论文部分内容阅读
[摘要] 近几年来,再生医学得到了飞速的发展,尤其在干细胞的诱导分化领域成为了研究热点。利用干细胞的强大分化潜能所培养出来的神经样细胞、心肌细胞、成骨样细胞、软骨细胞等为临床治疗提供了新的方案。随着中西结合治疗思想的深入,更多的学者将研究的重点投注于中药的诱导分化的研究。本文旨在探讨近几年来中药丹参及其主要成分对成体干细胞和胚胎干细胞(ES)的诱导分化作用的研究,提出当前研究存在的问题,为深入研究丹参的临床应用提供新思路,同时为进一步研究神经、心肌等组织细胞移植的组织工程学提供理论依据。
[关键词] 丹参;骨髓间质干细胞(MSC);ES;神经样细胞;心肌细胞;诱导分化
[中图分类号] R329.1 [中图分类号] A[文章编号] 1673-9701(2009)24-49-02
Stem Cell Differentiation and Mechanism Induced by Danshen: Research Progress
LUO XiaoxiuZHOU Long
7-Year Program of Clinical Medicine,China Medical University,Shenyang 110001,China
[Abstract] In recent years,regenerative medicine has been developed rapidly,particularly in stem cell induced differentiation field. The nerve-like cells,myocardial cells,osteoblast-like cells and cartilage cells and so on cultured by differentiation of stem cells provide a new program for clinical treatment. With the development of combined traditional Chinese and western medicine in the treatment of diseases,more scholars focus on researches of the induced differentiation of Chinese medicine. This paper aims to explore the induced differentiation of adult stem cells and embryonic stem cells by traditional Chinese medicine Danshen and its major components in recent years,and at the same time,point out current research problems,providing new ideas for the clinical application of Danshen and a theoretical basis for tissue engineering.
[Key Words] Danshen;Bone marrow mesenchymal stem cell;Embryonic stem cell;Neuron-like cells;Myocardial cell;Induced differentiation
1丹参的主要成分和药理作用
丹参为唇形科植物,味苦,性微寒,具有活血祛瘀、养血安神、调经止痛、凉血消痈的功效。现就其有效成分、药理作用介绍如下:丹参的有效成分主要分为脂溶性和水溶性两大类。丹参中脂溶性成分主要为丹参酮型的二萜类化合物,主要包括丹参酮Ⅰ、ⅡA、ⅡB、隐丹参酮等。它具有改善微循环、抗炎、抗凝、抗氧化等作用,其中以丹参酮ⅡA含量最高、活性最强;丹参酮具有较强的抗菌作用。研究表明,丹参酮还具有诱导肿瘤细胞凋亡[1]、抑制成骨细胞分化[2]、抑制血管平滑肌细胞增生[3]等作用。
丹参的水溶性成分主要为酚性酸类化合物,包括丹参素、原儿茶醛、丹酚酸A/B等,具有改善微循环、抗血栓、促进组织恢复等多种活性。总酚酸类成分具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基等作用,其中含量最高的两个成分丹酚酸A和B活性最强,对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保护作用[4]。研究表明,丹酚酸B还具有肝细胞保护作用[5],促进体外血管生成等作用。
2丹参对干细胞的诱导分化及其机制
诸多研究发现,丹参或其单体成分如丹参酮、丹参素、丹酚酸等均有对干细胞的诱导分化作用,有诱导成神经样细胞、心肌细胞、成骨样细胞、软骨样细胞等,尤其是向神经样细胞、心肌细胞分化做了大方面的研究,取得了很大的进展,为疑难杂病的治疗提供了新的方向。如下将主要从这两方面来综述。
2.1向神经样细胞的诱导分化及其机制
