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摘要本文以氢氧化钙悬浮液和磷酸为主要实验原料，在室温25℃，pH值为11的条件下，用共滴定的方法合成羟基磷灰石。把羟基磷灰石粉与一定量的胶原蛋白溶液混合，经过物理发泡、冷冻、微波干燥的过程，得到羟基磷灰石/胶原蛋白多孔支架材料。运用XRD、SEM分析仪器和阿基米德原理及杠杆原理，对样品进行了检测。结果表明：用物理发泡法制得的多孔支架材料的总气孔率为79%～89%，抗压强度为0.3～1.1MPa。
关键词羟基磷灰石，胶原蛋白，支架材料，物理发泡
1前言
羟基磷灰石（HAP）的化学组成与自然骨相类似[1]，具有良好的生物相容性、生物活性和骨传导性，而且和人体骨组织具有极好的化学和生物亲合性[2]。作为培养细胞的支架材料，HAP在细胞粘附、增殖和分化方面起着重要的作用[3]，但单独使用时，可塑性差。胶原蛋白（Col）是脊柱动物的主要结构蛋白[4]，有良好的生物相容性、低免疫原性，具有促进细胞粘附、生长、繁殖的功能，因而作为一种临床生物材料在生物医学方面得到应用[4]，但单独使用时吸收快，机械性能差，不能达到骨修复材料的要求。
本实验以胶原蛋白和羟基磷灰石为主要原料，制成了羟基磷灰石和胶原蛋白复合多孔支架材料。利用胶原蛋白的粘结性，通过物理发泡，形成多孔的三维立体网状结构，这将有利于成骨细胞在支架材料上的附着和繁殖。
2实验
2.1 原 料
本实验所用胶原蛋白由湖州珍露生物制品有限公司提供，Ca(OH)2(广东汕头市西陇化工厂生产)和H3PO4（广东汕头达濠区精细化学品有限公司生产）为分析纯。
2.2实验方法
HAP粉体的合成：取一定量的Ca(OH)2悬浮液和磷酸溶液，通过滴定装置同时滴入放有50ml蒸馏水的三口烧瓶中，并用磁力搅拌器对液体进行强烈搅拌。控制温度为25℃，pH值为11，反应完成后陈化6～7天，用蒸馏水洗涤至中性，放入干燥箱中烘干，研磨成HAP粉体。
多孔支架材料的制备：称取一定量的HAP粉体与胶原蛋白溶液（HAP/Col=8/2）混合，物理发泡后呈泡沫状，注入准备好的石膏模具中，放入冰箱中在-25℃下冰冻1h，迅速放入微波炉中干燥，干燥后的样品，经简单修饰即成所需样品。
2.3 检 测
用日本理学D/max2200型全自动X－射线衍射仪检测HAP粉体的晶相结构和结晶程度，用飞利浦FEI公司制造的Quanta 200型扫描电镜(SEM)观察复合材料的孔结构，通过不同放大倍率的SEM照片，用数学统计法计算样品的孔径分布。用阿基米德原理测量样品的气孔率，并用杠杆原理测定样品的抗压强度（经标定，该强度数值误差为7%）。
3实验结果与讨论
3.1 HAP粉体的晶相结构与结晶程度分析
图1为实验室制得的HAP粉体的XRD图谱，（a）为用共滴定法合成的未经高温处理的HAP粉体，（b）为将（a）所制得的粉体经过150℃保温1.5h、300℃保温1h、750℃保温5h的高温处理后所得到的HAP粉。由图中可看出，图(b)的峰形明显比图(a)的尖锐，说明高温处理有利于HAP的结晶。而在人骨中的羟基磷灰石是低结晶度的[4]，因此本实验采用未经高温处理的HAP。
(a)未经高温处理的HAP (b)经高温处理的HAP
图1、样品的XRD图谱
3.2 扫描电镜(SEM)分析
图2为样品的SEM照片，由（a）图中可以看出，样品的孔呈不规则形态，且孔径不一，孔与孔之间相互连通。且在样品的大孔壁上存在大量的小孔，从而进一步保证了陶瓷支架材料的三维连通性。大孔主要是物理发泡过程中形成的泡孔；小孔是由水分子在冷冻后形成微小的冰晶，在干燥过程中升华而形成的。且在微波干燥过程中，样品有一定的膨胀，形成了一些连接大孔与小孔的通道，这些通道的存在有利于营养物质向支架内部运输。
（a）200× (b)1000×
