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摘要
[目的]以克雷伯氏菌（Klebsiella sp.） PHRC1.001為发酵对象，优化该菌产胞外多糖的培养基组分，并初步评价了该多糖的乳化性质。[方法]以多糖粗产量为考察指标，采用单因素试验和正交试验法进行了发酵培养基组分优化，并通过发酵罐培养验证了优化培养基下的粗多糖产量。[结果]Klebsiella sp. PHRC1.001产胞外多糖的最优培养基为：蔗糖 40 g/L，CaCl2 0.8 g/L，KNO3 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 9.0 g/L，NaH2PO4 3.5 g/L，起始pH 7.0，在此培养基条件下发酵罐最高粗糖产量达到21 g/L，约是初始培养基条件下的2.1倍。此外，以中链甘油三酸酯（MCT）为油相（20%），1%胞外多糖为乳化剂制备O/W乳液，通过激光粒度仪、光学显微镜和荧光显微镜表征乳液的粒径分布和颗粒形态，通过加速试验表征乳液储藏物理稳定性，结果发现，PHRC1.001多糖具有较好的乳化活性，该O/W乳液储藏物理稳定性高。[结论]Klebsiella sp. PHRC1.001为一株高产胞外多糖菌株，且该多糖具有良好的乳化活性，工业应用前景良好。
关键词胞外多糖；克雷伯氏菌；培养基优化；乳化性质
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-038-05
基金项目国家优秀青年科学基金项目（31322043）；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划（T201307）；湖北省教育厅科学研究计划项目（Q20141401）。
作者简介
崔娜娜（1988-），女，安徽蚌埠人，硕士研究生，研究方向：食品科学。*通讯作者，教授，博士，从事亲水胶体方面的研究。
收稿日期20150525
微生物胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是一类天然大分子聚合物，由一些真菌、细菌和酵母代谢产生[1]，可作为增稠剂、乳化剂、保湿剂、结构改良剂和胶凝剂等，在食品、制药、化妆品等技术领域广泛使用[2]。近年来，乳化功能的微生物多糖成为研究热点，多糖类乳化剂乳化性质稳定，不易受温度和pH的影响，可生物降解，同时能被基因工程、生物学和生物化学技术进行修饰改造，因此具有良好的应用前景[3]。
克雷伯氏菌（Kleibsiella sp.）是一种能够产胞外多糖的革兰氏阴性杆菌，在自然界中广泛分布，主要存在于动物和人的呼吸道及肠道中[4]。目前，关于克雷伯氏菌胞外多糖乳化功能研究较少。Mandal等[5]发现Klebsiella sp. PB12胞外多糖对甲苯、正十六烷、橄榄油和煤油的乳化能力分别为666%、65%、63.3%、50%。Kim等[6]研究发现Kleibsiella oxytoca BSF1胞外多糖具有较好的乳化性，在pH 3.5～10.0可有效乳化，能在10 min内形成稳定的乳液，并在30 ℃、48 h内维持体系稳定，不发生乳析。
菲利普斯亲水胶体研究中心从活性污泥中筛选分离出一株产新型胞外多糖的菌株Kleibsiella sp. PHRC1.001，多糖产量较高，乳化性好，具有较高的研究价值。笔者主要优化了菌株产多糖的培养基组分，并初步评价了该多糖乳化性质，大大提高了多糖产量，明确了多糖在乳液制备中的乳化功能，同时为深入研究PHRC1.001多糖的结构和功能奠定基础。
1材料与方法
1.1原料
1.1.1
菌种。克雷伯氏菌（Kleibsiella sp.）PHRC1.001，由菲利普斯亲水胶体研究中心从活性污泥中自主筛选得到，已保藏于中国典型培养物保藏中心（中国，武汉），保藏编号为CCTCC NO：M 2014427。
1.1.2
培养基。斜面保藏培养基：蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母膏5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖15 g/L，KCl 5 g/L，蛋白胨7 g/L，pH 7.0。
初始发酵培养基：蔗糖40 g/L，CaCl2 0.5 g/L，酵母膏2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，KH2PO4·7H2O 5 g/L，pH 7.0。
1.1.3
主要试剂。中链甘油三酸酯（MCT）为食品级，购于马来西亚KLK OLEO公司；其他试剂均为国产分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2仪器设备