王勇等[6]用丹参体外诱导大鼠的MSCs发现,丹参诱导90min后,细胞发生了明显的形态学变化,大多数细胞转变为类似双极或多极神经元样形态,伸出轴突或树突样突起,并且表达神经干细胞的表面标志Nestin和成熟神经元的表面标志NSE,不表达神经胶质细胞表面标志GFAP,RT-PCR检测ngn-1、mash-1的表达也为阳性,说明丹参注射液有诱导BMSCs分化为神经元样细胞的能力,而且他们大胆地提出了丹参诱导MSCs向神经元样的分化可能与ngn-1,mash-1有关。而李禄全等[7]不仅发现丹参有诱导MSCs向神经样细胞的能力,并且提出不同剂量的诱导分化效率不同。笔者认为(100～200)g/L为最佳的体外诱导浓度。
人脐带来源的细胞有MSCs的性质,且来源丰富,为成功诱导脐带来源的细胞为中枢神经系统细胞的移植提供了丰富的资源。MA Lian等[8]从足月婴儿身上提取人脐带血细胞,并用丹参和β-巯基乙醇成功地诱导人脐带来源的间充质干细胞分化为神经元样细胞。经过丹参诱导后,其细胞形态显著改变,同时神经相关基因表达阳性。
众多的实验都证实了丹参的强诱导分化能力,而关于诱导干细胞分化成神经系统细胞的机制目前并不清楚,有许多推测:①从基因水平上来说,许多学者认为发育相关基因如bHLH家族中ngn-1,mash-1基因的表达,与细胞分化成熟过程密切相关,尤其与神经元的分化成熟密切相关。因为mash-1与神经元的分化成熟密切相关,nng-1在促进神经干细胞向神经元分化的同时抑制干细胞向胶质细胞分化。这可能是丹参大的诱导分化机制之一,但需要进一步的实验证实。②从发育生物学角度来说[9],MSCs来源于中胚层,而神经元来源于外胚层,一般认为MSCs在抗氧化剂(如2-巯基乙醇、叔丁基对甲氧酚)存在的条件下可向神经细胞分化。丹参注射液是一种抗氧化剂,含有丹参酮、总丹酚酸等多种抗氧化成分,常用于治疗缺血性脑血管病,其机制可能与总丹酚酸降低神经细胞缺氧损伤时的细胞死亡率,减少脂质过氧化物生成有关。据此还可推测丹参注射液诱导MSCs向神经元样细胞分化的机制也可能与其具有抗氧化作用有关。
2.2向心肌细胞的诱导分化
虽然丹参在心脑血管疾病方面有不可比拟的疗效,但研究丹参诱导干细胞向心肌细胞分化的报道还不是很多。然而这却为不可逆性的心肌损伤的治疗提供了新的希望。毫无疑问,研究中药如何诱导干细胞向心肌细胞分化将成为现代医学的一个新的切入点。
于艳秋等[10]利用转基因技术将pαMHC-EGFP质粒转染到小鼠D3系胚胎干细胞,构建了pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞株,当其向心肌细胞分化时,即MHC转录的同时就有EGFP的合成。因而心肌细胞具有绿色荧光蛋白的标记。利用丹参诱导pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化,并观察其诱导效果,结果显示,RT-PCR检测出αMHC、Anf、MLC2v基因在分化的心肌细胞中表达。丹参可明显提高第10、11、12天的心肌细胞分化率(P<0.01),以50mg/mL丹参的作用效果最明显(P<0.05),但对心肌细胞的分化时间没有明显影响。说明丹参可以体外提高pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞的分化率。范英昌等[11]也用实验证实丹酚酸B诱导骨髓基质细胞向心肌细胞转化的潜能,可作为细胞外科一种良好的移植细胞来源。诸多实验证实了丹参诱导干细胞向心肌细胞分化的可能性,但其机制还不是很清楚,需要进一步的研究。
3问题和展望
干细胞移植已经为干细胞治疗学拓展出新的道路,产生了新的技术方法。相信随着对干细胞诱导分化研究的深入,干细胞移植组织再生将是治疗疾病的有效手段之一。中医药介入组织工程学领域,如心肌细胞移植将是中医药走向现代化的一个切入点,具有重要的实际意义。
但是如何进行有效的分化调控,使得干细胞诱导分化成功,移植时机的把握是直接将体外扩增后的细胞进行植,还是在体外进行预分化后再进行移植?如何才能获得最佳效果?供体细胞如何与受体组织整合,重建生理功能和联系? 干细胞移植的安全性问题及其所涉及的社会伦理问题都值得深入研究课题。而且诱导分化来源的细胞容易发生基因突变,导致肿瘤发生的危险性增加。
综上所述,传统中药丹参是中医药学宝库中的珍品,拥有广泛的生物活性和药理作用。丹参有望成为一种干细胞的有效诱导剂,并在组织工程学得到广泛应用。在采用现代科学技术方法的基础上,随着对丹参活性成分及其药理作用研究的深入,丹参必将具有更广阔的临床应用前景。但是,目前丹参有效成分间的相互配伍关系、有效成分的作用靶点及作用的分子机制还不明确,有待进一步的研究。
[参考文献]
[1] Shu-Lan Yuan,Yu-Quan Wei. Growth inhibition and apoptosis induction of tanshinone II-A on human hepatocellular carcinoma cells[J]. World J Gastroenterol,2004,10(14):2024-2028.
