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摘要 [目的] 研究影响胚乳愈伤组织诱导的因素，为三倍体植株再生奠定基础。 [方法]以黑果腺肋花楸种子成熟胚乳为试材，研究取材时期、培养基种类、激素种类等因素对愈伤组织诱导的影响。[结果]取转色期的胚乳在MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 2.0 mg/L+蔗糖40 g/L+琼脂8 g/L的培养基上愈伤组织长势最好，诱导率最高可达92%，颜色为黄绿色且结构致密。[结论] 适宜黑果腺肋花楸胚乳愈伤组织诱导的培养方法为转色期取材，光照强度为800 lx，培养基配方为 MS+TDZ 0.05 mg/L+ IBA 2.0 mg/L+蔗糖 40 g/L+琼脂 8 g/L。
关键词 黑果腺肋花楸；胚乳； 愈伤组织； 激素； 糖源
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-025-04
Abstract [Objective] The aim was to study factors affecting the endosperm callus induction，in order to lay a foundation for triploid plant regeneration.[Method] The seeds of Aronia melanocarpa Elliot were used as experimental materials on this study to explore the influences of sampling time，different medium and hormone’s concentrations on endosperm callus induction.[Result]The experiments showed that endosperm inoculated on MS medium supplemented with 0.05 mg/L TDZ，2.0 mg/L IBA gave highest callus induction rate 92% .The callus was yellow green with a compact structure.[Conclusion]The suitable medium for the induction of endosperm callus of Aronia melanocarpa Elliot was MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 2.0 mg/L+40 g/L+sucrose AGAR 8 g/L with light intensity of 800 lx in turning green period .
Key words Aronia melanocarpa Endosperm； Callus； Hormone； Sugar source
黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa Elliot）隶属于蔷薇科腺肋花楸属，是多年生落叶花灌木[1]。原产于美国东北部，欧洲已有 100 年的引种栽培历史，20世纪 90 年代初引入我国[2]。其果实富含多种营养物质如花色苷、黄酮类化合物、多酚类物质，对心脏病、高血压等心脑血管疾病及糖尿病均具特殊疗效[3-5]。该树种具有广阔的开发前景，国内关于黑果腺肋花楸栽培管理、组培快繁、果实果酒降酸及发酵等研究已经日渐完善，均为其大范围推广种植和加工生产作出贡献[6-9]。但关于黑果腺肋花楸的多倍化研究尚未见报道，而胚乳是天然三倍体，若能从胚乳培养获得三倍体再生植株，便有可能选育出优良的无核黑果腺肋花楸大果新品种，为果汁生产减少程序、节约成本，且三倍体果实中各类有效物质含量可能更高、果实更大、植株抗逆性更强[10]。笔者研究影响胚乳愈伤组织诱导的因素，为三倍体植株再生奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
将黑果腺肋花楸成熟种子用流水冲洗 30 min，放入 75% 乙醇中浸泡 40 s，用无菌水冲洗 3 次，再用 10% 的次氯酸钠溶液浸泡消毒 5 min，用无菌水冲洗 4次[7]。在无菌条件下剥去外皮（切除胚芽），接种于 MS+BA 0.1 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 8 g/L（pH均为5.8）的培养基上，培养 20 d 后作为试验材料。