PTMR 2100高速剪切乳化机，瑞士Kinematica公司；M110L高压纳米均质机，美国Microfluidics公司；Mastersizer 2000激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；TU1990型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；TGL20M台式高速冷冻离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；EL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DZF型真空干燥箱，上海博迅实业有限公司。
1.3试验方法
1.3.1
培养方法。种子培养：取菌株菌种2环接种于种子培养基中，在30 ℃、220 r/min的条件下培养12 h。
发酵培养：以0.5%（V/V）的接种量接种于发酵培养基中，在30 ℃、220 r/min条件下发酵培养72 h。
1.3.2
单因素试验。采用单因素试验方法，以氮源、碳源、磷酸盐缓冲体系、无机盐作为发酵培养基的影响因素，每一步试验都建立在前一步的基础上，考察各因素对微生物胞外多糖粗产量的影响。
1.3.3
发酵罐试验。采用优化后的发酵培养基，在7 L发酵罐内，装液量4 L，搅拌速度300 r/min，通气量4×10-3m3/min，温度30 ℃，按2.5%（V/V）接种量接种后，间隔适当时间取样，测定pH、微生物细胞干重（Dry cell weight，DCW）、微生物多糖粗产量和溶解氧气量，观察发酵情况。 1.3.4
微生物胞外多糖粗产量的测定。取40 ml发酵液，80 ℃水浴30 min灭活菌体，10 000 r/min离心20 min除去菌体；上清液加入3倍体积的乙醇，沉淀析出胞外多糖，40 ℃真空干燥至恒重，称重。
1.3.5
微生物细胞干重的测定。取适量的发酵液，经10 000 r/min下离心20 min后，用蒸馏水洗涤沉淀并离心，重复3次后，所得细胞复溶于蒸馏水中配成不同浓度菌悬液，在600 nm、0.5 cm光程下测定菌悬液OD值（控制OD值在0.2～08），同时对应取50 ml菌悬液于铝盒中，在105 ℃下恒温存放过夜后恒重称重，得到细胞干重（dry cell weight，DCW，g/L）。以菌悬液OD值和细胞干重作标准曲线，结果见图1。
取适量发酵液进行适当稀释后，以离心后的发酵上清液作空白参照，重复上述方法测定稀释后发酵液的OD值，参照标准曲线计算得到细胞干重。
1.3.6
乳液的制备。固定乳液中各组分：油相MCT 20%（W/W）；防腐剂NaN3 0.002%（W/W）；微生物胞外多糖1.0%（W/W）。配制1%微生物多糖溶液，充分混匀后，加入MCT，在26 000 r/min下用高速剪切乳化机冰浴预乳化3 min，再用高压纳米均质机于75 MPa下均质3个循环。
1.3.7
乳液粒径分布的测定。将乳液轻轻振荡混匀，取适量加入水中分散，用Mastersizer 2000型激光粒度仪测定乳液颗粒的大小及分布，每个样品重复测量3次。
1.3.8
乳液微观结构的观察。荧光显微镜观察：将40 μl 0.01%（W/V）尼罗红染液加入到5 ml新鲜乳液中，避光轻轻混匀，取适量滴于载玻片上，激发波长为488 nm，在荧光显微镜下观察并采集图像。光学显微镜观察：将乳液轻轻振荡混匀，取适量滴于载玻片上，在显微镜下观察，用丹东百特型颗粒成像系统拍照。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1
碳源对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖產量的影响。
分别以乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉为碳源，测定Klebsiella sp.PHRC1.001的胞外多糖产量，结果见图2。以蔗糖为碳源时，胞外多糖粗产量最高，乳糖次之，葡萄糖最低。综合经济因素，选择蔗糖为最佳碳源，产量为10.02 g/L。Li等[7]优化Klebsiella sp.H207产胞外多糖培养基组分时也发现蔗糖是最佳碳源。
安徽农业科学2015年
2.1.2
蔗糖浓度对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖产量的影响。由图3可知，在蔗糖浓度较低时，菌体代谢产糖活动较缓慢，随着蔗糖浓度的增大，产糖量增加，但在40 g/L时达到最大，而随着蔗糖浓度的继续增大，可能会抑制菌体生长和多糖积累，故确定蔗糖浓度为40 g/L。
2.1.3