[2] Han Bok Kwak,Yang D,Ha H,et al. Tanshinone IIA inhibits osteoclast differentiation through down-regulation of c-Fos and NFATc1[J]. Experimental and Molecular medicine,June 2006,38(3):256-264.
[3] Hong Wang, Xiumei Gao and Boli Zhang. Tanshinone: An inhibitor of proliferation of vascular smooth muscle cells[J]. Journal of Ethnopharmacology,2005,99:93-98.
[4] Chan,K Chui,SH Wong. Protective effects of Danshensu from the aqueous extract of Salviamiltiorrhiza(Danshen)againsthomocysteine- induced endothelial dysfunction[J]. Life Sciences,2004,75:3157- 3171.
[5] Yun-Lian Lin,Chia-Hung Wu,Miao-Hua Luo,et al. In vitro protective effects of salvianolic acid B on primary hepatocytes and hepatic stellate cells[J]. Journal of Ethnopharmacology,2006,105:215-222.
[6] 王勇,陆长青,王凡. 丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化[J]. 解剖学杂志,2007,30(2):207-210.
[7] 李禄全,余加林,刘官信,等. 复方丹参注射液诱导鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的研究[J]. 中华儿科学杂志, 2005,40(1):53 -54.
[8] MA Lian,FENG Xue-yong,CUI Bing-lin,et al. Human umbilical cord Wharton’s Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells(salvia miltiorrhiza)[J]. Chinese Medical Journal,2005,118(23):1987-1993.
[9] 陆长青,王勇,陈登榜,等. 丹参诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化及相关基因的表达[J]. 四川解剖学杂志,2006,4(1):1-4.
[10] 于艳秋,李昆,卢晓梅,等. 丹参诱导pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用[J]. 中国医科大学学报,2007,36(2):150-152.
[11] 范英昌,华声瑜,姚雅娟. 丹酚酸B诱导体外培养大鼠骨髓基质细胞向心肌样细胞分化的研究[J]. 天津中医学院学报,2005,24(1): 10-12.
(收稿日期:2009-03-16)
[关键词] 丹参;骨髓间质干细胞(MSC);ES;神经样细胞;心肌细胞;诱导分化
[中图分类号] R329.1 [中图分类号] A[文章编号] 1673-9701(2009)24-49-02
Stem Cell Differentiation and Mechanism Induced by Danshen: Research Progress
LUO XiaoxiuZHOU Long
7-Year Program of Clinical Medicine,China Medical University,Shenyang 110001,China
[Abstract] In recent years,regenerative medicine has been developed rapidly,particularly in stem cell induced differentiation field. The nerve-like cells,myocardial cells,osteoblast-like cells and cartilage cells and so on cultured by differentiation of stem cells provide a new program for clinical treatment. With the development of combined traditional Chinese and western medicine in the treatment of diseases,more scholars focus on researches of the induced differentiation of Chinese medicine. This paper aims to explore the induced differentiation of adult stem cells and embryonic stem cells by traditional Chinese medicine Danshen and its major components in recent years,and at the same time,point out current research problems,providing new ideas for the clinical application of Danshen and a theoretical basis for tissue engineering.