1.2 试验方法
1.2.1 取材时期对愈伤组织诱导的影响。分别取青果期、转色期和黑果期的种子胚乳依次接种在添加 BA 0.1 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖 50 g/L+琼脂 8 g/L的 MS 培养基中，每个培养皿（ Φ × h = 9 cm× 1.5 cm）中倒入培养基 40 ml，无菌条件下冷凝后接入愈伤组织4个。在温度（20±2）℃、相对湿度70%条件下进行暗培养，30 d后观察愈伤组织长势、颜色及结构，并调查各时期的诱导率。每个处理重复 3 次。
诱导率 = 产生愈伤组织的块数/总接种量×100%
1.2.2 培养基种类对胚乳愈伤组织诱导的影响。将最佳取材时期的愈伤组织分别接种在添加 BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L +蔗糖 50 g/L+琼脂 8 g/L的 MS、WPM、White、B5 培养基中进行培养，筛选最佳培养基。其他试验方法、步骤、测定项目同“1.2.1”。
1.2.3 光照强度对愈伤组织诱导的影响。将愈伤组织接种在 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖 40 g/L+琼脂 8.0 g/L 的培养基上，接种后分别放置在光照强度为0、800、1 600、2 400、3 200 lx 条件下进行培养，其他试验方法、步骤、测定项目同“1.2.1”。 1.2.4 植物生长调节剂种类及浓度对胚乳愈伤组织诱导的影响。将愈伤组织接种在 MS +蔗糖 40 g/L +琼脂 8 g/L 的培养基中，激素添加情况见表 1。其他试验方法、步骤、测定项目同“1.2.1”。
1.2.5 TDZ浓度对愈伤组织诱导的影响。在培养基（ MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖 40 g/L+琼脂 8.0 g/L）中添加浓度分别为 0、0.025、0.050、0.075、0.10 mg/L 的TDZ，接入愈伤组织，其他试验方法、步骤、测定项目同“1.2.1”。
1.2.6 IBA浓度对愈伤组织诱导的影响。在培养基（MS+TDZ 0.05 mg/L+蔗糖 40 g/L+琼脂 8.0 g/L）中添加浓度分别为 0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L 的IBA，接入愈伤组织，其他试验方法、步骤、测定项目同“1.2.1”。
1.3 数据分析 试验数据采用 SPSS 11.5 和 Excell 软件分析，显著水平 P<0.05。
2 结果与分析
2.1 取材时期对黑果腺肋花楸胚乳愈伤组织诱导的影响 由表2可知，当取材时期为转色期时，胚乳愈伤组织诱导率为 68%，鲜重为 0.444 0 g，均显著高于其他处理，且愈伤组织颜色为乳白色（图1），结构致密；而取材时期为青果期和黑果期时愈伤组织诱导频率较低且组织结构松散；因此选取转色期为最佳取材时期。
2.2 培养基种类对胚乳愈伤组织诱导的影响
由表3可知，
当接种在 MS 培养基上时，胚乳愈伤组织诱导率为 81%，鲜重为 0.678 0 g，均显著高于其他处理（除与WPM鲜重差异不显著外），愈伤组织颜色为乳白色，结构致密； B5和White 中愈伤组织褐变现象明显； WPM 中愈伤组织结构较为松散，不利于进一步培养（图2）；因此选取 MS 作为最佳培养基。
2.3 光照强度对胚乳愈伤组织诱导的影响 由表4可知，
光照强度在 0～3 200 lx时，愈伤组织鲜重呈先增后减的趋势，当光照强度为 800 lx时，愈伤组织鲜重为 0.842 9 g，诱导率为89%，均高于其他处理，愈伤组织表面有不规则突起，结构致密；随着光照强度继续增加，愈伤组织鲜重逐渐降低，颜色逐渐加深，表面均附着红色（图3）。因此选取 800 lx作为最适光照强度。
2.4 植物生长调节剂种类及浓度对胚乳愈伤组织诱导的影响
由表5可知，III、VIII、X培养基上产生的愈伤组织颜色为绿色或绿色附着白色，表面有不规则突起且组织结构致密，有利于进一步的器官分化，其中X号培养基上愈伤组织诱导率和鲜重分别为 91%和 858.3 mg，均达到最大值，优于其他处理；且在添加2，4.D 1.0 mg/L 的IV、VIII和XII号培养基上产生的愈伤组织均部分呈水浸状（图4）；即最佳植物生长调节剂组合是TDZ和IBA。
