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摘 要：以野生黄精不定芽为材料，以MS为基本培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂6-BA、2，4-D、NAA、KT进行3因素4水平的正交设计试验，筛选黄精增殖的最佳培养条件;探讨不同培养温度对黄精组培苗继代增殖的影响;以1/2 MS为基本培养基，探讨不同生长素及其浓度和不同培养容器对组培苗生根的影响。结果表明，黄精组培苗最佳继代增殖培养基为MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2，4-D + 0.4 mg/L NAA，最佳培养温度为22 ℃，平均繁殖系数达6.88;最佳生根培养基为1/2 MS + 0.5 mg/L NAA + 0.2 mg/L IBA，平均生根率達96.2%;接种袋是黄精工厂化育苗的首选生根培养容器。
关键词：黄精;离体快繁;丛生芽
中图分类号：S567.23 文献标识码：A
Optimization of Rapid Propagation Technology of Polygonatum
sibiricum
ZENG Wendan1，2， CAO Sheng1， SHANG Xiaohong1， LU Liuying1， XIAO Liang1， YAN Huabing1
1. Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China; 2. Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Lab， Nanning， Guangxi 530007， China
Abstract： In order to establish the optimum culture condition of Polygonatum sibiricum， the adventitious buds were used as the explants and MS as the basic medium to study the effects of different culture temperature and plant growth regulators （6-BA， 2，4-D， NAA， KT） with an orthogonal experimental design L9 （34） on multiplication and plant regeneration in vitro. 1/2 MS was used as the basic medium to study the effects of different plant growth regulators and culture vessel on rooting of tissue cultured plantlets. The optimal multiplication medium was MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2，4-D + 0.4 mg/L NAA. The optimal culture temperature was 22 ℃ and the average proliferation coefficient reached 6.88. The optimal rooting medium was 1/2 MS + 0.5 mg/L NAA + 0.2 mg/L IBA， and the average frequency of shoot rooting reached 96.2%. Inoculation bag was the first choice culture vessel for large-scale production of P. sibiricum.
Keywords： Polygonatum sibiricum; rapid propagation; multiple shoots
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.011