图2、样品的SEM照片
3.3 样品的强度
图3（a）和（b）分别为样品的抗压强度和孔隙率与水含量的关系。从图可看出，样品的抗压强度为0.3～1.1MPa，开孔率为79%～89%。多孔材料在孔隙率达到80%以上时，强度会明显降低，但作为非承重的多孔支架材料只是在细胞植入的初期强度较弱，一旦细胞分化到足够的数量，长入支架内部，发生骨矿化，机械强度就会增加[6]。由图3(b)中曲线的趋势可以看出，水含量越高，样品的气孔率越大。由于气孔率和抗压强度呈反比，相应地抗压强度随着水含量的增加而降低。因此，可以通过改变水的含量来调节材料的孔隙率和强度。
(a) 抗压强度和水含量的关系
(b) 孔隙率和水含量的关系
图3、样品的抗压强度及开孔率与水含量的关系
3.4 样品的孔径分布
支架材料的孔隙率及孔径的大小在骨传导、骨向支架内的生长以及营养物质在支架内的运输有重要的作用。一般适于骨传导的最佳孔径为100～400μm[6]，但也有文献报道可以大到500μm以上。为了分析通过物理发泡制得的多孔陶瓷支架材料的孔径分布情况，根据不同放大倍率的样品的SEM照片，对样品的孔径大小进行测定计算，并采用数学统计法对孔径分布情况进行统计分析，所得到的分析结果如图4所示。
图4、样品的孔径分布
由图4的孔径分布情况可看出，物理发泡所得到样品的孔径在800μm以下， 100～700μm的孔所占的体积百分数为63.5%，占所有孔体积的74.3%。这种具有梯度孔径且三维连通的孔结构使材料具有较大的比表面积，有利于细胞在支架上的增殖和骨在支架上的传导。由于物理发泡的孔主要是由泡孔和冰晶升华留下的孔组成，所以通过控制混合物中水、胶原蛋白与羟基磷灰石的配比，可以控制不同的孔径，减少孔径分布的跨度，提高孔径分布的均匀度，使材料的孔结构更能满足生物实验的要求。
4结论
（1） 以实验室自制的羟基磷灰石粉和买来的胶原蛋白为主要原料，采用机械发泡、浇注成形、冷冻和微波干燥的工艺制得了羟基磷灰石/胶原蛋白多孔支架材料；
（2） 样品的SEM分析表明，样品具有800μm以下的梯度孔，孔与孔之间彼此相互连通，呈不规则形状；
（3） 样品的开孔率在79%～89%之间，抗压强度在0.3～1.1MPa之间，基本能满足工程支架材料对强度和孔隙率的要求；
（4） 通过对材料的抗压强度、孔隙率与水含量关系的分析得知，材料的抗压强度与水成反比；孔隙率与水成正比，所以可通过调节水的含量来调整材料的孔隙率和强度。
参考文献
1 Dean-Mo Liu.Preparation and Characterisation of Porous Hydroxyapatite Bioceramic via a Slip-Casting Route[J]. Ceramics International,1998,24
2 王莉丽，赵 康，陈永楠.凝胶成型法制备多孔羟基磷灰石生物陶瓷[J].硅酸盐通报,2005,2
3 Noriko Kotobuki,Koji Ioku,Daisuke Kawagoe,et al.Observation of osteogenic differentiation cascade of living mesenchymal stem cells on transparent hydroxyapatite ceramics[J].Biomaterials,2005,26
4 林晓艳.骨修复用胶原复合支架材料研究进展[J].国外医学生物医学工程分册,2004(2),27
5 林晓艳,温贤涛,李 虎等.共滴定法制备纳米羟基磷灰石/胶原复合材料及其性能[J].四川大学学报(工程科学版),2004(4),36
