【摘 要】
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目的 构建 UHRF2 各个以结构域为基础的突变体原核表达载体,在大肠埃希菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定.方法 以 pCMV-3xFlag-UHRF2 为模板,PCR 扩增 UHRF2 的各个结构域
【机 构】
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重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心
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目的 构建 UHRF2 各个以结构域为基础的突变体原核表达载体,在大肠埃希菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定.方法 以 pCMV-3xFlag-UHRF2 为模板,PCR 扩增 UHRF2 的各个结构域基因片段,各 PCR 产物经酶切后连接到 pGEX-4T-1 载体上;将重组载体转化大肠埃希菌 (BL21菌株),IPTG 诱导表达各 GST 融合蛋白,超声波破碎细菌,离心收获蛋白并经谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B(glutathione sepharose 4B) 亲合纯化;纯化的蛋白经 SDS-PAGE 电泳后用考马斯亮蓝染色或免疫印记实验鉴定各蛋白表达情况.结果 成功构建了 UHRF2 结构域突变体的原核表达载体,各突变体蛋白表达正确.结论 UHRF2 各结构域突变体的成功构建便于用 GST pull-down 实验研究 UHRF2 参与与其它蛋白相互作用的结构域,为了解UHRF2 功能打下了基础.
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