黄精（Polygonatum sibiricum）为百合科黄精属多年生草本植物，具有补中益气、益肾填精、滋阴润肺，生津补脾之功效[1-2]。目前黄精的主要繁殖方式为根茎繁殖和种子繁殖。但根茎繁殖方法不仅用种量大，且繁殖系数低;种子繁殖方法虽繁殖系数较高，但成苗时间久，一般种子繁殖移栽苗需3年时间。组织培养技术具有繁殖系数高、不受外界环境条件限制等特点，因此，利用植物组织培养技术建立黄精组培苗规模化生产技术体系是生产优质黄精种苗的有效途径。近年来，有关黄精离体快繁技术已开展部分研究。周新华等[3]利用均匀设计及其分析方法筛选出黄精不定芽增殖的最佳激素组合为1.49 mg/L KT和0.29 mg/L NAA;吕煜梦等[4]研究发现4.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA激素组合对三明野生黄精不定芽的诱导效果最佳;张瑜等[5]认为低浓度的TDZ对不定芽的诱导和生长有促进作用;徐红梅等[6]研究发现TDZ虽有利于多花黄精愈伤组织的分化，但对分化芽的进一步生长有抑制作用，易形成叶片变厚和不规则弯曲的变态叶。孙骏威等[7]通过研究不同细胞分裂素对黄精不定芽诱导及其增殖效果的影响发现，ZT对不定芽诱导效果最优，6-BA次之，KT对不定芽继代增殖的作用效果最差。本研究以前期获得的经愈伤组织分化产生的不定芽为外植体材料，利用正交试验设计方法，探讨不同生长调节剂对黄精不定芽继代增殖的影响;通过优化培养温度和培养容器，提高繁殖系数，降低生产成本，以实现黄精组培苗规模化，产业化生产。 1 材料与方法
1.1 材料
参考吕煜梦等[4]对野生黄精无菌体系建立的方法，经愈伤组织分化产生的不定芽为试验材料。
激素标准品6-BA、2，4-D、NAA、KT、IBA，购自美国Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 不同植物生长调节剂及其浓度对黄精组培苗继代增殖的影响 采用L9（34）正交设计，以MS为基本培养基，设置6-BA（1、2、3 mg/L）、2，4-D （0.1、0.2、0.4 mg/L）、NAA（0、0.2、0.4 mg/L）、KT（0、1.0、2.0 mg/L）作为试验因子，每个因子设置3个水平，具体设计方法如表1所示，试验共有9个处理。每个处理接种5瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次。接种30 d后统计繁殖系数。
1.2.2 不同培养温度对黄精组培苗继代增殖的影响 将获得的黄精不定芽置于3种不同培养温度即22、25、28 ℃人工气候箱培养，每个处理接种5瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次。接种30 d后统计繁殖系数并观察植株生长情况。
1.2.3 不同植物生长调节剂及其浓度对黄精组培苗生根的影响 将株高3～4 cm的组培苗接种于附加0.2～1.0 mg/L NAA和0.2～1.0 mg/L IBA的1/2 MS培养基中。每个处理接种5瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次。接种30 d后统计生根率、根数和平均根长，观察植株生长情况。
1.2.4 不同培养容器对黄精组培苗生根的影响 将株高3～4 cm的组培苗分别接种于瓶装和袋装培养基中，其培养基均为1/2 MS+ 0.5 mg/L NAA+ 0.2 mg/L IBA。每个处理接种5瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次。接种30 d后统计生根率、根数和平均根长，观察植株生长情况。
1.2.5 培养条件 除特殊说明外，培养温度均为（22±1）℃、光照强度1500～2000 lx、光照时间为12 h/d。培养基均添加30.0 g/L蔗糖和6.0 g/L琼脂粉，pH 5.8。
1.2.6 炼苗和移栽 参考曾文丹等[8]炼苗及移栽方法进行黄精组培苗移栽。移栽基质为珍珠岩︰草炭土（体积比3︰1）。
1.3 数据分析
数据采用SPSS 18.0和Excel 2010软件进行整理、统计和分析。
2 结果与分析
2.1 黄精组培苗继代增殖的适宜培养基
