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摘要：以猪源偶发分枝杆菌菌株染色体DNA为模版，以recA基因设计引物进行PCR扩增，获得约1000bp的DNA片段，将扩增产物片段克隆至pGM-T载体中，通过蓝白班筛选、质粒PCR鉴定以及序列分析鉴定，成功构建pGM-T- recA重组质粒，为进一步研究偶发分枝杆菌katGI基因及其在偶发分枝杆菌疾病的检验、免疫和预防治疗提供了一定的基础。
关键词：猪源偶发分枝杆菌；katGI基因；克隆；序列分析
中图分类号：S85 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-04-0093-2
上个世纪中期以前，非结核分枝杆菌被认为是不致病的，没有引起人们的关注。但随着艾滋病（AIDS）的出现以及临床滥用抗生素和免疫抑制剂等药物，造成患者免疫力下降和强耐药性菌株的不断出现，偶发分枝杆菌（M.fortuitum）等非结核分枝杆菌感染病例的报道日渐增多[1]。研究表明，M.fortuitum与抗生素的滥用有关，且具有极强的适应性，具有变异的可能性，因此，一般检测方法不能检出，普通抗菌药物也不能有效治疗，这给人类的健康造成了严重的困扰。本研究对长春地区正常屠宰的猪体内分离出的M.fortuitum核酸修复蛋白基因（recA）基因进行了克隆并分析其序列，旨在为M.fortuitum的药物开发研究和感染后治疗提供基础分子生物学资料。
1 材料与方法
1.1 材料
猪偶发分枝杆菌菌种来源于吉林农业大学动物科技学院实验室保存菌种；扩增菌种用培养基为自行配置的改良罗氏培养基；Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、Buffer为天津天根生化科技（北京）有限公司产品；pGM-T载体、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligation Buffer、2×T4 DNA Ligation Buffer、TOP10感受态细胞、核酸分子量标准D2000及DP209离心柱型普通DNA凝胶回收试剂盒等为天津天根生化科技（北京）有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 核酸的提取 将猪源偶发分枝杆菌接种于改良罗氏培养基中培养，一周后刮取适量菌体在TE中混匀后用玻璃棒法提取染色体DNA，测OD值和电泳确定所得核酸质量符合实验要求。
1.2.2 引物的设计与合成 由于实验室保存的M. fortuitum菌株没有全基因序列信息，引物设计时考虑使用GeneBank中的标准菌株基因序列。查《伯杰细菌鉴定手册第九版》得M.fortuitum标准菌株为ATCC6841，查GeneBank得ATCC6841的recA基因序列登录号为AY458087.1。据此设计非特异性引物如下：recA-F：CCCGAGTACGCCAAGAAGC；recA-R：CCGTCACGACAGCACCGATA。此引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.3 基因的扩增 以猪源M. fortuitum染色体DNA为模版，以recA-F和recA-R为引物进行基因的扩增。PCR反应体系（总体积20μl）包含灭菌双蒸水14.4μl，10×Buffer 2μl，dNTP 1.6μl，模版DNA 1μl，上下游引物（10mmol/μl）各0.5μl, Taq DNA Polymerase（5U/μl）0.2μl。PCR反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸50秒，进行30个循环，72℃延伸10分钟。反应结束后，取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.4 扩增产物的纯化 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳切胶后用天津天根生化科技（北京）有限公司DP209离心柱型普通DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作方法按产品说明书进行。