氮源对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖产量的影响。由图4可知，菌体对无机氮源的利用优于有机氮源，在无机氮源中，以KNO3为氮源时多糖产量最高，故确定KNO3为最佳氮源。Morin[8]指出钾离子可加速糖酵解过程，从而促进多糖的合成代谢。
2.1.4
硝酸钾浓度对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖产量的影响。从图5可以看出，随着KNO3浓度增大，胞外多糖粗产量呈先增大后减小的趋势。可能的原因是，KNO3作为一种生理碱性盐，可中和发酵过程产生的酸，维持体系pH处于合理范围，利于菌体生长和产糖[9]。随着KNO3浓度增大到2 g/L时，产量达到最大为13.6 g/L，在更高KNO3浓度下体系pH过高而抑制菌体生长，因此选取KNO3浓度为2 g/L。
2.1.5
磷酸盐对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖产量的影响。在微生物发酵过程中磷酸盐通常发挥pH调节作用，而磷元素也对能量、核酸、糖类、脂类的代谢有重要影响。由图6可知，较低浓度下，3种磷酸盐浓度升高对产糖均有促进作用，而Na2HPO4和NaH2PO4Na2HPO4对产糖的促进作用不及NaH2PO4，同时过高磷含量可能会抑制代谢系统中某些酶的活性和合成，最终抑制多糖积累。故选取NaH2PO4作为磷酸盐，最优浓度为3.5 g/L。
2.1.6
无机盐对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖产量的影响。
从图7可以看出，钙离子的存在对产糖没有显著影响，CaCl2 0.8 g/L时多糖产量相对较高。从图8可以看出，镁离子对产糖具有明显的促进作用，这是由于镁离子是微生物代谢过程中很多重要酶的激活剂，能够促进核酸合成和糖代谢。由此，确定CaCl2和MgSO4·7H2O的适宜浓度分别为0.8 g/L和7 g/L。
2.2 正交试验
采用L18（35）正交表对蔗糖、KNO3、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4·7H2O浓度进行优化，结果见表1。由表1可知，5个因素对多糖粗产量的影响程度不同，依次是MgSO4·7H2O、CaCl2、蔗糖、KNO3、NaH2PO4，方差分析结果发现，MgSO4·7H2O的影响显著，最佳组合是40 g/L蔗糖、2.5 g/L KNO3、3.5 g/L NaH2PO4、0.8 g/L CaCl2、9.0 g/L MgSO4·7H2O。
利用此组合，经Klebsiella sp.PHRC1.001发酵72 h进行验证试验，多糖粗产量达到20.54 g/L，说明正交试验优化结果较好。 2.3Klebsiella sp.PHRC1.001發酵曲线
采用优化后的发酵培养基，在发酵罐中发酵培养，监测发酵过程中pH、细胞干重、多糖产量和氧气溶解量的变化情况，结果见图9。由
图9可知，在0～6 h内，氧气溶解量骤减，pH变化不大，生物量缓慢增加，菌体进行自身的生长，多糖积累未开始，从6 h开始，糖的合成开始活跃，在约48 h处，多糖积累达到最大，从
60 h开始，多糖积累开始下降。发酵过程中粗多糖产量最高达21 g/L左右。
2.4PHRC1.001胞外多糖的乳化性质
2.4.1
PHRC1.001胞外多糖的乳化活性。用PHRC1.001多糖为乳化剂，MCT为油相，制备出新鲜乳液。由图10A可知，新鲜乳液的颗粒粒径主要集中在7 μm左右，少部分在1.5 μm左右，平均粒径为（4.99±0.01）μm，结合图10B尼罗红特异性染色乳液油相在荧光显微镜下的颗粒图像，发现颗粒大小均一，说明1%多糖对MCT具有较好的乳化活性。Yao等[10]分别以传统阿拉伯胶（GA）和2种改性阿拉伯胶（EM2，EM10）为乳化剂，多糖浓度1%时，3种新鲜乳液粒径主要集中在10 μm左右，且分布不均一[11]。因而，在1%浓度下，PHRC1.001多糖乳化活性高于GA、EM2、EM10。
2.4.2
PHRC1.001胞外多糖的乳液物理稳定性。乳液物理稳定性是评价乳化剂乳化功能的重要指标。将制备好的乳液放置在高温（60 ℃）下分别贮存3 d（相当于常温放置半年），5和7 d（相当于常温放置一年），乳液颗粒尺寸分布的变化见图11。由图11A可以看出，乳液颗粒平均粒径变化不大。由图11B可以看出，乳液颗粒在贮存3 d后并没有明显变化，到7 d才开始出现轻微的聚集倾向，由此说明此乳液具有较好的长期物理稳定性。Kim等[6]报道的Kleibsiella oxytoca BSF1胞外多糖也具有较好的乳化稳定性，能在10 min内形成稳定的乳液，并在30 ℃、48 h内维持体系稳定而不发生乳析现象。