将带愈伤组织的不定芽转入继代增殖培养基，10 d后切口边缘开展形成新的愈伤组织，20 d后愈伤组织出现芽点，形成新的不定芽。随着培养时间的推移，不定芽叶片逐渐展开，形成植株（图1A、图1B、图1C）。9种不同培养基诱导不定芽的繁殖系数见表1，其中以处理5获得的繁殖系数最高（6.32），且植株长势旺盛，叶片生长正常。根据正交试验数据分析结果表明， 4因素的极差值大小顺序为6-BA>NAA>2，4-D> KT，即6-BA对不定芽继代增殖的影响最大，其次为NAA，而KT对不定芽继代增殖的影响最小（表1）。表2方差分析结果表明，仅6-BA与不定芽繁殖系数显著相关（P<0.05），其F值最高，为3.029。说明黄精组培苗在继代增殖过程中，6-BA是影响黄精组培苗繁殖系数的最关键因素。
2.2 黄精组培苗继代增殖的适宜温度
不同培养温度对黄精组培苗继代增殖的影响如表3所示，当培养温度为22 ℃，繁殖系数最高，为6.88，且不定芽生长势强，植株生长茂盛，叶片浓绿。随着培养温度的升高，繁殖系数降低，生长势变弱，且随着培养时间的推移，叶片逐渐变黄。当培养温度为30 ℃时，繁殖系数极显著降低，仅为4.27，且不定芽叶片黄化现象严重。由试验结果得知，黄精组培苗继代增殖的最佳培养温度为22 ℃。
2.3 黄精组培苗生根适宜培养基
由表4可知，添加不同浓度的植物生长调节剂，黄精组培苗均可生根。当培养基中单独添加NAA时，随着其浓度的增加，组培苗的生根率呈先增加后降低的趋势，添加0.5 mg/L NAA时，组培苗生根率最高，为81.7%。但添加1.0 mg/L NAA时，组培苗的根数和平均根长最长，分别为5.37和1.99 cm。当培养基中单独添加IBA时，组培苗也均可生根，但生根率、根数、平均根长等均小于单独添加NAA诱导的组培苗。以培养基中添加0.5 mg/L NAA和0.2 mg/L IBA 2种生长素时，组培苗的生根率最高，且根数最多（图1D、图1E），分别为96.2%和5.53。
2.4 黄精组培苗生根的适宜培养容器
由表5可知，采用组培瓶作为生根培养容器时，黄精组培苗的生根率、根数和平均根长虽均高于以接种袋为培养容器，但二者差异不显著。接種袋具有成本低、操作简单、空间利用率高的优点，是工厂化育苗的首选容器。
2.5 组培苗移栽
将所获生根组培苗移栽至珍珠岩︰草炭土（3∶1）混合基质中，30 d后组培苗移栽成活率达81%，其生长良好（图1F）。
3 讨论
在植物组织培养工作中，激素的种类组合及其浓度是影响植物愈伤组织诱导和植株再生的关键性因素之一，在激素种类较多时，需选用高效快速的方法找出最佳激素组合及其浓度。正交试验设计方法是进行植物离体快繁技术研究较简便、快捷且行之有效的方法[9-11]。孙英坤等[12]利用正交试验设计成功建立了濒危物种堇叶紫金牛高效组培快繁技术体系，推测基本培养基类型是丛生芽诱导和壮苗培养的关键影响因子，同时也是影响组培苗生根率的决定性因子;而IBA的浓度是影响根系数量和根系长度的决定性因子。彭斯文等[13]利用正交试验方法筛选出杜鹃兰组培快繁的适宜培养条件和培养基配方。陈雨露等[14]采用4因素4水平的正交设计试验，筛选出康乃馨试管开花的最佳培养条件，开花率可达87%。本研究通过正交试验探讨6-BA、2，4-D、NAA和KT对黄精不定芽继代增殖的影响发现，6-BA与不定芽繁殖系数呈现显著相关，其F值最高，说明6-BA对不定芽继代增殖的影响最大，NAA影响次之，KT影响最小。继代增殖培养基中不添加KT有利于黄精不定芽的增殖，这与吴宇函等[15]的研究结果不同，这可能与外植体来源不同、诱导组培苗的状态不同或黄精种源等不同有关。叶雨心等[16]研究发现KT和2，4-D对多花黄精愈伤组织的诱导起主要作用，说明不同植物激素在植物不同诱导阶段起着主要作用。 适宜的培养温度是植物在离体培养条件下获得较优分化能力的一个重要因素。不同植物适宜的培养温度不同，如海三棱藨草[17]继代增殖的适宜温度为30 ℃，番茄[18]的为28 ℃，而马尾松[19]、西藏虎头兰[20]适宜温度为20 ℃。本研究发现当培养温度高于22 ℃时，随培养时间的推移，黄精组培苗叶片易衰老黄化，生长势变弱，产生的愈伤组织易褐化，繁殖系数降低。这一研究结果与苏娟等[21]的研究结果一致。研究结果表明野生黄精组培苗适宜培养温度与在自然条件下喜荫凉的自然属性一致。
