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摘 要：该研究使用的Halobacterium salinarum是极端嗜盐菌的模型生物之一。通過对菌热处理后，添加培养滤液，进行37℃振荡培养，测量OD600值观察菌的生长情况，以确定该菌是否含有耐热因子及探讨了该菌培养滤液中所含成分对该菌生长繁殖的影响。结果，80 ℃热处理后，如果不添加培养滤液，该菌不生长;添加培养滤液时，从第十天左右开始，OD600≈0.2～0.3，并且通过显微镜的观察，确认了菌的存在。另外，将培养滤液用活性炭进行吸附，再用乙醇进行溶出后的效果也进行了研究。结果显示：将100%的乙醇溶出液分别加入热处理菌后进行培养，结果70 ℃的热处理菌有生长延迟的倾向。可以推断出：培养滤液中有可能存在某种阻碍该菌生长的成分。根据该研究，明确证实了培养滤液中既含有Halobacterium salinarum的生长促进因子，又含有阻碍因子。通过分析这些成分，期待可以将休眠机制解释清楚并对该菌以外的极端嗜盐菌的耐热性的研究提供研究基础。
关键词：极端嗜盐菌 Halobacterium salinarum 耐热因子 培养滤液
中图分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2021）01（a）-0094-03
Study on Heat Resistance Factor of Halobacterium Salinarum
ZHANG Xu CUI Shanshan
（Changchun Polytechnic， Changchun， Jilin Province， 130000 China）
Abstract： Halobacterium salinarum is a model organism of extreme halophiles. In this study， firstly， we collected the culture filtrate of the halophile culture solution which continued to shake culture at 37 ℃ after heat shock at different temperature. Then we continue to culture the heat-activated halophile by using the medium with the culture filtrate， and observed the growth by measuring the OD600 value to determine whether the halophile contains heat-resistant factors. Simultaneously exploring the effects of the components contained in the culture filtrate on the growth and reproduction of the halophile. Results： After heat treatment at 80 ℃， only when the culture filtrate was added， the halophile began to grow from about the tenth day， OD600≈0.2～0.3， and the presence of the halophile was confirmed by microscopic observation. Further， the effect of culture filtrate adsorbed by activated carbon and dissolved by ethanol was also studied. As a result， 100% ethanol solution was added to the heat-treated halophile for culture， which at 70 ℃ tend to have a delayed growth. It can be inferred that there may be some components in the culture filtrate that hinder the growth of the halophile. According to the present study， it was clearly confirmed that the culture filtrate contained both the growth promoting factor and the inhibitory factor of halophile. By analyzing these components， it is expected that the dormancy mechanism can be explained clearly and the research basis for the study of the heat resistance of other extreme halophiles is provided. Key Words： Extreme halophiles; Halobacterium salinarum; Heat resistance factor; Culture filtrate
最早記载极端嗜盐菌存在的是《本草纲目》中记载的“引清水注入，久则色赤。待夏秋南风大起，则一夜结成，谓之盐南风”[1]。这句话指：盐水被太阳照射浓缩的阶段逐渐变红，经过一夜的南风食盐的结晶析出来的意思。根据现在的知识，指含有菌红素的极端嗜盐菌繁殖，盐水变成红色的意思。1914年，Pierce首次确切地描述了卤水中的红色细菌[2]。