1.2.5 基因的连接与转化 按照pGM-T连接试剂盒说明书要求将纯化的扩增产物与载体在连接酶的作用下16℃连接过夜，再取连接产物与TOP10感受态细胞按1：10转化，并将转化后菌液用无抗LB培养基复苏后涂布到用IPTG(50mg/ml)和X—gal(20mg/ml)处理过的Amp+(0.1mg/ml) LB平板上，干燥后37℃倒置培养过夜。
1.2.6 重组质粒的鉴定 挑取白色菌落接种于Amp+ LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，保存菌种后进行PCR菌检、提取质粒PCR检测和双酶切鉴定插入片段是否正确。
1.2.7 重组质粒的序列分析 取鉴定为阳性的菌液送北京华大六合基因科技股份有限公司進行测序，并对测序结果用BLAST进行序列分析。
2 结果与分析
2.1 基因的扩增
以猪源M. fortuitum染色体DNA为模板recA-F和recA-R为引物对recA基因进行PCR扩增，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1000bp长度的条带，与目的片段长度相近。约1500bp和约600bp处出现的为杂带，此为引物设计特异性不高所致，同时有少量引物二聚体出现（见图1）。
图1 M.fortuitum recA基因扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳
2.2 重组质粒的鉴定
图2：M.fortuitum recA基因重组质粒鉴定电泳（1%琼脂糖凝胶）
经过纯化的katG I基因扩增产物与pGM-T载体连接，构建重组质粒pGM-T-recA，通过蓝白班筛选、PCR菌检以及序列分析等方法鉴定重组质粒。其中通过PCR鉴定，可见到约1000bp的单一条带（见图2）。
2.3 基因的序列分析
将鉴定为阳性的重组质粒送北京华大六合基因科技股份有限公司进行测序，测序结果表明，所克隆的目的基因大小为1167bp，利用BLAST分析发现，所得基因与GeneBank中偶发分枝杆菌的recA基因AAS16318.1、AAP49236.1的序列相似度均为100%，由此确认此次扩增并克隆的产物为偶发分枝杆菌recA基因序列。
同时，根据BLAST结果还显示该序列与AAS16329.1（M.porcinum）、AAP49244.1（M.porcinum）、CAM07029.1（M.sp.MHSD11）同源性亦达100%，与M.album, M.aubagnense, M. aurum, M.avium, M.avium sp. avium ATCC 25291, M.avium sp. paratuberculosis K-10, M.chelonae, M.gadium, M.goodii, M.gordonae, M.houstonense, M.immunogenum, M.intracellulare ATCC 13950, M.jacuzzii, M.kansasii ATCC 12478, M.mageritense, M.marinum, M. mucogenicum, M.neworleansense, M.peregrinum, M.phlei, M.porcinum, M.scrofulaceum, M.septicum, M.simiae, M.smegmatis, M.sp.ATCC 35788, M.sp.MCS, M.szulgai, M.ulcerans Agy99, M.wolinskyi的同源性均在92%以上，可见该基因在分枝杆菌属内是十分保守性的。
3 讨论
M. fortuitum为条件致病菌，本菌广泛分布于各种水体、尘埃、土壤和动物体内。在分类学上隶属于裂殖菌纲（Schizomycetes）、放线菌目（Actinomycetales）、分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）、分枝杆菌属（Mycobacterium）。在Bergey细菌系统手册(1986)中，偶发分枝杆菌分为两个亚种，即偶发亚种（M.fortuitum sp fortuitum)和外来亚种（M.fortuitum sp peregrinum)。在前人的研究中，由于代谢特征和临床特征的原因，偶发分枝杆菌与龟分枝杆菌（M.chelonae）的两个亚种龟亚种和脓肿亚种难以区分，故统称为龟-偶发复合分枝杆菌（M.chelonae-M.fortuitum complex）。但后来的研究发现两者分子生物学和物理化学特性完全不同[2]。
