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摘要 [目的]分离克隆马尾松α蒎烯合成酶基因cDNA全长。[方法]根据其他松科植物α蒎烯合成酶基因保守区域设计引物，扩增出基因的部分片段，再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列，通过序列拼接获得cDNA全长，结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性。[结果]马尾松α蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp，编码区1 980 bp，编码629个氨基酸，含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）。[结论]该方法成功克隆了马尾松α蒎烯合成酶基因cDNA全长序列，具有单萜烯合成酶基因的典型特征，序列提交至GenBank，获得登录号KF547035。
关键词 马尾松（Pinus massoniana）；蒎烯合成酶基因；RACE
中图分类号 S791.248 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03808-04
Abstract [Objective] To clone the fulllength of αpinene synthase gene from Pinus massoniana. [Method] According to high conservative amino acids of reported αpinene synthase gene from pinaceaes， a pair of degenerate primers was designed and partial fragment was obtained by PCR amplification. Based on this known sequence， some new primers were designed， two terminals gene sequence were cloned by 3’ RACE and 5’ RACE respectively. After splicing the fragments of sequence， analyzed the structures and function of the coded protein by bioinformatics softwares. [Result] The fulllength cDNA of αpinene synthase gene consists of 2 103 bp， contains a 1 890 bp open reading frame（ORF） encoding 629 amino acid proteins， including Nterminal transit peptide， metalbinging domain and DDXXD motif. [Conclusion] The fulllength cDNA of αpinene synthase gene was cloned， which has the typical characteristics of monoterpene synthase gene. The sequence has been submitted to GeneBank， accessin No. KF547035.
Key words Pinus massoniana； Pinene Synthase Gene； RACE
马尾松（Pinus massoniana）是我国特有的一种综合利用价值较高的经济树种，分布广泛，种植面积居全国针叶林首位，然而马尾松也是发生病虫害较多的树种，如松材线虫、马尾松毛虫、松梢螟及赤枯病等[1]。近20～30年来，以松材线虫病最为严重，该病致死速度快、传播蔓延迅速，导致马尾松大面积死亡，森林生态遭到严重破坏，同时也带来巨大的经济损失。
萜烯类化合物是针叶树主要的代谢产物，在受到外来植食性昆虫及致病菌的危害后，分泌并释放挥发性的单萜烯是其最重要的防御措施之一[2-3]。马尾松合成并挥发的单萜烯类物质主要由蒎烯组成，其中α蒎烯占较大比例，而β蒎烯相对较少[4-5]。当马尾松受到松材线虫[6]、松墨天牛[7]、马尾松毛虫[8]的危害，以及机械损伤[9]时，α蒎烯含量表现出明显的上升趋势。由此可见，α蒎烯是马尾松在次生代谢水平上的重要的防御物质。在分子水平上，α蒎烯受α蒎烯合成酶（αPinene Synthase，apin）基因调控。如北美云杉（Sitka Spruce）在受到象鼻虫取食后，α蒎烯合成酶基因在转录水平上明显升高，木质部树脂道中α蒎烯的含量也明显增加[10]。已有大量的研究表明[11-13]，蒎烯合成酶基因是松科植物重要的与防御相关的单萜烯合成酶基因。马尾松蒎烯合成酶基因尚未被克隆，马尾松与病虫害互作过程中防御基因表达模式研究也为空白。笔者利用同源克隆结合RACE的方法克隆马尾松α蒎烯合成酶基因cDNA全长，并分析该基因的特性，以期为马尾松响应病虫害的分子防御机制研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 供试材料为3年生马尾松，购买于浙江省淳安县国有林场，在现代化温室中培养。