[Key Words] Danshen;Bone marrow mesenchymal stem cell;Embryonic stem cell;Neuron-like cells;Myocardial cell;Induced differentiation
1丹参的主要成分和药理作用
丹参为唇形科植物,味苦,性微寒,具有活血祛瘀、养血安神、调经止痛、凉血消痈的功效。现就其有效成分、药理作用介绍如下:丹参的有效成分主要分为脂溶性和水溶性两大类。丹参中脂溶性成分主要为丹参酮型的二萜类化合物,主要包括丹参酮Ⅰ、ⅡA、ⅡB、隐丹参酮等。它具有改善微循环、抗炎、抗凝、抗氧化等作用,其中以丹参酮ⅡA含量最高、活性最强;丹参酮具有较强的抗菌作用。研究表明,丹参酮还具有诱导肿瘤细胞凋亡[1]、抑制成骨细胞分化[2]、抑制血管平滑肌细胞增生[3]等作用。
丹参的水溶性成分主要为酚性酸类化合物,包括丹参素、原儿茶醛、丹酚酸A/B等,具有改善微循环、抗血栓、促进组织恢复等多种活性。总酚酸类成分具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基等作用,其中含量最高的两个成分丹酚酸A和B活性最强,对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保护作用[4]。研究表明,丹酚酸B还具有肝细胞保护作用[5],促进体外血管生成等作用。
2丹参对干细胞的诱导分化及其机制
诸多研究发现,丹参或其单体成分如丹参酮、丹参素、丹酚酸等均有对干细胞的诱导分化作用,有诱导成神经样细胞、心肌细胞、成骨样细胞、软骨样细胞等,尤其是向神经样细胞、心肌细胞分化做了大方面的研究,取得了很大的进展,为疑难杂病的治疗提供了新的方向。如下将主要从这两方面来综述。
2.1向神经样细胞的诱导分化及其机制
王勇等[6]用丹参体外诱导大鼠的MSCs发现,丹参诱导90min后,细胞发生了明显的形态学变化,大多数细胞转变为类似双极或多极神经元样形态,伸出轴突或树突样突起,并且表达神经干细胞的表面标志Nestin和成熟神经元的表面标志NSE,不表达神经胶质细胞表面标志GFAP,RT-PCR检测ngn-1、mash-1的表达也为阳性,说明丹参注射液有诱导BMSCs分化为神经元样细胞的能力,而且他们大胆地提出了丹参诱导MSCs向神经元样的分化可能与ngn-1,mash-1有关。而李禄全等[7]不仅发现丹参有诱导MSCs向神经样细胞的能力,并且提出不同剂量的诱导分化效率不同。笔者认为(100～200)g/L为最佳的体外诱导浓度。
人脐带来源的细胞有MSCs的性质,且来源丰富,为成功诱导脐带来源的细胞为中枢神经系统细胞的移植提供了丰富的资源。MA Lian等[8]从足月婴儿身上提取人脐带血细胞,并用丹参和β-巯基乙醇成功地诱导人脐带来源的间充质干细胞分化为神经元样细胞。经过丹参诱导后,其细胞形态显著改变,同时神经相关基因表达阳性。
众多的实验都证实了丹参的强诱导分化能力,而关于诱导干细胞分化成神经系统细胞的机制目前并不清楚,有许多推测:①从基因水平上来说,许多学者认为发育相关基因如bHLH家族中ngn-1,mash-1基因的表达,与细胞分化成熟过程密切相关,尤其与神经元的分化成熟密切相关。因为mash-1与神经元的分化成熟密切相关,nng-1在促进神经干细胞向神经元分化的同时抑制干细胞向胶质细胞分化。这可能是丹参大的诱导分化机制之一,但需要进一步的实验证实。②从发育生物学角度来说[9],MSCs来源于中胚层,而神经元来源于外胚层,一般认为MSCs在抗氧化剂(如2-巯基乙醇、叔丁基对甲氧酚)存在的条件下可向神经细胞分化。丹参注射液是一种抗氧化剂,含有丹参酮、总丹酚酸等多种抗氧化成分,常用于治疗缺血性脑血管病,其机制可能与总丹酚酸降低神经细胞缺氧损伤时的细胞死亡率,减少脂质过氧化物生成有关。据此还可推测丹参注射液诱导MSCs向神经元样细胞分化的机制也可能与其具有抗氧化作用有关。
2.2向心肌细胞的诱导分化
虽然丹参在心脑血管疾病方面有不可比拟的疗效,但研究丹参诱导干细胞向心肌细胞分化的报道还不是很多。然而这却为不可逆性的心肌损伤的治疗提供了新的希望。毫无疑问,研究中药如何诱导干细胞向心肌细胞分化将成为现代医学的一个新的切入点。
于艳秋等[10]利用转基因技术将pαMHC-EGFP质粒转染到小鼠D3系胚胎干细胞,构建了pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞株,当其向心肌细胞分化时,即MHC转录的同时就有EGFP的合成。因而心肌细胞具有绿色荧光蛋白的标记。利用丹参诱导pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化,并观察其诱导效果,结果显示,RT-PCR检测出αMHC、Anf、MLC2v基因在分化的心肌细胞中表达。丹参可明显提高第10、11、12天的心肌细胞分化率(P<0.01),以50mg/mL丹参的作用效果最明显(P<0.05),但对心肌细胞的分化时间没有明显影响。说明丹参可以体外提高pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞的分化率。范英昌等[11]也用实验证实丹酚酸B诱导骨髓基质细胞向心肌细胞转化的潜能,可作为细胞外科一种良好的移植细胞来源。诸多实验证实了丹参诱导干细胞向心肌细胞分化的可能性,但其机制还不是很清楚,需要进一步的研究。