M.fortuitum隶属于非结核分枝杆菌，过去曾被认为属于非致病性分枝杆菌，但是后来的事实表明，在人类或动物体的免疫力下降时，很多过去认为的非致病菌变成了致病菌。同时人们还发现，在大量使用抗菌药物后，部分细菌发生了变异，由非致病菌变成了致病菌。研究表明，M.fortuitum就具有极强的变异性。近年来就不断有M.fortuitum的病例出现。福建省南平市杨建等报道了39例患者因该市某基层诊所消毒不严格引起M.fortuitum感染[3]，北京协和医院王澎等从1例外科手术导致心内膜炎患者的血液和骨髓中分离出M.fortuitum[4]。蔡林等曾报道一例因长期饲养猪，疑似由外伤引起的M. fortuitum感染的病例[5]。
RecA蛋白是recA基因座的产物，在ATP存在的情况下，可沿着5’-3’方向结合在单链DNA上形成一种延长的右手螺旋DNA-蛋白质的复合物，来保护DNA不被核酸酶降解。该蛋白还可寻找和催化具有同源序列的DNA进行同源配对和修复。同时，RecA蛋白还能激活蛋白酶活性来控制SOS反应。
本研究以猪源M.fortuitum染色体DNA为模板，以引物recA-F和recA-R擴增recA基因．选用pGM-T载体成功克隆了猪源M.fortuitum RecA基因，经序列分析发现该基因在分枝杆菌属内部是十分保守的，这为进一步研究猪源M.fortuitum recA基因进行检验检疫和药物开发及预防治疗研究奠定了分子生物学基础。
参考文献
[11] 付素兰,任天红,刘景武,等.腹腔镜术后偶发分枝杆菌感染1例[J].河北医科大学学报,2008,29(4):622-623.
[2]黄梁浒,王德春,朱忠勇.偶发分枝杆菌的感染与实验研究进展[J].国外医学临床生物化学与检验学分册,2001,22(3):
148-149.
[3] 杨健,卢林琪,杨顺泰.偶发分枝杆菌医院感染39例报告[J].中华医院感染学杂志,2000,10(6):427.
[4]王澎,徐英春,张小江.心脏外科手术继发偶发分枝杆菌心内膜炎一例[J].中华检验医学杂志2005,28(3):336.
[5] 蔡林,宋英,张建中.龟分枝杆菌和偶发分枝杆菌皮肤感染[J].临床皮肤科杂志,2006,35(8):519-520.
作者简介：赵雪峰（1979-），男，江苏淮安人，吉林农业大学生物化学与分子生物学专业在读硕士研究生，研究方向：免疫分子生物学。
通讯作者：钱爱东，教授，博士。
关键词：猪源偶发分枝杆菌；katGI基因；克隆；序列分析
中图分类号：S85 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-04-0093-2
上个世纪中期以前，非结核分枝杆菌被认为是不致病的，没有引起人们的关注。但随着艾滋病（AIDS）的出现以及临床滥用抗生素和免疫抑制剂等药物，造成患者免疫力下降和强耐药性菌株的不断出现，偶发分枝杆菌（M.fortuitum）等非结核分枝杆菌感染病例的报道日渐增多[1]。研究表明，M.fortuitum与抗生素的滥用有关，且具有极强的适应性，具有变异的可能性，因此，一般检测方法不能检出，普通抗菌药物也不能有效治疗，这给人类的健康造成了严重的困扰。本研究对长春地区正常屠宰的猪体内分离出的M.fortuitum核酸修复蛋白基因（recA）基因进行了克隆并分析其序列，旨在为M.fortuitum的药物开发研究和感染后治疗提供基础分子生物学资料。
1 材料与方法
1.1 材料
猪偶发分枝杆菌菌种来源于吉林农业大学动物科技学院实验室保存菌种；扩增菌种用培养基为自行配置的改良罗氏培养基；Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、Buffer为天津天根生化科技（北京）有限公司产品；pGM-T载体、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligation Buffer、2×T4 DNA Ligation Buffer、TOP10感受态细胞、核酸分子量标准D2000及DP209离心柱型普通DNA凝胶回收试剂盒等为天津天根生化科技（北京）有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 核酸的提取 将猪源偶发分枝杆菌接种于改良罗氏培养基中培养，一周后刮取适量菌体在TE中混匀后用玻璃棒法提取染色体DNA，测OD值和电泳确定所得核酸质量符合实验要求。