组培苗生根率的高低是能否规模化生产的关键因素之一，生长素IBA和NAA在植物分化不定根的过程中发挥着至关重要的作用。研究人员[22-24]通过探讨不同生长素对黄精组培苗生根的影响发现，IBA比2， 4-D、NAA更适合诱导黄精组培苗生根。本研究发现，不同浓度的NAA和IBA均能诱导黄精组培苗的生根，且NAA对不定根的诱导能力较IBA强，这与周新华等[25]的研究结果一致。当培养基添加0.5 mg/L NAA和0.02 mg/L IBA时，组培苗生根率最高，为96.2%。
参考文献
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责任编辑：崔丽虹
关键词：黄精;离体快繁;丛生芽
中图分类号：S567.23 文献标识码：A
Optimization of Rapid Propagation Technology of Polygonatum
sibiricum
ZENG Wendan1，2， CAO Sheng1， SHANG Xiaohong1， LU Liuying1， XIAO Liang1， YAN Huabing1
1. Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China; 2. Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Lab， Nanning， Guangxi 530007， China
Abstract： In order to establish the optimum culture condition of Polygonatum sibiricum， the adventitious buds were used as the explants and MS as the basic medium to study the effects of different culture temperature and plant growth regulators （6-BA， 2，4-D， NAA， KT） with an orthogonal experimental design L9 （34） on multiplication and plant regeneration in vitro. 1/2 MS was used as the basic medium to study the effects of different plant growth regulators and culture vessel on rooting of tissue cultured plantlets. The optimal multiplication medium was MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2，4-D + 0.4 mg/L NAA. The optimal culture temperature was 22 ℃ and the average proliferation coefficient reached 6.88. The optimal rooting medium was 1/2 MS + 0.5 mg/L NAA + 0.2 mg/L IBA， and the average frequency of shoot rooting reached 96.2%. Inoculation bag was the first choice culture vessel for large-scale production of P. sibiricum.
Keywords： Polygonatum sibiricum; rapid propagation; multiple shoots
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.011