2.5 TDZ浓度对胚乳愈伤组织诱导的影响
由表6可知，
TDZ浓度在0～0.100 mg/L时，愈伤组织鲜重呈先增后减的趋势，紧致度也从松散向紧致变化，颜色逐渐加深（图5），当TDZ浓度为 0.050 mg/L时，愈伤组织鲜重为 0.876 2 g，显著高于其他处理，且愈伤组织颜色为绿色，结构致密，表面有不规则突起，无褐变，有利于增殖及进一步分化；当TDZ浓度逐渐增加至 0.100 mg/L时，愈伤组织褐变现象明显；因而，最有利于胚乳愈伤组织诱导的TDZ浓度为 0.050 mg/L。
2.6 IBA浓度对胚乳愈伤组织诱导的影响
由表7可知，当IBA浓度在 0～4.0 mg/L时，愈伤组织鲜重呈先增后减的趋势，其中当IBA浓度为 2.0 mg/L时，愈伤组织鲜重为0.892 8 g，高于其他处理，且愈伤组织颜色为淡黄色，结构致密，表面有不规则突起（图6），有利于增殖及进一步分化；当IBA浓度增加至 4.0 mg/L时，愈伤组织褐变严重，趋于死亡；因此，适宜诱导胚乳愈伤组织的IBA浓度 2.0 mg/L。
3 结论与讨论
取材时期不同，愈伤组织诱导率差异较大，可能与胚乳处于不同发育状态有关[11]。诱导胚乳愈伤组织的基本培养基尤以 MS 最为常用；不添加任何激素或单独添加细胞分裂素或生长素，即使能诱导出愈伤组织，也不能继续正常生长，必须同时添加细胞分裂素或生长素，这与前人研究结果较为一致[12]；TDZ具有细胞分裂素的活性，可以促进愈伤组织的诱导[13]；早期研究表明，暗培养有利于愈伤组织的诱导，该研究表明光照条件下更适合胚乳愈伤组织的诱导[14]。
综上所述，适宜黑果腺肋花楸胚乳愈伤组织诱导的培养方法为转色期取材，光照强度为800 lx：培养基配方为 MS+TDZ 0.050 mg/L+IBA 2.0 mg/L+蔗糖 40 g/L +琼脂 8 g/L。
参考文献
[1]孔繁轼.黑果腺助花楸的开发与栽培[J].中国花卉园艺，2006（10）：38-39.
[2] 马兴华.优良的经济树种——黑果腺肋花楸[J].林业科技通讯，1992（11）：31-34.
[3] VALCHEVA.KUZMANOVA S，BORISOVA P，GALUNSKA B.Hepatoprotective effect of the natural fruit juice from Aronia melanocarpa on carbon tetrachloride.induced acute liver damage in rats[J].Experimental and Toxicologic Pathology，2004，56：195-201. [4] VIANNA R，BRAULT A，MARTINEAU L C.In vivo anti.diabetic activity of the ethanolic crude extract of Sorbus decora C.K.Schneid.（Rosacea）：A medicinal plant used by Canadian James Bay Cree Nations to treat symptoms related to diabetes[J].Evidence.Based Complementary and Alternative Medicine，2011，1：10-15.
[5] 姜镇荣，韩文忠，马兴华，等.黑果腺肋花楸病虫害特点及其防治方法[J].防护林科技，2007（2）：39-40.
[6] 姜镇荣，韩文忠，马兴华.黑果腺肋花楸配方施肥试验研究[J].辽宁林业科技，2010（1）：34-35.
[7] 高晔华，郭朋伟.黑果腺肋花楸组培苗增殖的初步研究[J].北方园艺，2012（17）：119-121.
[8] 及华，张红梅，张海新.黑果腺肋花楸的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2004，40（1）：67.
[9] 王鹏.国外黑果腺肋花楸多酚类物质功能性研究进展[J].林业科技，2014，39（4）：67-70.
[10] 王晓辉.天然三倍体枇杷资源抗逆性系统评价[D].重庆：西南大学， 2013：12-87.
[11] SRIVASTAVE P S.Formation of triploid Plantlets in mature endosperm cultures of Puatrnjiva roxbugrhii[J].Z Pflnazen Physiol，1973，69：270-273.
