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目的 对杨梅素通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路诱导MTB感染的巨噬细胞发生自噬进行研究,从而探讨杨梅素抗结核作用的机理.方法 用CCK8法检测杨梅素对细胞增殖的影响,确定安全的用药范围;以H37Ra菌株感染的小鼠巨噬细胞Raw 264.7为模型组,并设空白组和药物处理组.按感染复数(MOI,即细菌∶细胞=10∶1)加入模型组、药物处理组,共孵育4h后,磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次以弃掉未进入胞内的MTB.药物处理组分别用不同浓度(12.5、25、50、100μmol/L)的杨梅素作用24h,Western blot法检测自噬相关蛋白即“微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和p62”表达水平的变化,并以此筛选出杨梅素促进自噬的最佳作用浓度;100μmol/L杨梅素作用于感染细胞72 h后,0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)冰上裂解细胞10 min,菌落形成单位(CFU)法检测巨噬细胞胞内荷菌量;杨梅素作用感染细胞不同时间(30、60、180 min)后Western blot测定PI3K/Akt/mTOR信号通路中Akt、mTO R的磷酸化水平.以Image J软件做蛋白定量分析,用GraphPad Prism 7.0制图,采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 杨梅素在100 μmol/L浓度以下细胞生存率在90％左右,对细胞毒性较小;Western blot结果显示:与模型组(0.52±0.01)相比,杨梅素不同浓度(12.5、25、50、100 μmol/L)处理均能促进LC3Ⅱ的表达(0.59±0.02、0.65±0.01、0.71±0.01、0.83±0.01),差异有统计学意义(t=2.97、P=0.04,t=7.91、P=0.00,t=9.77、P=0.00,t=16.37、P=0.00);而较模型组p62蛋白(0.86±0.02),药物处理亦能抑制p62的表达(0.72±0.01、0.86±0.00、0.60±0.02、0.58±0.01),25 μmol/L杨梅素处理组差异无统计学意义(t=0.81、P=0.46),12.5、50、100 μmol/L处理组差异均有统计学意义(t=6.50、P=0.00,t=9.53、P=0.00,t=12.01、p=0.00);杨梅素促进自噬的最佳药物浓度为100 μmol/L;100μmol/L杨梅素作用于感染细胞72 h后,对胞内MTB的抑制率为21.02％;模型组细胞在MTB感染后30、60、180 min时,PI3K/Akt/mTOR通路中Akt蛋白的磷酸化(p Akt)水平(1.23±0.01、1.52±0.01、0.74±0.02)明显增加,而杨梅素作用相同的时间后,可明显抑制Akt蛋白的磷酸化(0.99±0.01、0.96±0.01、0.43±0.01),差异有统计学意义(t=27.60、P=0.00,t=30.06、P=0.00,t=18.60、P=0.00);而模型组磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白水平仅在MTB感染后180 min(0.57±0.00)明显增加(t=94.61、P=0.00),杨梅素作用180 min亦能抑制mTOR蛋白的磷酸化(0.46±0.01),差异有统计学意义(t=21.60、P=0.00).结论 杨梅素通过抑制Akt和mTOR蛋白的磷酸化来抑制PI3K/Akt/mTOR通路,从而诱导MTB感染的巨噬细胞发生自噬来杀灭胞内的MTB.