1.2 方法
1.2.1 马尾松总RNA提取及cDNA第1链合成。切取健康马尾松的韧皮部组织，放入液氮中研磨。使用RNAplant Plus植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN）提取马尾松总RNA，按说明书步骤进行。提取的总RNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证其完整性，应保证RNA 3’端和5’端无降解。以马尾松总RNA为模板，在MMLV酶的催化下，加入Oligo（dT）引物进行逆转录，获得cDNA第1链。
1.2.2 引物序列。根据其他松科植物α蒎烯合成酶基因保守区域设计一对引物MidF和MidR，利用该引物对马尾松cDNA模板进行PCR扩增，扩增出α蒎烯合成酶基因的部分片段，经测序正确后，再根据这段已知序列设计3’ RACE和5’ RACE所需引物，所有引物序列见表1。 1.2.3 3’ RACE。以马尾松总RNA为模板，在MMLV酶的催化下，加入接头引物3GSP进行逆转录，获得cDNA第1链。用引物3F和3R1对逆转录产物进行第1轮 PCR扩增，由于基因自身丰度较低，电泳检测并未出现条带，因此用引物3F和内部引物3R2进行第2轮 PCR扩增。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带克隆至pMD18T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞，菌液培养后涂布于含有抗生素的LB固体培养基中，挑取单菌落扩大培养，而后提取质粒，将含有插入片段的转化子送交测序。
3 结论与讨论
萜烯类合成酶（terpene synthase，TPS）是萜烯类物质合成过程中的关键酶，按形成产物的不同，可分为单萜烯合成酶、倍半萜烯合成酶和二萜烯合成酶等，它们都是以异戊烯基二磷酸（IPP）为前体底物合成相应的单萜、倍半萜和二萜[14-16]。目前，在针叶树中已报道了70多种TPS，主要集中在松科（Pinaceae），其中以大冷杉（Abies grandis）居多，挪威云杉（Picea abies）次之，而松属（Pinus）较少。
蒎烯合成酶是松科植物重要的与防御相关的单萜烯合成酶[15-17]。试验通过RACE的方法克隆得到马尾松α蒎烯合成酶基因，该基因cDNA全长序列共1 890 bp，编码629个氨基酸。编码蛋白的预测分子量为71.94 kD。裸子植物萜烯类合成酶的催化反应都需要一价的金属阳离子（如K+）激活；并且需要2价金属阳离子协助，如Mn2+，Fe2+，Mg2+等[15，17-18]。此外，几乎所有的萜烯类合成酶都含有1个天冬氨酸富集基序（DDxxD），这个基序被认为起到结合金属离子的作用，其定位在活性位点的入口处，在引导底物催化时发挥重要的作用[19]。马尾松α蒎烯合成酶基因编码蛋白在305～573位有1个金属结合结构域，在380～384位有1个天冬氨酸富集基序（DDMYD），这些都符合萜烯合成酶基因的典型特征。遗传分析表明，松科植物α蒎烯合成酶基因亲缘关系较近，马尾松（Pinus massoniana）与 火炬松（Pinus teada）、油松（Pinus tabuliformis）等种间相比，基因同源性达到97%。α蒎烯是马尾松重要的防御物质，树体内α蒎烯的含量变化与病虫害等生物胁迫存在显著的相关性，因此α蒎烯合成酶基因的克隆，有助于从分子水平上揭示马尾松的防御机制，为进一步研究马尾松与有害生物之间的互作打下基础。
参考文献
[1] 汪秀枫.马尾松常见病虫害防治简介[J].安徽林业，2010（3）：67.
[2] ZULAK K G，BOHLMANN J.Terpenoid biosynthesis and specialized vascular cells of conifer defense [J].Integrative Plant Biology，2010，52（1）：86-97.
[3] EFRAIM L，THOMAS J S，MARK G，et al.Simultaneous analysis of monoterpenes and diterpenoids of conifer oleoresin [J].Phytochemical Analysis，2007，4（5）：220-225.
[4] 赵成华，伍德明，阎云花，等.马尾松针叶中挥发性成分的鉴定及其对马尾松毛虫的触角电位反应[J].林业科学，1995，31（2）：125-131.
[5] 宁眺，樊建庭，方宇凌，等.不同危害状态下寄主萜烯挥发物含量的变化及松墨天牛对其组分的触角电位反应[J].昆虫学报，2006，49（2）：179-188.
[6] 赵振东，胡樨萼，李冬梅，等.抗松材线虫病马尾松种源化学成分与抗性机理研究（第Ⅲ报）—接种松材线虫引起抗性马尾松种源中性萜类含量变化关系的研究[J].林产化学与工业，2001，21（3）：52-58.