[12] 郭丽娟，刘会超，贾文庆.黄和平月季植株再生体系建立研究[J].江苏农业科学，2010（3）：49-52.
[13] 侯佩，张淑文，杨琳.麻疯树胚乳愈伤组织诱导及其污染消除[J].应用与环境生物学报，2006，（2）：264-268.
[14] 代月.影响洋葱愈伤组织及胚性愈伤组织诱导的因素研究[J].北方园艺，2013（7）：125-127.
关键词 黑果腺肋花楸；胚乳； 愈伤组织； 激素； 糖源
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-025-04
Abstract [Objective] The aim was to study factors affecting the endosperm callus induction，in order to lay a foundation for triploid plant regeneration.[Method] The seeds of Aronia melanocarpa Elliot were used as experimental materials on this study to explore the influences of sampling time，different medium and hormone’s concentrations on endosperm callus induction.[Result]The experiments showed that endosperm inoculated on MS medium supplemented with 0.05 mg/L TDZ，2.0 mg/L IBA gave highest callus induction rate 92% .The callus was yellow green with a compact structure.[Conclusion]The suitable medium for the induction of endosperm callus of Aronia melanocarpa Elliot was MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 2.0 mg/L+40 g/L+sucrose AGAR 8 g/L with light intensity of 800 lx in turning green period .
Key words Aronia melanocarpa Endosperm； Callus； Hormone； Sugar source
黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa Elliot）隶属于蔷薇科腺肋花楸属，是多年生落叶花灌木[1]。原产于美国东北部，欧洲已有 100 年的引种栽培历史，20世纪 90 年代初引入我国[2]。其果实富含多种营养物质如花色苷、黄酮类化合物、多酚类物质，对心脏病、高血压等心脑血管疾病及糖尿病均具特殊疗效[3-5]。该树种具有广阔的开发前景，国内关于黑果腺肋花楸栽培管理、组培快繁、果实果酒降酸及发酵等研究已经日渐完善，均为其大范围推广种植和加工生产作出贡献[6-9]。但关于黑果腺肋花楸的多倍化研究尚未见报道，而胚乳是天然三倍体，若能从胚乳培养获得三倍体再生植株，便有可能选育出优良的无核黑果腺肋花楸大果新品种，为果汁生产减少程序、节约成本，且三倍体果实中各类有效物质含量可能更高、果实更大、植株抗逆性更强[10]。笔者研究影响胚乳愈伤组织诱导的因素，为三倍体植株再生奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
将黑果腺肋花楸成熟种子用流水冲洗 30 min，放入 75% 乙醇中浸泡 40 s，用无菌水冲洗 3 次，再用 10% 的次氯酸钠溶液浸泡消毒 5 min，用无菌水冲洗 4次[7]。在无菌条件下剥去外皮（切除胚芽），接种于 MS+BA 0.1 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 8 g/L（pH均为5.8）的培养基上，培养 20 d 后作为试验材料。
1.2 试验方法