6 L.A.Cyster,D.M.Grant,S.M.Howdle, et al.The influence of dispersant concentration on the pore morphology of hydroxyapatite eramics for bone tissue engineering [J].Biomaterials, 2005,26
关键词羟基磷灰石，胶原蛋白，支架材料，物理发泡
1前言
羟基磷灰石（HAP）的化学组成与自然骨相类似[1]，具有良好的生物相容性、生物活性和骨传导性，而且和人体骨组织具有极好的化学和生物亲合性[2]。作为培养细胞的支架材料，HAP在细胞粘附、增殖和分化方面起着重要的作用[3]，但单独使用时，可塑性差。胶原蛋白（Col）是脊柱动物的主要结构蛋白[4]，有良好的生物相容性、低免疫原性，具有促进细胞粘附、生长、繁殖的功能，因而作为一种临床生物材料在生物医学方面得到应用[4]，但单独使用时吸收快，机械性能差，不能达到骨修复材料的要求。
本实验以胶原蛋白和羟基磷灰石为主要原料，制成了羟基磷灰石和胶原蛋白复合多孔支架材料。利用胶原蛋白的粘结性，通过物理发泡，形成多孔的三维立体网状结构，这将有利于成骨细胞在支架材料上的附着和繁殖。
2实验
2.1 原 料
本实验所用胶原蛋白由湖州珍露生物制品有限公司提供，Ca(OH)2(广东汕头市西陇化工厂生产)和H3PO4（广东汕头达濠区精细化学品有限公司生产）为分析纯。
2.2实验方法
HAP粉体的合成：取一定量的Ca(OH)2悬浮液和磷酸溶液，通过滴定装置同时滴入放有50ml蒸馏水的三口烧瓶中，并用磁力搅拌器对液体进行强烈搅拌。控制温度为25℃，pH值为11，反应完成后陈化6～7天，用蒸馏水洗涤至中性，放入干燥箱中烘干，研磨成HAP粉体。
多孔支架材料的制备：称取一定量的HAP粉体与胶原蛋白溶液（HAP/Col=8/2）混合，物理发泡后呈泡沫状，注入准备好的石膏模具中，放入冰箱中在-25℃下冰冻1h，迅速放入微波炉中干燥，干燥后的样品，经简单修饰即成所需样品。
2.3 检 测
用日本理学D/max2200型全自动X－射线衍射仪检测HAP粉体的晶相结构和结晶程度，用飞利浦FEI公司制造的Quanta 200型扫描电镜(SEM)观察复合材料的孔结构，通过不同放大倍率的SEM照片，用数学统计法计算样品的孔径分布。用阿基米德原理测量样品的气孔率，并用杠杆原理测定样品的抗压强度（经标定，该强度数值误差为7%）。
3实验结果与讨论
3.1 HAP粉体的晶相结构与结晶程度分析
图1为实验室制得的HAP粉体的XRD图谱，（a）为用共滴定法合成的未经高温处理的HAP粉体，（b）为将（a）所制得的粉体经过150℃保温1.5h、300℃保温1h、750℃保温5h的高温处理后所得到的HAP粉。由图中可看出，图(b)的峰形明显比图(a)的尖锐，说明高温处理有利于HAP的结晶。而在人骨中的羟基磷灰石是低结晶度的[4]，因此本实验采用未经高温处理的HAP。
(a)未经高温处理的HAP (b)经高温处理的HAP
图1、样品的XRD图谱
3.2 扫描电镜(SEM)分析
图2为样品的SEM照片，由（a）图中可以看出，样品的孔呈不规则形态，且孔径不一，孔与孔之间相互连通。且在样品的大孔壁上存在大量的小孔，从而进一步保证了陶瓷支架材料的三维连通性。大孔主要是物理发泡过程中形成的泡孔；小孔是由水分子在冷冻后形成微小的冰晶，在干燥过程中升华而形成的。且在微波干燥过程中，样品有一定的膨胀，形成了一些连接大孔与小孔的通道，这些通道的存在有利于营养物质向支架内部运输。
（a）200× (b)1000×
图2、样品的SEM照片
3.3 样品的强度