[7] NIU H T，ZHAO L L，LU M，et al.The Ratio and Concentration of Two Monoterpenes Mediate Fecundity of the Pinewood Nematode and Growth of Its Associated Fungi [J].PLoS ONE，2012，7（2）：1-7.
[8] 任琴，李镇宇，胡永建，等.受害马尾松、湿地松挥发性化学物质的释放[J].生态学报，2005，25（11）：2928-2932.
[9] KEELING C I，BOHLMANN J.Genes，enzymes and chemicals of terpenoid diversity in the constitutive and induced defence of conifers against insects and pathogens [J].New Phytologist，2006，170（4）：657-675.
[10] MCKAY S A B，HUNTER W L，GODARD K A，et al.Insect Attack and Wounding Induce Traumatic Resin Duct Development and Gene Expression of（）Pinene Synthase in Sitka Spruce [J].Plant Physiology，2003，133（1）：368-378.
[11] GIJZEN M，LEWINSOHN E，CROTEAU R.Characterization of the constitutive and woundinducible monoterpene cyclases of grand fir（Abies grandis）[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1991，289（1）：267-273. [12] LEWINSOHN E，GIJZEN M，CROTEAU R.Woundinducible pinene cyclase from grand fir：purification，characterization and renaturation after SDSPAGE [J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1992，293（1）：167-173.
[13] GERON C，RASMUSSEN R，ARNTS R R，et al.A review and synthesis of monoterpene speciation from forests in the United States [J].Atmospheric Environment，2000，34（11）：1761-1781.
[14] TRAPP S C，CROTEAU R B.Genomic organization of plant terpene synthases and molecular evolutionary implications [J].Genetics Society of America，2001，158（2）：811-832.
[15] LIANG P H，KO T P，WANG A H J.Structure，mechanism and function of prenyl transferases [J].European Journal of Biochemistry，2002，269（14）：3339-3354.
[16] THOLL D.Terpene synthases and the regulation，diversity and biological roles of terpene metabolism [J].Current Opinion in Plant Biology，2006，9（3）：297-304.
[17] DEGENHARDT J，KOLLNER T G，GERSHENZON J.Monoterpene and sesquiterpene synthases and the origin of terpene skeletal diversity in plants [J].Phytochemistry，2009，70（15/16）：1621-1637.
[18] BOHLMANN J，MEYERGAUEN G，CROTEAU R.Plant terpenoid synthases：Molecular biology and phylogenetic analysis [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（8）：4126-4133.
[19] SACCHETTINI J C，POULER C D.BiochemistryCreating isoprenoid diversity [J].Science，1997，277（5333）：1788-1789.
关键词 马尾松（Pinus massoniana）；蒎烯合成酶基因；RACE
中图分类号 S791.248 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03808-04
Abstract [Objective] To clone the fulllength of αpinene synthase gene from Pinus massoniana. [Method] According to high conservative amino acids of reported αpinene synthase gene from pinaceaes， a pair of degenerate primers was designed and partial fragment was obtained by PCR amplification. Based on this known sequence， some new primers were designed， two terminals gene sequence were cloned by 3’ RACE and 5’ RACE respectively. After splicing the fragments of sequence， analyzed the structures and function of the coded protein by bioinformatics softwares. [Result] The fulllength cDNA of αpinene synthase gene consists of 2 103 bp， contains a 1 890 bp open reading frame（ORF） encoding 629 amino acid proteins， including Nterminal transit peptide， metalbinging domain and DDXXD motif. [Conclusion] The fulllength cDNA of αpinene synthase gene was cloned， which has the typical characteristics of monoterpene synthase gene. The sequence has been submitted to GeneBank， accessin No. KF547035.