该研究使用的Halobacterium salinarum是极端嗜盐菌的模型生物之一。一直以来认为，极端嗜盐菌在40 ℃左右最易生长，在55 ℃以上的环境中不能生存。但是在2003年龟仓正博指出，利用海水晒盐法制盐时，在高温盐溶液中也有极端嗜盐菌的存在[3]。并且，根据日本教育大学中山匡研究室的研究表明，Halobacterium salinarum在至少70 ℃、10 min处理后虽然比没有热处理的菌的生长开始时间晚，但是能够繁殖。从这个结果可以看出，极端嗜盐菌具有耐热性。该实验通过研究Halobacterium salinarum培养滤液对不同温度处理菌的生长繁殖的影响，确定了培养滤液中含有能够使该菌从休眠状态复苏的有效成分，为进一步研究该菌的休眠机制及耐热因子的研究奠定基础。
1 实验器材
离心机、振荡培养摇床、分光光度计、超净工作台、高压灭菌锅、活性炭柱、自动分液收集器、显微镜。
2 实验试剂
实验试剂：乙醇、苯酚、浓硫酸。
复合培养基：分别制备Solution A（NaCl 200 g，KCl 2.0 g，Citrate Na 3.0 g，MgSO4·7H2O 20 g，MnCl2·4H2O（3.6 g/L），FeSO4·7H2O（0.5 g/L）1.0 mL，加入蒸馏水，定容为800 mL）与Solution B（Yeast extract，10 g，Casamino acid 7.5 g，加入蒸馏水，定容为200 mL），调整pH=7.0，121 ℃，15 min高压灭菌后混合。
Salt solution：制备Solution A（KCl 4.0 g，NaHCO3 0.2 g，NaBr 0.5 g，加入蒸馏水，定容为200 mL）、B（NaCl 250 g，加入蒸馏水，定容为700 mL）、C（NH4Cl 2.0 g，FeCl3·6H2O 0.05 g，KH2PO4 0.5 g，加入蒸馏水，定容为100 mL），Solution A、C分别调整为pH=7.0，Solution A、B 121 ℃，15 min高压灭菌。Solution C膜过滤除菌。无菌条件下将Solution A、B、C混合。
3 实验步骤
在55 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃热处理嗜盐菌Halobacterium salinarum 10 min，在液体培养基中37 ℃培养14天，吸光度OD600的测定菌体生长情况。结果见图1。将该菌第4天（对数生长期后期）的培养物进行膜过滤，收集培养滤液约40 mL。
对该菌分组进行70 ℃、80 ℃、90 ℃ 10 min热处理，在加入上述培养滤液的复合培养基继续培养14天，测定菌体生长情况。
将收集的培养滤液流过自制活性炭柱，再用20%乙醇溶出活性物质，离心浓缩，将溶出液稀释为 1.5 mg/mL，膜过滤除菌。40%、60%的乙醇溶出液制作方法相同，取该菌1 mL，加入Salt solution调节至OD600=4.0。取10支灭菌ep管，其中5支不加热为对照组，另外5支加入800 μL Salt solution，加热，达到至 80 ℃，加入本菌200 μL，80 ℃、10 min，迅速冷却。随后分别接种1～15 mL复合培养基中（内含10%不同浓度的乙醇溶出液），37 ℃振荡培养。结果见图2。
与上述操作相同，将热处理温度分别设定为70 ℃、80 ℃和90 ℃，添加100%乙醇溶出液。
4 实验结果
具体情况见图1、图2。
5 分析讨论
对Halobacterium salinarum进行80 ℃、10 min热处理后，如果不添加培养滤液，该菌不生长;添加培养滤液时，从第10天左右开始，OD600≈0.2～0.3，并且通过显微镜的观察，确认了该菌的存在。从以上事实可以看出，在培养滤液中，存在着某种打破菌的休眠状态的成分。将培养滤液用活性炭进行吸附，再分别用20%、40%、60%、100%的乙醇进行溶出后的效果也进行了研究。结果显示：将100%的乙醇溶出液分别加入到 80 ℃、90 ℃、100 ℃的热处理菌进行培养，80 ℃和 90 ℃的热处理菌没有生长;70 ℃的热处理菌有生长延迟的倾向。从此实验结果可以推断出：培养滤液中有可能存在某种阻碍本菌生长的成分。在后续实验中考虑分离提取出有效成分，并进一步分析鉴定其性质。根据本研究，再次证实了Halobacterium salinarum至少在 70 ℃、加热10 min的条件下仍可生长;并明确证实了培养滤液中既含有Halobacterium salinarum的生长促进因子，又含有阻碍因子。目前已经发现了极端嗜盐菌中耐盐基因片段和质粒[4]决定其具有嗜盐性，那么，决定其嗜热性的主要因素是什么还需要进一步研究。
根据以往的研究，Halobacterium salinarum在经过热处理之后，细胞表层的构成物质表层蛋白（S-layer）发生了变化。在此基础上，如果能够证明极端嗜盐菌的耐热性和与嗜热菌之间的关系，可以期待系统发生树的重建。该菌既具有极端嗜盐性又具有一定程度的耐热性，考虑与其是多倍体有关，因此具有更高效的DNA双链修复系统和极低的自发突变率，因此在极端环境下的适应能力超出其他生物[5]。也正是由于极端嗜盐菌生存环境的特殊性，其保存有一定的困难。今后考虑加入蔗糖、海藻糖优化其冷冻干燥条件[6]，提高实验的准确性和平行性。
参考文献
[1] 李时珍.本草纲目[M].武汉：湖北科学技术出版社，2018.
[2] Aharon Oren， Rahel Elevi， Satoshi Watanabe， et al. Halomicrobium mukohataei gen. nov.， comb.nov.， and emended description of Halomicrobium mukohataei[J]. Int J Syst Evol Microbiol，2020，52（5）：1831-1835.
[3] 龟仓正博，古贺洋介.古细菌的生物学[M].东京：东京大学出版社，1998.