1.2.1 取材时期对愈伤组织诱导的影响。分别取青果期、转色期和黑果期的种子胚乳依次接种在添加 BA 0.1 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖 50 g/L+琼脂 8 g/L的 MS 培养基中，每个培养皿（ Φ × h = 9 cm× 1.5 cm）中倒入培养基 40 ml，无菌条件下冷凝后接入愈伤组织4个。在温度（20±2）℃、相对湿度70%条件下进行暗培养，30 d后观察愈伤组织长势、颜色及结构，并调查各时期的诱导率。每个处理重复 3 次。
诱导率 = 产生愈伤组织的块数/总接种量×100%
1.2.2 培养基种类对胚乳愈伤组织诱导的影响。将最佳取材时期的愈伤组织分别接种在添加 BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L +蔗糖 50 g/L+琼脂 8 g/L的 MS、WPM、White、B5 培养基中进行培养，筛选最佳培养基。其他试验方法、步骤、测定项目同“1.2.1”。
1.2.3 光照强度对愈伤组织诱导的影响。将愈伤组织接种在 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖 40 g/L+琼脂 8.0 g/L 的培养基上，接种后分别放置在光照强度为0、800、1 600、2 400、3 200 lx 条件下进行培养，其他试验方法、步骤、测定项目同“1.2.1”。 1.2.4 植物生长调节剂种类及浓度对胚乳愈伤组织诱导的影响。将愈伤组织接种在 MS +蔗糖 40 g/L +琼脂 8 g/L 的培养基中，激素添加情况见表 1。其他试验方法、步骤、测定项目同“1.2.1”。
1.2.5 TDZ浓度对愈伤组织诱导的影响。在培养基（ MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖 40 g/L+琼脂 8.0 g/L）中添加浓度分别为 0、0.025、0.050、0.075、0.10 mg/L 的TDZ，接入愈伤组织，其他试验方法、步骤、测定项目同“1.2.1”。
1.2.6 IBA浓度对愈伤组织诱导的影响。在培养基（MS+TDZ 0.05 mg/L+蔗糖 40 g/L+琼脂 8.0 g/L）中添加浓度分别为 0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L 的IBA，接入愈伤组织，其他试验方法、步骤、测定项目同“1.2.1”。
1.3 数据分析 试验数据采用 SPSS 11.5 和 Excell 软件分析，显著水平 P<0.05。
2 结果与分析
2.1 取材时期对黑果腺肋花楸胚乳愈伤组织诱导的影响 由表2可知，当取材时期为转色期时，胚乳愈伤组织诱导率为 68%，鲜重为 0.444 0 g，均显著高于其他处理，且愈伤组织颜色为乳白色（图1），结构致密；而取材时期为青果期和黑果期时愈伤组织诱导频率较低且组织结构松散；因此选取转色期为最佳取材时期。
2.2 培养基种类对胚乳愈伤组织诱导的影响
由表3可知，
当接种在 MS 培养基上时，胚乳愈伤组织诱导率为 81%，鲜重为 0.678 0 g，均显著高于其他处理（除与WPM鲜重差异不显著外），愈伤组织颜色为乳白色，结构致密； B5和White 中愈伤组织褐变现象明显； WPM 中愈伤组织结构较为松散，不利于进一步培养（图2）；因此选取 MS 作为最佳培养基。
2.3 光照强度对胚乳愈伤组织诱导的影响 由表4可知，
光照强度在 0～3 200 lx时，愈伤组织鲜重呈先增后减的趋势，当光照强度为 800 lx时，愈伤组织鲜重为 0.842 9 g，诱导率为89%，均高于其他处理，愈伤组织表面有不规则突起，结构致密；随着光照强度继续增加，愈伤组织鲜重逐渐降低，颜色逐渐加深，表面均附着红色（图3）。因此选取 800 lx作为最适光照强度。
2.4 植物生长调节剂种类及浓度对胚乳愈伤组织诱导的影响
由表5可知，III、VIII、X培养基上产生的愈伤组织颜色为绿色或绿色附着白色，表面有不规则突起且组织结构致密，有利于进一步的器官分化，其中X号培养基上愈伤组织诱导率和鲜重分别为 91%和 858.3 mg，均达到最大值，优于其他处理；且在添加2，4.D 1.0 mg/L 的IV、VIII和XII号培养基上产生的愈伤组织均部分呈水浸状（图4）；即最佳植物生长调节剂组合是TDZ和IBA。
2.5 TDZ浓度对胚乳愈伤组织诱导的影响
由表6可知，
TDZ浓度在0～0.100 mg/L时，愈伤组织鲜重呈先增后减的趋势，紧致度也从松散向紧致变化，颜色逐渐加深（图5），当TDZ浓度为 0.050 mg/L时，愈伤组织鲜重为 0.876 2 g，显著高于其他处理，且愈伤组织颜色为绿色，结构致密，表面有不规则突起，无褐变，有利于增殖及进一步分化；当TDZ浓度逐渐增加至 0.100 mg/L时，愈伤组织褐变现象明显；因而，最有利于胚乳愈伤组织诱导的TDZ浓度为 0.050 mg/L。