3结论
通过单因素试验和正交试验优化了Klebsiella sp.PHRC1.001的产糖培养基组成，在此培养基基础上产糖量达到20.54 g/L，约是初始培养基产糖量的2倍。通过发酵罐试验初步监测了该菌产糖过程中pH、细胞干重、多糖产量和氧气溶解量的变化，最优培养基糖产量为21 g/L。乳化试验表明，PHRC1.001胞外多糖具有较好的乳化活性，其乳液长期物理稳定性良好。因而，Klebsiella sp.PHRC1.001为一株高产胞外多糖菌株，且该多糖具有良好的乳化活性，工业应用前景良好。
4讨论
产量是工业发酵过程的重要指标，很多学者对Klebsiella sp.胞外多糖产量进行了报道，其中，Li等[7]发现具有絮凝和吸附重金属功能的Klebsiella sp.H207胞外多糖最高产量为15.05 g/L，Nie等[11]发现具有絮凝功能的Klebsiella pneumoniae NY1胞外多糖产量最高达14.9 g/L，此外，具有乳化活性的Klebsiella sp.PB12胞外多糖产量仅为2 g/L[8]。因此，该
图11高温加速试验中不同储藏时间下PHRC1.001多糖O/W乳液平均粒径D4，3（A）及光学显微镜形态（B）
研究发现的Klebsiella sp.PHRC1.001具有较高的胞外多糖合成能力，工业化前景良好。
参考文献
[1]
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[5] MANDAL A K，YADAV K K，SEN I K，et al.Partial characterization and flocculating behavior of an exopolysaccharide produced in nutrient-poor medium by a facultative oligotroph Klebsiella sp.PB12[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，115（1）：76-81. [6] KIM P，KIM J H.Characterization of a novel lipopolysaccharide biosurfactant from Klebsiella oxitoca [J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2005，10（6）：494-499.
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[9] 盧峥嵘，赵萌，沐万孟，等.发酵产菊糖果糖转移酶的培养基设计及菌体生长动力学研究[J].食品与发酵工业，2009（9）：19-24.
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[11] NIE M，YIN X，JIA J，et al.Production of a novel bioflocculant MNXY1 by Klebsiella pneumoniae strain NY1 and application in precipitation of cyanobacteria and municipal wastewater treatment[J].Journal of Applied Microbiology，2011，111（3）：547-558.
[目的]以克雷伯氏菌（Klebsiella sp.） PHRC1.001為发酵对象，优化该菌产胞外多糖的培养基组分，并初步评价了该多糖的乳化性质。[方法]以多糖粗产量为考察指标，采用单因素试验和正交试验法进行了发酵培养基组分优化，并通过发酵罐培养验证了优化培养基下的粗多糖产量。[结果]Klebsiella sp. PHRC1.001产胞外多糖的最优培养基为：蔗糖 40 g/L，CaCl2 0.8 g/L，KNO3 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 9.0 g/L，NaH2PO4 3.5 g/L，起始pH 7.0，在此培养基条件下发酵罐最高粗糖产量达到21 g/L，约是初始培养基条件下的2.1倍。此外，以中链甘油三酸酯（MCT）为油相（20%），1%胞外多糖为乳化剂制备O/W乳液，通过激光粒度仪、光学显微镜和荧光显微镜表征乳液的粒径分布和颗粒形态，通过加速试验表征乳液储藏物理稳定性，结果发现，PHRC1.001多糖具有较好的乳化活性，该O/W乳液储藏物理稳定性高。[结论]Klebsiella sp. PHRC1.001为一株高产胞外多糖菌株，且该多糖具有良好的乳化活性，工业应用前景良好。
关键词胞外多糖；克雷伯氏菌；培养基优化；乳化性质