黄精（Polygonatum sibiricum）为百合科黄精属多年生草本植物，具有补中益气、益肾填精、滋阴润肺，生津补脾之功效[1-2]。目前黄精的主要繁殖方式为根茎繁殖和种子繁殖。但根茎繁殖方法不仅用种量大，且繁殖系数低;种子繁殖方法虽繁殖系数较高，但成苗时间久，一般种子繁殖移栽苗需3年时间。组织培养技术具有繁殖系数高、不受外界环境条件限制等特点，因此，利用植物组织培养技术建立黄精组培苗规模化生产技术体系是生产优质黄精种苗的有效途径。近年来，有关黄精离体快繁技术已开展部分研究。周新华等[3]利用均匀设计及其分析方法筛选出黄精不定芽增殖的最佳激素组合为1.49 mg/L KT和0.29 mg/L NAA;吕煜梦等[4]研究发现4.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA激素组合对三明野生黄精不定芽的诱导效果最佳;张瑜等[5]认为低浓度的TDZ对不定芽的诱导和生长有促进作用;徐红梅等[6]研究发现TDZ虽有利于多花黄精愈伤组织的分化，但对分化芽的进一步生长有抑制作用，易形成叶片变厚和不规则弯曲的变态叶。孙骏威等[7]通过研究不同细胞分裂素对黄精不定芽诱导及其增殖效果的影响发现，ZT对不定芽诱导效果最优，6-BA次之，KT对不定芽继代增殖的作用效果最差。本研究以前期获得的经愈伤组织分化产生的不定芽为外植体材料，利用正交试验设计方法，探讨不同生长调节剂对黄精不定芽继代增殖的影响;通过优化培养温度和培养容器，提高繁殖系数，降低生产成本，以实现黄精组培苗规模化，产业化生产。 1 材料与方法
1.1 材料
参考吕煜梦等[4]对野生黄精无菌体系建立的方法，经愈伤组织分化产生的不定芽为试验材料。
激素标准品6-BA、2，4-D、NAA、KT、IBA，购自美国Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 不同植物生长调节剂及其浓度对黄精组培苗继代增殖的影响 采用L9（34）正交设计，以MS为基本培养基，设置6-BA（1、2、3 mg/L）、2，4-D （0.1、0.2、0.4 mg/L）、NAA（0、0.2、0.4 mg/L）、KT（0、1.0、2.0 mg/L）作为试验因子，每个因子设置3个水平，具体设计方法如表1所示，试验共有9个处理。每个处理接种5瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次。接种30 d后统计繁殖系数。
1.2.2 不同培养温度对黄精组培苗继代增殖的影响 将获得的黄精不定芽置于3种不同培养温度即22、25、28 ℃人工气候箱培养，每个处理接种5瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次。接种30 d后统计繁殖系数并观察植株生长情况。
1.2.3 不同植物生长调节剂及其浓度对黄精组培苗生根的影响 将株高3～4 cm的组培苗接种于附加0.2～1.0 mg/L NAA和0.2～1.0 mg/L IBA的1/2 MS培养基中。每个处理接种5瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次。接种30 d后统计生根率、根数和平均根长，观察植株生长情况。
1.2.4 不同培养容器对黄精组培苗生根的影响 将株高3～4 cm的组培苗分别接种于瓶装和袋装培养基中，其培养基均为1/2 MS+ 0.5 mg/L NAA+ 0.2 mg/L IBA。每个处理接种5瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次。接种30 d后统计生根率、根数和平均根长，观察植株生长情况。
1.2.5 培养条件 除特殊说明外，培养温度均为（22±1）℃、光照强度1500～2000 lx、光照时间为12 h/d。培养基均添加30.0 g/L蔗糖和6.0 g/L琼脂粉，pH 5.8。
1.2.6 炼苗和移栽 参考曾文丹等[8]炼苗及移栽方法进行黄精组培苗移栽。移栽基质为珍珠岩︰草炭土（体积比3︰1）。
1.3 数据分析
数据采用SPSS 18.0和Excel 2010软件进行整理、统计和分析。
2 结果与分析
2.1 黄精组培苗继代增殖的适宜培养基
将带愈伤组织的不定芽转入继代增殖培养基，10 d后切口边缘开展形成新的愈伤组织，20 d后愈伤组织出现芽点，形成新的不定芽。随着培养时间的推移，不定芽叶片逐渐展开，形成植株（图1A、图1B、图1C）。9种不同培养基诱导不定芽的繁殖系数见表1，其中以处理5获得的繁殖系数最高（6.32），且植株长势旺盛，叶片生长正常。根据正交试验数据分析结果表明， 4因素的极差值大小顺序为6-BA>NAA>2，4-D> KT，即6-BA对不定芽继代增殖的影响最大，其次为NAA，而KT对不定芽继代增殖的影响最小（表1）。表2方差分析结果表明，仅6-BA与不定芽繁殖系数显著相关（P<0.05），其F值最高，为3.029。说明黄精组培苗在继代增殖过程中，6-BA是影响黄精组培苗繁殖系数的最关键因素。
