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摘要
[目的] 建立能同时检测环丙沙星和恩诺沙星残留的HPLC紫外检测法。[方法] 采用10%三氯乙酸为提取液，直接从生鲜乳中提取环丙沙星和恩诺沙星，并进行HPLC检测。[结果] 环丙沙星和恩诺沙星的最低检测限为5 μg/L，在10～200 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系（r>0.99），平均回收率为84%～112%，变异系数均小于5%。[结论] 该方法不仅除蛋白和脂肪效果好，而且回收率较为理想，可以很好满足确证方法的要求，且重现性好。
关键词恩诺沙星；盐酸环丙沙星；高效液相色谱法；生鲜乳；残留
中图分类号S481+.8文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01724-02
Abstract [Objective] The research ained to establish HLPCultraviolet detection method for simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and enrofloxacin residues. [Method] Taking 10% trichloroacetic acid as extracting solution， ciprofloxacin hydroehloride and enrofloxacin were directly extracted from raw fresh milk to make HPLC detection. [Result] The lowest detection limit of ciprofloxaein hydroehloride and enrofloxacin was 5 μg/L and there was a good linear correlation in the range of 10-200 μg/L（r>0.99）. The average recovery rate was 84%-112% and the variation coefficient was less than 5%. [Conclusion] The method had better removal effects of protein and fat and the recovery rate was ideal. The method could better meet the demands of the confirmatory methods and the repeatability was good.
Key words Enrofloxacin； Ciprofloxacin hydroehloride； HPLC； Raw fresh milk； Residue
環丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）和恩诺沙星（Enrofloxacin，ERFX）是奶牛疾病治疗中常用的抗菌药物，鲜乳及乳制品中存在2种药物残留的风险，我国对这2种药物在鲜乳及乳制品中的残留量都有明确规定[1]。鲜乳及乳制品中环丙沙星和恩诺沙星残留的检测方法主要是高效液相色谱法（HPLC）和微生物法。高效液相色谱的检测器有质谱（MS）[2-6]、荧光检测器和紫外检测器[7]等。由于HPLC-MS检测费用昂贵，大多数中小乳品生产企业的HPLC主要配备紫外检测器；HPLC紫外检测法具有高效、快速、应用范围广等优点，因此建立同时检测环丙沙星和恩诺沙星残留的HPLC紫外检测法对于乳品企业保障奶源质量具有重要意义。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1
主要仪器。高效液相色谱仪（Agilent 1260）；岛津FA2004型电子天平；SHB-IIIS循环水式多用真空泵；涡旋仪；微量高速离心机；溶剂过滤器等。
1.1.2
标准品。恩诺沙星对照品，含量为99.9%，批号为H0081206，购自上海将来实业有限公司；盐酸环丙沙星对照品，含量为100%，批号为H010803，购自上海将来实业有限公司。
1.2.5
最低检测限和最低定量限的确定。在生鲜乳中添加不同浓度的盐酸环丙沙星和恩诺沙星，按照上述步骤进行测定，以S/N>3为最低检测限，以S/N>3且变异系数和回收率均符合检测要求的最低浓度作为样品中盐酸环丙沙星和恩诺沙星的最低定量限。按照外标法计算含量，并进行多点或单点校正。3 讨论
（2）环丙沙星和恩诺沙星分子中含有羧基和哌嗪基，属于两性化合物。因此，药物容易在水中发生解离，与固定相上的活性点产生强烈吸附，导致色谱峰拖尾、峰形异常和分离度下降[8]，试验中在流动相中加入三乙胺[9]作为扫尾剂以获得良好峰形。试验表明，乙腈的添加量对2种FQs药物的保留时间的影响较大[10]。试验表明，当乙腈比例为14%时，2种药物分离效果最好，且保留时间合理。在对流速的优化中发现，当流速为0.9 mol/min时，出峰时间和峰形比较理想。目前国内外对于这2种抗生素的HPLC紫外检测方法主要是单一检测，同时检测这2种抗生素的方法尚未见报道。该方法通过对流动相的反复选择最终实现了这2种物质的分离，达到了同时检测的目的。
（3）一般通过应用蛋白沉淀剂和提取剂（如乙腈、甲醇、乙醇等有机溶剂）[11-13]，去除生鲜乳样品中大量脂肪和蛋白质等物质对基质的干扰，参阅文献[13]中的方法并进行优化，最终采用10%三氯乙酸作为提取液直接从生鲜乳中提取残留药物，发现不仅除蛋白、脂肪效果好，而且提取时回收率较为理想，可以较好满足确证方法的要求，且重现性好。
参考文献
[1]
农业部公告第235号 动物性食品中兽药最高残留限量[J].食品卫生学杂志，1998，39（5）：329-332. [2] 邱银生，操继跃，王大菊.盐酸沙拉沙星在肉鸡组织中的残留[J].中国兽医学报，2001，21（5）：515-518.
