020 1，0.029 4，0.054 1 mg/mL，RSD分别为2.08%，1.75%，1.83%，1.68%，1.82%。结果表明该方法的重复性良好。
2.4.5加样回收试验
精密吸取已测得含量的麻黄-桂枝水煎液2.0 mL，平行吸取9份，分别精密加入等同于样品中各成分含有量50%，100%，150%的各单一对照品储备液，按照2.2.2项制备供试品溶液，按2.3项中色谱条件测定，计算加样回收率及RSD，结果见表3。
2.5样品测定
取3批次麻黄、桂枝饮片，按2.1项中制备麻黄-桂枝水煎液，按2.2.2项制备供试品溶液，按2.3项中色谱条件测定，平行3次，计算3批水煎液样品中各成分的含量，结果见表4。
3讨论
麻黄-桂枝为临床上常用的药对，是《伤寒论》中辛温发汗的常用组合。《伤寒论》中涉及麻黄-桂枝配伍的方剂有9方，分别是麻黄汤（3∶2）、葛根汤（3∶2）、葛根加半夏汤（3∶2）、大青龙汤（3∶1）、小青龙汤（1∶1）、桂枝二越婢一汤（1∶1）、桂枝麻黄各半汤（8∶13）、桂枝二麻黄一汤（5∶13）、麻黄升麻汤（10∶1），各方中麻黄-桂枝的配伍比例以3∶2居多[15]。本实验参考《伤寒论》中涉及麻黄-桂枝配伍方剂的煎煮方法，查阅相关文献[16-17]，结合《医疗机构中药煎药室管理规范》要求，确定了2.1项中样品溶液制备方法。
本实验分别考察了乙腈-1%醋酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸3种流动相系统，以各色谱峰的分离度和峰形为指标进行比较，结果发现乙腈-0.1%磷酸作为流动相梯度洗脱时，各色谱峰的分离度及峰形较好，故选择乙腈-0.1%磷酸为流动相。
采用PDA检测器在200～400 nm进行紫外吸收光谱扫描，结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5种化学成分的最大吸收波长分别为205，205，276，276，288 nm，由此选择210 nm作为检测盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的波长，选择280 nm作为检测香豆素、肉桂酸、桂皮醛的波长。 4结语
本实验通过切换波长，建立了HPLC法同时测定麻黄-桂枝药对水煎液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5种化学成分含量的分析方法，共测定了3批麻黄-桂枝水煎液中上述5种成分的含量。结果显示，不同批次麻黄-桂枝水煎液中上述5种成分的含量波动较大，特别是盐酸伪麻黄碱和桂皮醛的含量。这可能与实验用的3批麻黄、桂枝的厂家、采收时间及存放时间不同有关。本实验所建立的方法操作简便，重复性好，可为麻黄-桂枝药对的质量控制与评价及后续研究提供参考。
本实验仅对市售的3批不同厂家的麻黄和桂枝饮片按3∶2配比制备的水煎液进行了5种成分的含量测定，后续将会增加样本数目，分别测定麻黄、桂枝单煎液和麻黄-桂枝合煎液中主要成分的含量，考察麻黄、桂枝配伍前后各成分含量变化情况。不同配伍配比的麻黄-桂枝水煎液中各成分的含量变化规律及药效学考察有待进一步研究。
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