2.2 黄精组培苗继代增殖的适宜温度
不同培养温度对黄精组培苗继代增殖的影响如表3所示，当培养温度为22 ℃，繁殖系数最高，为6.88，且不定芽生长势强，植株生长茂盛，叶片浓绿。随着培养温度的升高，繁殖系数降低，生长势变弱，且随着培养时间的推移，叶片逐渐变黄。当培养温度为30 ℃时，繁殖系数极显著降低，仅为4.27，且不定芽叶片黄化现象严重。由试验结果得知，黄精组培苗继代增殖的最佳培养温度为22 ℃。
2.3 黄精组培苗生根适宜培养基
由表4可知，添加不同浓度的植物生长调节剂，黄精组培苗均可生根。当培养基中单独添加NAA时，随着其浓度的增加，组培苗的生根率呈先增加后降低的趋势，添加0.5 mg/L NAA时，组培苗生根率最高，为81.7%。但添加1.0 mg/L NAA时，组培苗的根数和平均根长最长，分别为5.37和1.99 cm。当培养基中单独添加IBA时，组培苗也均可生根，但生根率、根数、平均根长等均小于单独添加NAA诱导的组培苗。以培养基中添加0.5 mg/L NAA和0.2 mg/L IBA 2种生长素时，组培苗的生根率最高，且根数最多（图1D、图1E），分别为96.2%和5.53。
2.4 黄精组培苗生根的适宜培养容器
由表5可知，采用组培瓶作为生根培养容器时，黄精组培苗的生根率、根数和平均根长虽均高于以接种袋为培养容器，但二者差异不显著。接種袋具有成本低、操作简单、空间利用率高的优点，是工厂化育苗的首选容器。
2.5 组培苗移栽
将所获生根组培苗移栽至珍珠岩︰草炭土（3∶1）混合基质中，30 d后组培苗移栽成活率达81%，其生长良好（图1F）。
3 讨论
在植物组织培养工作中，激素的种类组合及其浓度是影响植物愈伤组织诱导和植株再生的关键性因素之一，在激素种类较多时，需选用高效快速的方法找出最佳激素组合及其浓度。正交试验设计方法是进行植物离体快繁技术研究较简便、快捷且行之有效的方法[9-11]。孙英坤等[12]利用正交试验设计成功建立了濒危物种堇叶紫金牛高效组培快繁技术体系，推测基本培养基类型是丛生芽诱导和壮苗培养的关键影响因子，同时也是影响组培苗生根率的决定性因子;而IBA的浓度是影响根系数量和根系长度的决定性因子。彭斯文等[13]利用正交试验方法筛选出杜鹃兰组培快繁的适宜培养条件和培养基配方。陈雨露等[14]采用4因素4水平的正交设计试验，筛选出康乃馨试管开花的最佳培养条件，开花率可达87%。本研究通过正交试验探讨6-BA、2，4-D、NAA和KT对黄精不定芽继代增殖的影响发现，6-BA与不定芽繁殖系数呈现显著相关，其F值最高，说明6-BA对不定芽继代增殖的影响最大，NAA影响次之，KT影响最小。继代增殖培养基中不添加KT有利于黄精不定芽的增殖，这与吴宇函等[15]的研究结果不同，这可能与外植体来源不同、诱导组培苗的状态不同或黄精种源等不同有关。叶雨心等[16]研究发现KT和2，4-D对多花黄精愈伤组织的诱导起主要作用，说明不同植物激素在植物不同诱导阶段起着主要作用。 适宜的培养温度是植物在离体培养条件下获得较优分化能力的一个重要因素。不同植物适宜的培养温度不同，如海三棱藨草[17]继代增殖的适宜温度为30 ℃，番茄[18]的为28 ℃，而马尾松[19]、西藏虎头兰[20]适宜温度为20 ℃。本研究发现当培养温度高于22 ℃时，随培养时间的推移，黄精组培苗叶片易衰老黄化，生长势变弱，产生的愈伤组织易褐化，繁殖系数降低。这一研究结果与苏娟等[21]的研究结果一致。研究结果表明野生黄精组培苗适宜培养温度与在自然条件下喜荫凉的自然属性一致。
组培苗生根率的高低是能否规模化生产的关键因素之一，生长素IBA和NAA在植物分化不定根的过程中发挥着至关重要的作用。研究人员[22-24]通过探讨不同生长素对黄精组培苗生根的影响发现，IBA比2， 4-D、NAA更适合诱导黄精组培苗生根。本研究发现，不同浓度的NAA和IBA均能诱导黄精组培苗的生根，且NAA对不定根的诱导能力较IBA强，这与周新华等[25]的研究结果一致。当培养基添加0.5 mg/L NAA和0.02 mg/L IBA时，组培苗生根率最高，为96.2%。
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责任编辑：崔丽虹