3问题和展望
干细胞移植已经为干细胞治疗学拓展出新的道路,产生了新的技术方法。相信随着对干细胞诱导分化研究的深入,干细胞移植组织再生将是治疗疾病的有效手段之一。中医药介入组织工程学领域,如心肌细胞移植将是中医药走向现代化的一个切入点,具有重要的实际意义。
但是如何进行有效的分化调控,使得干细胞诱导分化成功,移植时机的把握是直接将体外扩增后的细胞进行植,还是在体外进行预分化后再进行移植?如何才能获得最佳效果?供体细胞如何与受体组织整合,重建生理功能和联系? 干细胞移植的安全性问题及其所涉及的社会伦理问题都值得深入研究课题。而且诱导分化来源的细胞容易发生基因突变,导致肿瘤发生的危险性增加。
综上所述,传统中药丹参是中医药学宝库中的珍品,拥有广泛的生物活性和药理作用。丹参有望成为一种干细胞的有效诱导剂,并在组织工程学得到广泛应用。在采用现代科学技术方法的基础上,随着对丹参活性成分及其药理作用研究的深入,丹参必将具有更广阔的临床应用前景。但是,目前丹参有效成分间的相互配伍关系、有效成分的作用靶点及作用的分子机制还不明确,有待进一步的研究。
[参考文献]
[1] Shu-Lan Yuan,Yu-Quan Wei. Growth inhibition and apoptosis induction of tanshinone II-A on human hepatocellular carcinoma cells[J]. World J Gastroenterol,2004,10(14):2024-2028.
[2] Han Bok Kwak,Yang D,Ha H,et al. Tanshinone IIA inhibits osteoclast differentiation through down-regulation of c-Fos and NFATc1[J]. Experimental and Molecular medicine,June 2006,38(3):256-264.
[3] Hong Wang, Xiumei Gao and Boli Zhang. Tanshinone: An inhibitor of proliferation of vascular smooth muscle cells[J]. Journal of Ethnopharmacology,2005,99:93-98.
[4] Chan,K Chui,SH Wong. Protective effects of Danshensu from the aqueous extract of Salviamiltiorrhiza(Danshen)againsthomocysteine- induced endothelial dysfunction[J]. Life Sciences,2004,75:3157- 3171.
[5] Yun-Lian Lin,Chia-Hung Wu,Miao-Hua Luo,et al. In vitro protective effects of salvianolic acid B on primary hepatocytes and hepatic stellate cells[J]. Journal of Ethnopharmacology,2006,105:215-222.
[6] 王勇,陆长青,王凡. 丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化[J]. 解剖学杂志,2007,30(2):207-210.
[7] 李禄全,余加林,刘官信,等. 复方丹参注射液诱导鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的研究[J]. 中华儿科学杂志, 2005,40(1):53 -54.
[8] MA Lian,FENG Xue-yong,CUI Bing-lin,et al. Human umbilical cord Wharton’s Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells(salvia miltiorrhiza)[J]. Chinese Medical Journal,2005,118(23):1987-1993.
[9] 陆长青,王勇,陈登榜,等. 丹参诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化及相关基因的表达[J]. 四川解剖学杂志,2006,4(1):1-4.
[10] 于艳秋,李昆,卢晓梅,等. 丹参诱导pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用[J]. 中国医科大学学报,2007,36(2):150-152.
[11] 范英昌,华声瑜,姚雅娟. 丹酚酸B诱导体外培养大鼠骨髓基质细胞向心肌样细胞分化的研究[J]. 天津中医学院学报,2005,24(1): 10-12.
(收稿日期:2009-03-16)