【摘 要】
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目的 观察以腺相关病毒(AAV)为载体,含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1的反义RNA及小干扰RNA(siRNA)的重组AAV(rAAV/ANTI-TIMP-1/neo及rAAV/siRNA-TIMP-1/neo)感染
【基金项目】
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国家自然科学基金;北京市地区高等学校肝脏保护与再生调节重点实验室资助项目;北京市自然科学基金;北京市科技新星计划项目
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目的 观察以腺相关病毒(AAV)为载体,含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1的反义RNA及小干扰RNA(siRNA)的重组AAV(rAAV/ANTI-TIMP-1/neo及rAAV/siRNA-TIMP-1/neo)感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6后,TIMP-1表达的受抑制情况.方法 经聚合酶链反应(PCR)扩增及酶切后连接,将针对TIMP-1的反义RNA片段及siRNA片段分别构建于AAV载体中并测序鉴定,将其包装成重组病毒后感染大鼠肝星状细胞系HSCT6,同时设空白对照组.经G418以400 μg/ml的浓度筛选30d后,分别应用荧光定量PCR技术及Western blot检测重组病毒感染组及空白对照组HSC-T6 TIMP-1的基因转录及蛋白质表达水平.结果 经PCR、酶切及序列测定证实,两种重组AAV载体质粒(pdl6-95/ANTI-TIMP-1/neo和pdl6-95/siRNA-TIMP-1/neo)克隆成功.将重组质粒包装成病毒感染HSC-T6细胞30 d后,通过荧光定量PCR技术及Western blot分析显示,重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo组与对照组细胞相比,HSC-T6中的TIMP-1基因的转录被抑制(P＜0.01),且表达水平与对照组相比约下降60%;而rAAV/ANTI-TIMP-1/neo组及空载体组与对照组相比TIMP-1基因的转录及表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 通过AAV载体技术重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo可有效地抑制TIMP-1基因的表达,而针对TIMP-1基因全长的重组病毒rAAV/ANTI-TIMP-1/neo对体外培养的HSC-T6细胞TIMP-1基因的转录与表达无明显抑制作用.
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