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-038-05
基金项目国家优秀青年科学基金项目（31322043）；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划（T201307）；湖北省教育厅科学研究计划项目（Q20141401）。
作者简介
崔娜娜（1988-），女，安徽蚌埠人，硕士研究生，研究方向：食品科学。*通讯作者，教授，博士，从事亲水胶体方面的研究。
收稿日期20150525
微生物胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是一类天然大分子聚合物，由一些真菌、细菌和酵母代谢产生[1]，可作为增稠剂、乳化剂、保湿剂、结构改良剂和胶凝剂等，在食品、制药、化妆品等技术领域广泛使用[2]。近年来，乳化功能的微生物多糖成为研究热点，多糖类乳化剂乳化性质稳定，不易受温度和pH的影响，可生物降解，同时能被基因工程、生物学和生物化学技术进行修饰改造，因此具有良好的应用前景[3]。
克雷伯氏菌（Kleibsiella sp.）是一种能够产胞外多糖的革兰氏阴性杆菌，在自然界中广泛分布，主要存在于动物和人的呼吸道及肠道中[4]。目前，关于克雷伯氏菌胞外多糖乳化功能研究较少。Mandal等[5]发现Klebsiella sp. PB12胞外多糖对甲苯、正十六烷、橄榄油和煤油的乳化能力分别为666%、65%、63.3%、50%。Kim等[6]研究发现Kleibsiella oxytoca BSF1胞外多糖具有较好的乳化性，在pH 3.5～10.0可有效乳化，能在10 min内形成稳定的乳液，并在30 ℃、48 h内维持体系稳定，不发生乳析。
菲利普斯亲水胶体研究中心从活性污泥中筛选分离出一株产新型胞外多糖的菌株Kleibsiella sp. PHRC1.001，多糖产量较高，乳化性好，具有较高的研究价值。笔者主要优化了菌株产多糖的培养基组分，并初步评价了该多糖乳化性质，大大提高了多糖产量，明确了多糖在乳液制备中的乳化功能，同时为深入研究PHRC1.001多糖的结构和功能奠定基础。
1材料与方法
1.1原料
1.1.1
菌种。克雷伯氏菌（Kleibsiella sp.）PHRC1.001，由菲利普斯亲水胶体研究中心从活性污泥中自主筛选得到，已保藏于中国典型培养物保藏中心（中国，武汉），保藏编号为CCTCC NO：M 2014427。
1.1.2
培养基。斜面保藏培养基：蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母膏5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖15 g/L，KCl 5 g/L，蛋白胨7 g/L，pH 7.0。
初始发酵培养基：蔗糖40 g/L，CaCl2 0.5 g/L，酵母膏2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，KH2PO4·7H2O 5 g/L，pH 7.0。
1.1.3
主要试剂。中链甘油三酸酯（MCT）为食品级，购于马来西亚KLK OLEO公司；其他试剂均为国产分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2仪器设备
PTMR 2100高速剪切乳化机，瑞士Kinematica公司；M110L高压纳米均质机，美国Microfluidics公司；Mastersizer 2000激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；TU1990型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；TGL20M台式高速冷冻离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；EL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DZF型真空干燥箱，上海博迅实业有限公司。
1.3试验方法
1.3.1
培养方法。种子培养：取菌株菌种2环接种于种子培养基中，在30 ℃、220 r/min的条件下培养12 h。
发酵培养：以0.5%（V/V）的接种量接种于发酵培养基中，在30 ℃、220 r/min条件下发酵培养72 h。
1.3.2
单因素试验。采用单因素试验方法，以氮源、碳源、磷酸盐缓冲体系、无机盐作为发酵培养基的影响因素，每一步试验都建立在前一步的基础上，考察各因素对微生物胞外多糖粗产量的影响。
1.3.3