[4] Pallen，Mark.Genome Sequence of an Extreme Halophile[J].Trends in Microbiol，2020，9（2）：58-59.
[5] 王殿年，段嘉伟，刘艳明，等.一种高可靠性环氧树脂组合物的制备[J].电子与封装，2020，20（10）：11-14.
[6] 刘媛媛.小麦WRKY转录因子的鉴定分析与耐热相关基因的初步研究[D].西北农林科技大学，2019.
[7] 毛建.环氧树脂耐热模型与硬质链段增韧改性的研究[D].武汉理工大学，2016.
关键词：极端嗜盐菌 Halobacterium salinarum 耐热因子 培养滤液
中图分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2021）01（a）-0094-03
Study on Heat Resistance Factor of Halobacterium Salinarum
ZHANG Xu CUI Shanshan
（Changchun Polytechnic， Changchun， Jilin Province， 130000 China）
Abstract： Halobacterium salinarum is a model organism of extreme halophiles. In this study， firstly， we collected the culture filtrate of the halophile culture solution which continued to shake culture at 37 ℃ after heat shock at different temperature. Then we continue to culture the heat-activated halophile by using the medium with the culture filtrate， and observed the growth by measuring the OD600 value to determine whether the halophile contains heat-resistant factors. Simultaneously exploring the effects of the components contained in the culture filtrate on the growth and reproduction of the halophile. Results： After heat treatment at 80 ℃， only when the culture filtrate was added， the halophile began to grow from about the tenth day， OD600≈0.2～0.3， and the presence of the halophile was confirmed by microscopic observation. Further， the effect of culture filtrate adsorbed by activated carbon and dissolved by ethanol was also studied. As a result， 100% ethanol solution was added to the heat-treated halophile for culture， which at 70 ℃ tend to have a delayed growth. It can be inferred that there may be some components in the culture filtrate that hinder the growth of the halophile. According to the present study， it was clearly confirmed that the culture filtrate contained both the growth promoting factor and the inhibitory factor of halophile. By analyzing these components， it is expected that the dormancy mechanism can be explained clearly and the research basis for the study of the heat resistance of other extreme halophiles is provided. Key Words： Extreme halophiles; Halobacterium salinarum; Heat resistance factor; Culture filtrate
最早記载极端嗜盐菌存在的是《本草纲目》中记载的“引清水注入，久则色赤。待夏秋南风大起，则一夜结成，谓之盐南风”[1]。这句话指：盐水被太阳照射浓缩的阶段逐渐变红，经过一夜的南风食盐的结晶析出来的意思。根据现在的知识，指含有菌红素的极端嗜盐菌繁殖，盐水变成红色的意思。1914年，Pierce首次确切地描述了卤水中的红色细菌[2]。
该研究使用的Halobacterium salinarum是极端嗜盐菌的模型生物之一。一直以来认为，极端嗜盐菌在40 ℃左右最易生长，在55 ℃以上的环境中不能生存。但是在2003年龟仓正博指出，利用海水晒盐法制盐时，在高温盐溶液中也有极端嗜盐菌的存在[3]。并且，根据日本教育大学中山匡研究室的研究表明，Halobacterium salinarum在至少70 ℃、10 min处理后虽然比没有热处理的菌的生长开始时间晚，但是能够繁殖。从这个结果可以看出，极端嗜盐菌具有耐热性。该实验通过研究Halobacterium salinarum培养滤液对不同温度处理菌的生长繁殖的影响，确定了培养滤液中含有能够使该菌从休眠状态复苏的有效成分，为进一步研究该菌的休眠机制及耐热因子的研究奠定基础。