Key words Pinus massoniana； Pinene Synthase Gene； RACE
马尾松（Pinus massoniana）是我国特有的一种综合利用价值较高的经济树种，分布广泛，种植面积居全国针叶林首位，然而马尾松也是发生病虫害较多的树种，如松材线虫、马尾松毛虫、松梢螟及赤枯病等[1]。近20～30年来，以松材线虫病最为严重，该病致死速度快、传播蔓延迅速，导致马尾松大面积死亡，森林生态遭到严重破坏，同时也带来巨大的经济损失。
萜烯类化合物是针叶树主要的代谢产物，在受到外来植食性昆虫及致病菌的危害后，分泌并释放挥发性的单萜烯是其最重要的防御措施之一[2-3]。马尾松合成并挥发的单萜烯类物质主要由蒎烯组成，其中α蒎烯占较大比例，而β蒎烯相对较少[4-5]。当马尾松受到松材线虫[6]、松墨天牛[7]、马尾松毛虫[8]的危害，以及机械损伤[9]时，α蒎烯含量表现出明显的上升趋势。由此可见，α蒎烯是马尾松在次生代谢水平上的重要的防御物质。在分子水平上，α蒎烯受α蒎烯合成酶（αPinene Synthase，apin）基因调控。如北美云杉（Sitka Spruce）在受到象鼻虫取食后，α蒎烯合成酶基因在转录水平上明显升高，木质部树脂道中α蒎烯的含量也明显增加[10]。已有大量的研究表明[11-13]，蒎烯合成酶基因是松科植物重要的与防御相关的单萜烯合成酶基因。马尾松蒎烯合成酶基因尚未被克隆，马尾松与病虫害互作过程中防御基因表达模式研究也为空白。笔者利用同源克隆结合RACE的方法克隆马尾松α蒎烯合成酶基因cDNA全长，并分析该基因的特性，以期为马尾松响应病虫害的分子防御机制研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 供试材料为3年生马尾松，购买于浙江省淳安县国有林场，在现代化温室中培养。
1.2 方法
1.2.1 马尾松总RNA提取及cDNA第1链合成。切取健康马尾松的韧皮部组织，放入液氮中研磨。使用RNAplant Plus植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN）提取马尾松总RNA，按说明书步骤进行。提取的总RNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证其完整性，应保证RNA 3’端和5’端无降解。以马尾松总RNA为模板，在MMLV酶的催化下，加入Oligo（dT）引物进行逆转录，获得cDNA第1链。
1.2.2 引物序列。根据其他松科植物α蒎烯合成酶基因保守区域设计一对引物MidF和MidR，利用该引物对马尾松cDNA模板进行PCR扩增，扩增出α蒎烯合成酶基因的部分片段，经测序正确后，再根据这段已知序列设计3’ RACE和5’ RACE所需引物，所有引物序列见表1。 1.2.3 3’ RACE。以马尾松总RNA为模板，在MMLV酶的催化下，加入接头引物3GSP进行逆转录，获得cDNA第1链。用引物3F和3R1对逆转录产物进行第1轮 PCR扩增，由于基因自身丰度较低，电泳检测并未出现条带，因此用引物3F和内部引物3R2进行第2轮 PCR扩增。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带克隆至pMD18T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞，菌液培养后涂布于含有抗生素的LB固体培养基中，挑取单菌落扩大培养，而后提取质粒，将含有插入片段的转化子送交测序。
3 结论与讨论
萜烯类合成酶（terpene synthase，TPS）是萜烯类物质合成过程中的关键酶，按形成产物的不同，可分为单萜烯合成酶、倍半萜烯合成酶和二萜烯合成酶等，它们都是以异戊烯基二磷酸（IPP）为前体底物合成相应的单萜、倍半萜和二萜[14-16]。目前，在针叶树中已报道了70多种TPS，主要集中在松科（Pinaceae），其中以大冷杉（Abies grandis）居多，挪威云杉（Picea abies）次之，而松属（Pinus）较少。
蒎烯合成酶是松科植物重要的与防御相关的单萜烯合成酶[15-17]。试验通过RACE的方法克隆得到马尾松α蒎烯合成酶基因，该基因cDNA全长序列共1 890 bp，编码629个氨基酸。编码蛋白的预测分子量为71.94 kD。裸子植物萜烯类合成酶的催化反应都需要一价的金属阳离子（如K+）激活；并且需要2价金属阳离子协助，如Mn2+，Fe2+，Mg2+等[15，17-18]。此外，几乎所有的萜烯类合成酶都含有1个天冬氨酸富集基序（DDxxD），这个基序被认为起到结合金属离子的作用，其定位在活性位点的入口处，在引导底物催化时发挥重要的作用[19]。马尾松α蒎烯合成酶基因编码蛋白在305～573位有1个金属结合结构域，在380～384位有1个天冬氨酸富集基序（DDMYD），这些都符合萜烯合成酶基因的典型特征。遗传分析表明，松科植物α蒎烯合成酶基因亲缘关系较近，马尾松（Pinus massoniana）与 火炬松（Pinus teada）、油松（Pinus tabuliformis）等种间相比，基因同源性达到97%。α蒎烯是马尾松重要的防御物质，树体内α蒎烯的含量变化与病虫害等生物胁迫存在显著的相关性，因此α蒎烯合成酶基因的克隆，有助于从分子水平上揭示马尾松的防御机制，为进一步研究马尾松与有害生物之间的互作打下基础。
参考文献
[1] 汪秀枫.马尾松常见病虫害防治简介[J].安徽林业，2010（3）：67.