发酵罐试验。采用优化后的发酵培养基，在7 L发酵罐内，装液量4 L，搅拌速度300 r/min，通气量4×10-3m3/min，温度30 ℃，按2.5%（V/V）接种量接种后，间隔适当时间取样，测定pH、微生物细胞干重（Dry cell weight，DCW）、微生物多糖粗产量和溶解氧气量，观察发酵情况。 1.3.4
微生物胞外多糖粗产量的测定。取40 ml发酵液，80 ℃水浴30 min灭活菌体，10 000 r/min离心20 min除去菌体；上清液加入3倍体积的乙醇，沉淀析出胞外多糖，40 ℃真空干燥至恒重，称重。
1.3.5
微生物细胞干重的测定。取适量的发酵液，经10 000 r/min下离心20 min后，用蒸馏水洗涤沉淀并离心，重复3次后，所得细胞复溶于蒸馏水中配成不同浓度菌悬液，在600 nm、0.5 cm光程下测定菌悬液OD值（控制OD值在0.2～08），同时对应取50 ml菌悬液于铝盒中，在105 ℃下恒温存放过夜后恒重称重，得到细胞干重（dry cell weight，DCW，g/L）。以菌悬液OD值和细胞干重作标准曲线，结果见图1。
取适量发酵液进行适当稀释后，以离心后的发酵上清液作空白参照，重复上述方法测定稀释后发酵液的OD值，参照标准曲线计算得到细胞干重。
1.3.6
乳液的制备。固定乳液中各组分：油相MCT 20%（W/W）；防腐剂NaN3 0.002%（W/W）；微生物胞外多糖1.0%（W/W）。配制1%微生物多糖溶液，充分混匀后，加入MCT，在26 000 r/min下用高速剪切乳化机冰浴预乳化3 min，再用高压纳米均质机于75 MPa下均质3个循环。
1.3.7
乳液粒径分布的测定。将乳液轻轻振荡混匀，取适量加入水中分散，用Mastersizer 2000型激光粒度仪测定乳液颗粒的大小及分布，每个样品重复测量3次。
1.3.8
乳液微观结构的观察。荧光显微镜观察：将40 μl 0.01%（W/V）尼罗红染液加入到5 ml新鲜乳液中，避光轻轻混匀，取适量滴于载玻片上，激发波长为488 nm，在荧光显微镜下观察并采集图像。光学显微镜观察：将乳液轻轻振荡混匀，取适量滴于载玻片上，在显微镜下观察，用丹东百特型颗粒成像系统拍照。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1
碳源对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖產量的影响。
分别以乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉为碳源，测定Klebsiella sp.PHRC1.001的胞外多糖产量，结果见图2。以蔗糖为碳源时，胞外多糖粗产量最高，乳糖次之，葡萄糖最低。综合经济因素，选择蔗糖为最佳碳源，产量为10.02 g/L。Li等[7]优化Klebsiella sp.H207产胞外多糖培养基组分时也发现蔗糖是最佳碳源。
安徽农业科学2015年
2.1.2
蔗糖浓度对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖产量的影响。由图3可知，在蔗糖浓度较低时，菌体代谢产糖活动较缓慢，随着蔗糖浓度的增大，产糖量增加，但在40 g/L时达到最大，而随着蔗糖浓度的继续增大，可能会抑制菌体生长和多糖积累，故确定蔗糖浓度为40 g/L。
2.1.3
氮源对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖产量的影响。由图4可知，菌体对无机氮源的利用优于有机氮源，在无机氮源中，以KNO3为氮源时多糖产量最高，故确定KNO3为最佳氮源。Morin[8]指出钾离子可加速糖酵解过程，从而促进多糖的合成代谢。
2.1.4
硝酸钾浓度对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖产量的影响。从图5可以看出，随着KNO3浓度增大，胞外多糖粗产量呈先增大后减小的趋势。可能的原因是，KNO3作为一种生理碱性盐，可中和发酵过程产生的酸，维持体系pH处于合理范围，利于菌体生长和产糖[9]。随着KNO3浓度增大到2 g/L时，产量达到最大为13.6 g/L，在更高KNO3浓度下体系pH过高而抑制菌体生长，因此选取KNO3浓度为2 g/L。
2.1.5
磷酸盐对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖产量的影响。在微生物发酵过程中磷酸盐通常发挥pH调节作用，而磷元素也对能量、核酸、糖类、脂类的代谢有重要影响。由图6可知，较低浓度下，3种磷酸盐浓度升高对产糖均有促进作用，而Na2HPO4和NaH2PO4Na2HPO4对产糖的促进作用不及NaH2PO4，同时过高磷含量可能会抑制代谢系统中某些酶的活性和合成，最终抑制多糖积累。故选取NaH2PO4作为磷酸盐，最优浓度为3.5 g/L。