2.6 IBA浓度对胚乳愈伤组织诱导的影响
由表7可知，当IBA浓度在 0～4.0 mg/L时，愈伤组织鲜重呈先增后减的趋势，其中当IBA浓度为 2.0 mg/L时，愈伤组织鲜重为0.892 8 g，高于其他处理，且愈伤组织颜色为淡黄色，结构致密，表面有不规则突起（图6），有利于增殖及进一步分化；当IBA浓度增加至 4.0 mg/L时，愈伤组织褐变严重，趋于死亡；因此，适宜诱导胚乳愈伤组织的IBA浓度 2.0 mg/L。
3 结论与讨论
取材时期不同，愈伤组织诱导率差异较大，可能与胚乳处于不同发育状态有关[11]。诱导胚乳愈伤组织的基本培养基尤以 MS 最为常用；不添加任何激素或单独添加细胞分裂素或生长素，即使能诱导出愈伤组织，也不能继续正常生长，必须同时添加细胞分裂素或生长素，这与前人研究结果较为一致[12]；TDZ具有细胞分裂素的活性，可以促进愈伤组织的诱导[13]；早期研究表明，暗培养有利于愈伤组织的诱导，该研究表明光照条件下更适合胚乳愈伤组织的诱导[14]。
综上所述，适宜黑果腺肋花楸胚乳愈伤组织诱导的培养方法为转色期取材，光照强度为800 lx：培养基配方为 MS+TDZ 0.050 mg/L+IBA 2.0 mg/L+蔗糖 40 g/L +琼脂 8 g/L。
参考文献
[1]孔繁轼.黑果腺助花楸的开发与栽培[J].中国花卉园艺，2006（10）：38-39.
[2] 马兴华.优良的经济树种——黑果腺肋花楸[J].林业科技通讯，1992（11）：31-34.
[3] VALCHEVA.KUZMANOVA S，BORISOVA P，GALUNSKA B.Hepatoprotective effect of the natural fruit juice from Aronia melanocarpa on carbon tetrachloride.induced acute liver damage in rats[J].Experimental and Toxicologic Pathology，2004，56：195-201. [4] VIANNA R，BRAULT A，MARTINEAU L C.In vivo anti.diabetic activity of the ethanolic crude extract of Sorbus decora C.K.Schneid.（Rosacea）：A medicinal plant used by Canadian James Bay Cree Nations to treat symptoms related to diabetes[J].Evidence.Based Complementary and Alternative Medicine，2011，1：10-15.
[5] 姜镇荣，韩文忠，马兴华，等.黑果腺肋花楸病虫害特点及其防治方法[J].防护林科技，2007（2）：39-40.
[6] 姜镇荣，韩文忠，马兴华.黑果腺肋花楸配方施肥试验研究[J].辽宁林业科技，2010（1）：34-35.
[7] 高晔华，郭朋伟.黑果腺肋花楸组培苗增殖的初步研究[J].北方园艺，2012（17）：119-121.
[8] 及华，张红梅，张海新.黑果腺肋花楸的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2004，40（1）：67.
[9] 王鹏.国外黑果腺肋花楸多酚类物质功能性研究进展[J].林业科技，2014，39（4）：67-70.
[10] 王晓辉.天然三倍体枇杷资源抗逆性系统评价[D].重庆：西南大学， 2013：12-87.
[11] SRIVASTAVE P S.Formation of triploid Plantlets in mature endosperm cultures of Puatrnjiva roxbugrhii[J].Z Pflnazen Physiol，1973，69：270-273.
[12] 郭丽娟，刘会超，贾文庆.黄和平月季植株再生体系建立研究[J].江苏农业科学，2010（3）：49-52.
[13] 侯佩，张淑文，杨琳.麻疯树胚乳愈伤组织诱导及其污染消除[J].应用与环境生物学报，2006，（2）：264-268.
[14] 代月.影响洋葱愈伤组织及胚性愈伤组织诱导的因素研究[J].北方园艺，2013（7）：125-127.