1.2.2 引物的设计与合成 由于实验室保存的M. fortuitum菌株没有全基因序列信息，引物设计时考虑使用GeneBank中的标准菌株基因序列。查《伯杰细菌鉴定手册第九版》得M.fortuitum标准菌株为ATCC6841，查GeneBank得ATCC6841的recA基因序列登录号为AY458087.1。据此设计非特异性引物如下：recA-F：CCCGAGTACGCCAAGAAGC；recA-R：CCGTCACGACAGCACCGATA。此引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.3 基因的扩增 以猪源M. fortuitum染色体DNA为模版，以recA-F和recA-R为引物进行基因的扩增。PCR反应体系（总体积20μl）包含灭菌双蒸水14.4μl，10×Buffer 2μl，dNTP 1.6μl，模版DNA 1μl，上下游引物（10mmol/μl）各0.5μl, Taq DNA Polymerase（5U/μl）0.2μl。PCR反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸50秒，进行30个循环，72℃延伸10分钟。反应结束后，取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.4 扩增产物的纯化 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳切胶后用天津天根生化科技（北京）有限公司DP209离心柱型普通DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作方法按产品说明书进行。
1.2.5 基因的连接与转化 按照pGM-T连接试剂盒说明书要求将纯化的扩增产物与载体在连接酶的作用下16℃连接过夜，再取连接产物与TOP10感受态细胞按1：10转化，并将转化后菌液用无抗LB培养基复苏后涂布到用IPTG(50mg/ml)和X—gal(20mg/ml)处理过的Amp+(0.1mg/ml) LB平板上，干燥后37℃倒置培养过夜。
1.2.6 重组质粒的鉴定 挑取白色菌落接种于Amp+ LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，保存菌种后进行PCR菌检、提取质粒PCR检测和双酶切鉴定插入片段是否正确。
1.2.7 重组质粒的序列分析 取鉴定为阳性的菌液送北京华大六合基因科技股份有限公司進行测序，并对测序结果用BLAST进行序列分析。
2 结果与分析
2.1 基因的扩增
以猪源M. fortuitum染色体DNA为模板recA-F和recA-R为引物对recA基因进行PCR扩增，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1000bp长度的条带，与目的片段长度相近。约1500bp和约600bp处出现的为杂带，此为引物设计特异性不高所致，同时有少量引物二聚体出现（见图1）。
图1 M.fortuitum recA基因扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳
2.2 重组质粒的鉴定
图2：M.fortuitum recA基因重组质粒鉴定电泳（1%琼脂糖凝胶）
经过纯化的katG I基因扩增产物与pGM-T载体连接，构建重组质粒pGM-T-recA，通过蓝白班筛选、PCR菌检以及序列分析等方法鉴定重组质粒。其中通过PCR鉴定，可见到约1000bp的单一条带（见图2）。
2.3 基因的序列分析
将鉴定为阳性的重组质粒送北京华大六合基因科技股份有限公司进行测序，测序结果表明，所克隆的目的基因大小为1167bp，利用BLAST分析发现，所得基因与GeneBank中偶发分枝杆菌的recA基因AAS16318.1、AAP49236.1的序列相似度均为100%，由此确认此次扩增并克隆的产物为偶发分枝杆菌recA基因序列。