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[4] 赵成华，伍德明，阎云花，等.马尾松针叶中挥发性成分的鉴定及其对马尾松毛虫的触角电位反应[J].林业科学，1995，31（2）：125-131.
[5] 宁眺，樊建庭，方宇凌，等.不同危害状态下寄主萜烯挥发物含量的变化及松墨天牛对其组分的触角电位反应[J].昆虫学报，2006，49（2）：179-188.
[6] 赵振东，胡樨萼，李冬梅，等.抗松材线虫病马尾松种源化学成分与抗性机理研究（第Ⅲ报）—接种松材线虫引起抗性马尾松种源中性萜类含量变化关系的研究[J].林产化学与工业，2001，21（3）：52-58.
[7] NIU H T，ZHAO L L，LU M，et al.The Ratio and Concentration of Two Monoterpenes Mediate Fecundity of the Pinewood Nematode and Growth of Its Associated Fungi [J].PLoS ONE，2012，7（2）：1-7.
[8] 任琴，李镇宇，胡永建，等.受害马尾松、湿地松挥发性化学物质的释放[J].生态学报，2005，25（11）：2928-2932.
[9] KEELING C I，BOHLMANN J.Genes，enzymes and chemicals of terpenoid diversity in the constitutive and induced defence of conifers against insects and pathogens [J].New Phytologist，2006，170（4）：657-675.
[10] MCKAY S A B，HUNTER W L，GODARD K A，et al.Insect Attack and Wounding Induce Traumatic Resin Duct Development and Gene Expression of（）Pinene Synthase in Sitka Spruce [J].Plant Physiology，2003，133（1）：368-378.
[11] GIJZEN M，LEWINSOHN E，CROTEAU R.Characterization of the constitutive and woundinducible monoterpene cyclases of grand fir（Abies grandis）[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1991，289（1）：267-273. [12] LEWINSOHN E，GIJZEN M，CROTEAU R.Woundinducible pinene cyclase from grand fir：purification，characterization and renaturation after SDSPAGE [J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1992，293（1）：167-173.
[13] GERON C，RASMUSSEN R，ARNTS R R，et al.A review and synthesis of monoterpene speciation from forests in the United States [J].Atmospheric Environment，2000，34（11）：1761-1781.
[14] TRAPP S C，CROTEAU R B.Genomic organization of plant terpene synthases and molecular evolutionary implications [J].Genetics Society of America，2001，158（2）：811-832.
[15] LIANG P H，KO T P，WANG A H J.Structure，mechanism and function of prenyl transferases [J].European Journal of Biochemistry，2002，269（14）：3339-3354.
[16] THOLL D.Terpene synthases and the regulation，diversity and biological roles of terpene metabolism [J].Current Opinion in Plant Biology，2006，9（3）：297-304.
[17] DEGENHARDT J，KOLLNER T G，GERSHENZON J.Monoterpene and sesquiterpene synthases and the origin of terpene skeletal diversity in plants [J].Phytochemistry，2009，70（15/16）：1621-1637.
[18] BOHLMANN J，MEYERGAUEN G，CROTEAU R.Plant terpenoid synthases：Molecular biology and phylogenetic analysis [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（8）：4126-4133.
[19] SACCHETTINI J C，POULER C D.BiochemistryCreating isoprenoid diversity [J].Science，1997，277（5333）：1788-1789.