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目的 将有促进软骨细胞增值作用的TGF-β1与藻酸钙凝胶有机结合,探索组织工程合适载体,了解TGF-β1对体外培养的藻酸钙凝胶中脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化的作用,为关节软骨缺损的修复提供实验依据.实验材料 6周龄Wister大鼠(250 g-300 g),雌雄不限,(中国医科大学实验动物中心提供);高糖DMEM培养基(Gibco,美国);I型胶原酶(Sigma,美国);鼠尾胶原(杭州生友生物技术有限公司);地塞米松,ITS+,牛血清白蛋白,维生素C(Sigma,美国),转化生长因子β1(PeproTech,美国);藻酸钙凝胶,II型胶原多克隆抗体,SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司);SRK LYOVAC GT2-9 冷冻干燥机(德国).实验方法 取大鼠双腹股沟脂肪组织.剪碎,消化,基础培养基终止消化,离心,弃上清,再用基础培养基重悬细胞,接种,培养.20 h后首次换液,以后3 d/次换液1次,7～10 d达到80%～90%融合时首次传代.取传到第4代的脂肪干细胞,消化,基础培养基重悬.接种于藻酸钙凝胶,24 h将基础培养基半量换成诱导培养基(转化生长因子β1 50 mg/L),再过24 h后全量换为诱导培养基,此后3 d/d换液1次.实验结果 ①细胞增殖检测:接种细胞后增殖,随着时间延长MTT值升高;②大体及显微镜观察:随着时间的延长,细胞逐渐布满整个空隙,并有基质分泌,细胞被包埋于其分泌的基质中,细胞与细胞之间,细胞与载体之间紧密结合;③HE染色:培养3周后HE染色可见大量的细胞外基质产生,细胞与细胞间以及细胞于载体间相互间紧密联结;④电镜观察:细胞黏附于藻酸钙凝胶上,细胞伸展,生长良好,细胞被包埋在其分泌的基质中;⑤II型胶原免疫组化检测:载体复合物II型胶原呈阳性.结论 1.藻酸钙凝胶对细胞的培养是三维培养,藻酸钙凝胶表面积大,内部孔隙多,适合于细胞黏附和进行营养交换,有利于细胞附着,生长,增值.2.TGF-β1不仅仅在软骨细胞体外培养过程中有促进作用,在藻酸钙凝胶载体上同样具有促脂肪干细胞向软骨细胞分化的作用.