同时，根据BLAST结果还显示该序列与AAS16329.1（M.porcinum）、AAP49244.1（M.porcinum）、CAM07029.1（M.sp.MHSD11）同源性亦达100%，与M.album, M.aubagnense, M. aurum, M.avium, M.avium sp. avium ATCC 25291, M.avium sp. paratuberculosis K-10, M.chelonae, M.gadium, M.goodii, M.gordonae, M.houstonense, M.immunogenum, M.intracellulare ATCC 13950, M.jacuzzii, M.kansasii ATCC 12478, M.mageritense, M.marinum, M. mucogenicum, M.neworleansense, M.peregrinum, M.phlei, M.porcinum, M.scrofulaceum, M.septicum, M.simiae, M.smegmatis, M.sp.ATCC 35788, M.sp.MCS, M.szulgai, M.ulcerans Agy99, M.wolinskyi的同源性均在92%以上，可见该基因在分枝杆菌属内是十分保守性的。
3 讨论
M. fortuitum为条件致病菌，本菌广泛分布于各种水体、尘埃、土壤和动物体内。在分类学上隶属于裂殖菌纲（Schizomycetes）、放线菌目（Actinomycetales）、分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）、分枝杆菌属（Mycobacterium）。在Bergey细菌系统手册(1986)中，偶发分枝杆菌分为两个亚种，即偶发亚种（M.fortuitum sp fortuitum)和外来亚种（M.fortuitum sp peregrinum)。在前人的研究中，由于代谢特征和临床特征的原因，偶发分枝杆菌与龟分枝杆菌（M.chelonae）的两个亚种龟亚种和脓肿亚种难以区分，故统称为龟-偶发复合分枝杆菌（M.chelonae-M.fortuitum complex）。但后来的研究发现两者分子生物学和物理化学特性完全不同[2]。
M.fortuitum隶属于非结核分枝杆菌，过去曾被认为属于非致病性分枝杆菌，但是后来的事实表明，在人类或动物体的免疫力下降时，很多过去认为的非致病菌变成了致病菌。同时人们还发现，在大量使用抗菌药物后，部分细菌发生了变异，由非致病菌变成了致病菌。研究表明，M.fortuitum就具有极强的变异性。近年来就不断有M.fortuitum的病例出现。福建省南平市杨建等报道了39例患者因该市某基层诊所消毒不严格引起M.fortuitum感染[3]，北京协和医院王澎等从1例外科手术导致心内膜炎患者的血液和骨髓中分离出M.fortuitum[4]。蔡林等曾报道一例因长期饲养猪，疑似由外伤引起的M. fortuitum感染的病例[5]。
RecA蛋白是recA基因座的产物，在ATP存在的情况下，可沿着5’-3’方向结合在单链DNA上形成一种延长的右手螺旋DNA-蛋白质的复合物，来保护DNA不被核酸酶降解。该蛋白还可寻找和催化具有同源序列的DNA进行同源配对和修复。同时，RecA蛋白还能激活蛋白酶活性来控制SOS反应。
本研究以猪源M.fortuitum染色体DNA为模板，以引物recA-F和recA-R擴增recA基因．选用pGM-T载体成功克隆了猪源M.fortuitum RecA基因，经序列分析发现该基因在分枝杆菌属内部是十分保守的，这为进一步研究猪源M.fortuitum recA基因进行检验检疫和药物开发及预防治疗研究奠定了分子生物学基础。
参考文献
[11] 付素兰,任天红,刘景武,等.腹腔镜术后偶发分枝杆菌感染1例[J].河北医科大学学报,2008,29(4):622-623.
[2]黄梁浒,王德春,朱忠勇.偶发分枝杆菌的感染与实验研究进展[J].国外医学临床生物化学与检验学分册,2001,22(3):
148-149.
[3] 杨健,卢林琪,杨顺泰.偶发分枝杆菌医院感染39例报告[J].中华医院感染学杂志,2000,10(6):427.
[4]王澎,徐英春,张小江.心脏外科手术继发偶发分枝杆菌心内膜炎一例[J].中华检验医学杂志2005,28(3):336.
[5] 蔡林,宋英,张建中.龟分枝杆菌和偶发分枝杆菌皮肤感染[J].临床皮肤科杂志,2006,35(8):519-520.
作者简介：赵雪峰（1979-），男，江苏淮安人，吉林农业大学生物化学与分子生物学专业在读硕士研究生，研究方向：免疫分子生物学。
通讯作者：钱爱东，教授，博士。