1 实验器材
离心机、振荡培养摇床、分光光度计、超净工作台、高压灭菌锅、活性炭柱、自动分液收集器、显微镜。
2 实验试剂
实验试剂：乙醇、苯酚、浓硫酸。
复合培养基：分别制备Solution A（NaCl 200 g，KCl 2.0 g，Citrate Na 3.0 g，MgSO4·7H2O 20 g，MnCl2·4H2O（3.6 g/L），FeSO4·7H2O（0.5 g/L）1.0 mL，加入蒸馏水，定容为800 mL）与Solution B（Yeast extract，10 g，Casamino acid 7.5 g，加入蒸馏水，定容为200 mL），调整pH=7.0，121 ℃，15 min高压灭菌后混合。
Salt solution：制备Solution A（KCl 4.0 g，NaHCO3 0.2 g，NaBr 0.5 g，加入蒸馏水，定容为200 mL）、B（NaCl 250 g，加入蒸馏水，定容为700 mL）、C（NH4Cl 2.0 g，FeCl3·6H2O 0.05 g，KH2PO4 0.5 g，加入蒸馏水，定容为100 mL），Solution A、C分别调整为pH=7.0，Solution A、B 121 ℃，15 min高压灭菌。Solution C膜过滤除菌。无菌条件下将Solution A、B、C混合。
3 实验步骤
在55 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃热处理嗜盐菌Halobacterium salinarum 10 min，在液体培养基中37 ℃培养14天，吸光度OD600的测定菌体生长情况。结果见图1。将该菌第4天（对数生长期后期）的培养物进行膜过滤，收集培养滤液约40 mL。
对该菌分组进行70 ℃、80 ℃、90 ℃ 10 min热处理，在加入上述培养滤液的复合培养基继续培养14天，测定菌体生长情况。
将收集的培养滤液流过自制活性炭柱，再用20%乙醇溶出活性物质，离心浓缩，将溶出液稀释为 1.5 mg/mL，膜过滤除菌。40%、60%的乙醇溶出液制作方法相同，取该菌1 mL，加入Salt solution调节至OD600=4.0。取10支灭菌ep管，其中5支不加热为对照组，另外5支加入800 μL Salt solution，加热，达到至 80 ℃，加入本菌200 μL，80 ℃、10 min，迅速冷却。随后分别接种1～15 mL复合培养基中（内含10%不同浓度的乙醇溶出液），37 ℃振荡培养。结果见图2。
与上述操作相同，将热处理温度分别设定为70 ℃、80 ℃和90 ℃，添加100%乙醇溶出液。
4 实验结果
具体情况见图1、图2。
5 分析讨论
对Halobacterium salinarum进行80 ℃、10 min热处理后，如果不添加培养滤液，该菌不生长;添加培养滤液时，从第10天左右开始，OD600≈0.2～0.3，并且通过显微镜的观察，确认了该菌的存在。从以上事实可以看出，在培养滤液中，存在着某种打破菌的休眠状态的成分。将培养滤液用活性炭进行吸附，再分别用20%、40%、60%、100%的乙醇进行溶出后的效果也进行了研究。结果显示：将100%的乙醇溶出液分别加入到 80 ℃、90 ℃、100 ℃的热处理菌进行培养，80 ℃和 90 ℃的热处理菌没有生长;70 ℃的热处理菌有生长延迟的倾向。从此实验结果可以推断出：培养滤液中有可能存在某种阻碍本菌生长的成分。在后续实验中考虑分离提取出有效成分，并进一步分析鉴定其性质。根据本研究，再次证实了Halobacterium salinarum至少在 70 ℃、加热10 min的条件下仍可生长;并明确证实了培养滤液中既含有Halobacterium salinarum的生长促进因子，又含有阻碍因子。目前已经发现了极端嗜盐菌中耐盐基因片段和质粒[4]决定其具有嗜盐性，那么，决定其嗜热性的主要因素是什么还需要进一步研究。
根据以往的研究，Halobacterium salinarum在经过热处理之后，细胞表层的构成物质表层蛋白（S-layer）发生了变化。在此基础上，如果能够证明极端嗜盐菌的耐热性和与嗜热菌之间的关系，可以期待系统发生树的重建。该菌既具有极端嗜盐性又具有一定程度的耐热性，考虑与其是多倍体有关，因此具有更高效的DNA双链修复系统和极低的自发突变率，因此在极端环境下的适应能力超出其他生物[5]。也正是由于极端嗜盐菌生存环境的特殊性，其保存有一定的困难。今后考虑加入蔗糖、海藻糖优化其冷冻干燥条件[6]，提高实验的准确性和平行性。
参考文献
[1] 李时珍.本草纲目[M].武汉：湖北科学技术出版社，2018.
[2] Aharon Oren， Rahel Elevi， Satoshi Watanabe， et al. Halomicrobium mukohataei gen. nov.， comb.nov.， and emended description of Halomicrobium mukohataei[J]. Int J Syst Evol Microbiol，2020，52（5）：1831-1835.
[3] 龟仓正博，古贺洋介.古细菌的生物学[M].东京：东京大学出版社，1998.
[4] Pallen，Mark.Genome Sequence of an Extreme Halophile[J].Trends in Microbiol，2020，9（2）：58-59.
[5] 王殿年，段嘉伟，刘艳明，等.一种高可靠性环氧树脂组合物的制备[J].电子与封装，2020，20（10）：11-14.
[6] 刘媛媛.小麦WRKY转录因子的鉴定分析与耐热相关基因的初步研究[D].西北农林科技大学，2019.
[7] 毛建.环氧树脂耐热模型与硬质链段增韧改性的研究[D].武汉理工大学，2016.