图3（a）和（b）分别为样品的抗压强度和孔隙率与水含量的关系。从图可看出，样品的抗压强度为0.3～1.1MPa，开孔率为79%～89%。多孔材料在孔隙率达到80%以上时，强度会明显降低，但作为非承重的多孔支架材料只是在细胞植入的初期强度较弱，一旦细胞分化到足够的数量，长入支架内部，发生骨矿化，机械强度就会增加[6]。由图3(b)中曲线的趋势可以看出，水含量越高，样品的气孔率越大。由于气孔率和抗压强度呈反比，相应地抗压强度随着水含量的增加而降低。因此，可以通过改变水的含量来调节材料的孔隙率和强度。
(a) 抗压强度和水含量的关系
(b) 孔隙率和水含量的关系
图3、样品的抗压强度及开孔率与水含量的关系
3.4 样品的孔径分布
支架材料的孔隙率及孔径的大小在骨传导、骨向支架内的生长以及营养物质在支架内的运输有重要的作用。一般适于骨传导的最佳孔径为100～400μm[6]，但也有文献报道可以大到500μm以上。为了分析通过物理发泡制得的多孔陶瓷支架材料的孔径分布情况，根据不同放大倍率的样品的SEM照片，对样品的孔径大小进行测定计算，并采用数学统计法对孔径分布情况进行统计分析，所得到的分析结果如图4所示。
图4、样品的孔径分布
由图4的孔径分布情况可看出，物理发泡所得到样品的孔径在800μm以下， 100～700μm的孔所占的体积百分数为63.5%，占所有孔体积的74.3%。这种具有梯度孔径且三维连通的孔结构使材料具有较大的比表面积，有利于细胞在支架上的增殖和骨在支架上的传导。由于物理发泡的孔主要是由泡孔和冰晶升华留下的孔组成，所以通过控制混合物中水、胶原蛋白与羟基磷灰石的配比，可以控制不同的孔径，减少孔径分布的跨度，提高孔径分布的均匀度，使材料的孔结构更能满足生物实验的要求。
4结论
（1） 以实验室自制的羟基磷灰石粉和买来的胶原蛋白为主要原料，采用机械发泡、浇注成形、冷冻和微波干燥的工艺制得了羟基磷灰石/胶原蛋白多孔支架材料；
（2） 样品的SEM分析表明，样品具有800μm以下的梯度孔，孔与孔之间彼此相互连通，呈不规则形状；
（3） 样品的开孔率在79%～89%之间，抗压强度在0.3～1.1MPa之间，基本能满足工程支架材料对强度和孔隙率的要求；
（4） 通过对材料的抗压强度、孔隙率与水含量关系的分析得知，材料的抗压强度与水成反比；孔隙率与水成正比，所以可通过调节水的含量来调整材料的孔隙率和强度。
参考文献
1 Dean-Mo Liu.Preparation and Characterisation of Porous Hydroxyapatite Bioceramic via a Slip-Casting Route[J]. Ceramics International,1998,24
2 王莉丽，赵 康，陈永楠.凝胶成型法制备多孔羟基磷灰石生物陶瓷[J].硅酸盐通报,2005,2
3 Noriko Kotobuki,Koji Ioku,Daisuke Kawagoe,et al.Observation of osteogenic differentiation cascade of living mesenchymal stem cells on transparent hydroxyapatite ceramics[J].Biomaterials,2005,26
4 林晓艳.骨修复用胶原复合支架材料研究进展[J].国外医学生物医学工程分册,2004(2),27
5 林晓艳,温贤涛,李 虎等.共滴定法制备纳米羟基磷灰石/胶原复合材料及其性能[J].四川大学学报(工程科学版),2004(4),36
6 L.A.Cyster,D.M.Grant,S.M.Howdle, et al.The influence of dispersant concentration on the pore morphology of hydroxyapatite eramics for bone tissue engineering [J].Biomaterials, 2005,26