【摘 要】
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目的:探讨优化原核表达方法以及用亲和层析的方法制备重组人快型肌球蛋白结合蛋白C (MYBPC2).方法:根据MYBPC2的序列设计一对引物,在上下游引物的5’端分别加上BamHI和HindⅢ
【机 构】
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中日友好医院风湿免疫科,北京协和医学院研究生院
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目的:探讨优化原核表达方法以及用亲和层析的方法制备重组人快型肌球蛋白结合蛋白C (MYBPC2).方法:根据MYBPC2的序列设计一对引物,在上下游引物的5’端分别加上BamHI和HindⅢ酶切位点.以健康人骨骼肌cDNA为模版,扩增第284位至第579位氨基酸残基对应的碱基序列,经双酶切后插入pMalc-5e载体中,测序鉴定重组质粒的序列,将构建好的重组质粒转化大肠杆菌中,IPTG诱导重组蛋白MYBPC2-MBP的表达,亲和层析纯化重组蛋白,蛋白电泳法鉴定蛋白的分子量及纯度,测定蛋白浓度并估算蛋白纯化后得率.用商品化的抗MYBPC2抗体证实所表达蛋白序列的正确性.以纯化的蛋白免疫动物获得动物免疫血清,用Western Blot的方法鉴定此蛋白的免疫原性.结果:人MYBPC2蛋白表达载体构建成功,每升大肠杆菌菌液可生产纯化后的重组MYBPC2蛋白约30mg,Western Blot显示重组蛋白与其抗体及抗血清特异结合.结论:本方法可以高效制备生产人MYBPC2蛋白片段,具备良好的抗原特异性和免疫原性.
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