2.1.6
无机盐对Klebsiella sp.PHRC1.001胞外多糖产量的影响。
从图7可以看出，钙离子的存在对产糖没有显著影响，CaCl2 0.8 g/L时多糖产量相对较高。从图8可以看出，镁离子对产糖具有明显的促进作用，这是由于镁离子是微生物代谢过程中很多重要酶的激活剂，能够促进核酸合成和糖代谢。由此，确定CaCl2和MgSO4·7H2O的适宜浓度分别为0.8 g/L和7 g/L。
2.2 正交试验
采用L18（35）正交表对蔗糖、KNO3、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4·7H2O浓度进行优化，结果见表1。由表1可知，5个因素对多糖粗产量的影响程度不同，依次是MgSO4·7H2O、CaCl2、蔗糖、KNO3、NaH2PO4，方差分析结果发现，MgSO4·7H2O的影响显著，最佳组合是40 g/L蔗糖、2.5 g/L KNO3、3.5 g/L NaH2PO4、0.8 g/L CaCl2、9.0 g/L MgSO4·7H2O。
利用此组合，经Klebsiella sp.PHRC1.001发酵72 h进行验证试验，多糖粗产量达到20.54 g/L，说明正交试验优化结果较好。 2.3Klebsiella sp.PHRC1.001發酵曲线
采用优化后的发酵培养基，在发酵罐中发酵培养，监测发酵过程中pH、细胞干重、多糖产量和氧气溶解量的变化情况，结果见图9。由
图9可知，在0～6 h内，氧气溶解量骤减，pH变化不大，生物量缓慢增加，菌体进行自身的生长，多糖积累未开始，从6 h开始，糖的合成开始活跃，在约48 h处，多糖积累达到最大，从
60 h开始，多糖积累开始下降。发酵过程中粗多糖产量最高达21 g/L左右。
2.4PHRC1.001胞外多糖的乳化性质
2.4.1
PHRC1.001胞外多糖的乳化活性。用PHRC1.001多糖为乳化剂，MCT为油相，制备出新鲜乳液。由图10A可知，新鲜乳液的颗粒粒径主要集中在7 μm左右，少部分在1.5 μm左右，平均粒径为（4.99±0.01）μm，结合图10B尼罗红特异性染色乳液油相在荧光显微镜下的颗粒图像，发现颗粒大小均一，说明1%多糖对MCT具有较好的乳化活性。Yao等[10]分别以传统阿拉伯胶（GA）和2种改性阿拉伯胶（EM2，EM10）为乳化剂，多糖浓度1%时，3种新鲜乳液粒径主要集中在10 μm左右，且分布不均一[11]。因而，在1%浓度下，PHRC1.001多糖乳化活性高于GA、EM2、EM10。
2.4.2
PHRC1.001胞外多糖的乳液物理稳定性。乳液物理稳定性是评价乳化剂乳化功能的重要指标。将制备好的乳液放置在高温（60 ℃）下分别贮存3 d（相当于常温放置半年），5和7 d（相当于常温放置一年），乳液颗粒尺寸分布的变化见图11。由图11A可以看出，乳液颗粒平均粒径变化不大。由图11B可以看出，乳液颗粒在贮存3 d后并没有明显变化，到7 d才开始出现轻微的聚集倾向，由此说明此乳液具有较好的长期物理稳定性。Kim等[6]报道的Kleibsiella oxytoca BSF1胞外多糖也具有较好的乳化稳定性，能在10 min内形成稳定的乳液，并在30 ℃、48 h内维持体系稳定而不发生乳析现象。
3结论
通过单因素试验和正交试验优化了Klebsiella sp.PHRC1.001的产糖培养基组成，在此培养基基础上产糖量达到20.54 g/L，约是初始培养基产糖量的2倍。通过发酵罐试验初步监测了该菌产糖过程中pH、细胞干重、多糖产量和氧气溶解量的变化，最优培养基糖产量为21 g/L。乳化试验表明，PHRC1.001胞外多糖具有较好的乳化活性，其乳液长期物理稳定性良好。因而，Klebsiella sp.PHRC1.001为一株高产胞外多糖菌株，且该多糖具有良好的乳化活性，工业应用前景良好。
4讨论
产量是工业发酵过程的重要指标，很多学者对Klebsiella sp.胞外多糖产量进行了报道，其中，Li等[7]发现具有絮凝和吸附重金属功能的Klebsiella sp.H207胞外多糖最高产量为15.05 g/L，Nie等[11]发现具有絮凝功能的Klebsiella pneumoniae NY1胞外多糖产量最高达14.9 g/L，此外，具有乳化活性的Klebsiella sp.PB12胞外多糖产量仅为2 g/L[8]。因此，该
图11高温加速试验中不同储藏时间下PHRC1.001多糖O/W乳液平均粒径D4，3（A）及光学显微镜形态（B）
研究发现的Klebsiella sp.PHRC1.001具有较高的胞外多糖合成能力，工业化前景良好。
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