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[10] 陈爱民， 井名冉， 等 反相高效相色谱法测定复方环丙沙星注射液的含量[J].中国药房， 2002， 213（3）： 168-169
[11] 高华鹏， 李佐卿.高效液相色谱法检测冷冻烤鳗中恩诺沙星等药物残留[J].理化检验-化学分册， 2005， 41（5）：331-333.
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[13] PECORELLI I，GALARINI R，BIBI R，et al.Simultaneous determination of 13 quinolones from feeds using accelerated solvent extraction and liquid chromatography[J].Anal Chim Acta，2003，483：81-89.
[目的] 建立能同时检测环丙沙星和恩诺沙星残留的HPLC紫外检测法。[方法] 采用10%三氯乙酸为提取液，直接从生鲜乳中提取环丙沙星和恩诺沙星，并进行HPLC检测。[结果] 环丙沙星和恩诺沙星的最低检测限为5 μg/L，在10～200 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系（r>0.99），平均回收率为84%～112%，变异系数均小于5%。[结论] 该方法不仅除蛋白和脂肪效果好，而且回收率较为理想，可以很好满足确证方法的要求，且重现性好。
关键词恩诺沙星；盐酸环丙沙星；高效液相色谱法；生鲜乳；残留
中图分类号S481+.8文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01724-02
Abstract [Objective] The research ained to establish HLPCultraviolet detection method for simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and enrofloxacin residues. [Method] Taking 10% trichloroacetic acid as extracting solution， ciprofloxacin hydroehloride and enrofloxacin were directly extracted from raw fresh milk to make HPLC detection. [Result] The lowest detection limit of ciprofloxaein hydroehloride and enrofloxacin was 5 μg/L and there was a good linear correlation in the range of 10-200 μg/L（r>0.99）. The average recovery rate was 84%-112% and the variation coefficient was less than 5%. [Conclusion] The method had better removal effects of protein and fat and the recovery rate was ideal. The method could better meet the demands of the confirmatory methods and the repeatability was good.
Key words Enrofloxacin； Ciprofloxacin hydroehloride； HPLC； Raw fresh milk； Residue
環丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）和恩诺沙星（Enrofloxacin，ERFX）是奶牛疾病治疗中常用的抗菌药物，鲜乳及乳制品中存在2种药物残留的风险，我国对这2种药物在鲜乳及乳制品中的残留量都有明确规定[1]。鲜乳及乳制品中环丙沙星和恩诺沙星残留的检测方法主要是高效液相色谱法（HPLC）和微生物法。高效液相色谱的检测器有质谱（MS）[2-6]、荧光检测器和紫外检测器[7]等。由于HPLC-MS检测费用昂贵，大多数中小乳品生产企业的HPLC主要配备紫外检测器；HPLC紫外检测法具有高效、快速、应用范围广等优点，因此建立同时检测环丙沙星和恩诺沙星残留的HPLC紫外检测法对于乳品企业保障奶源质量具有重要意义。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1
主要仪器。高效液相色谱仪（Agilent 1260）；岛津FA2004型电子天平；SHB-IIIS循环水式多用真空泵；涡旋仪；微量高速离心机；溶剂过滤器等。
1.1.2
标准品。恩诺沙星对照品，含量为99.9%，批号为H0081206，购自上海将来实业有限公司；盐酸环丙沙星对照品，含量为100%，批号为H010803，购自上海将来实业有限公司。
1.2.5
最低检测限和最低定量限的确定。在生鲜乳中添加不同浓度的盐酸环丙沙星和恩诺沙星，按照上述步骤进行测定，以S/N>3为最低检测限，以S/N>3且变异系数和回收率均符合检测要求的最低浓度作为样品中盐酸环丙沙星和恩诺沙星的最低定量限。按照外标法计算含量，并进行多点或单点校正。3 讨论
（2）环丙沙星和恩诺沙星分子中含有羧基和哌嗪基，属于两性化合物。因此，药物容易在水中发生解离，与固定相上的活性点产生强烈吸附，导致色谱峰拖尾、峰形异常和分离度下降[8]，试验中在流动相中加入三乙胺[9]作为扫尾剂以获得良好峰形。试验表明，乙腈的添加量对2种FQs药物的保留时间的影响较大[10]。试验表明，当乙腈比例为14%时，2种药物分离效果最好，且保留时间合理。在对流速的优化中发现，当流速为0.9 mol/min时，出峰时间和峰形比较理想。目前国内外对于这2种抗生素的HPLC紫外检测方法主要是单一检测，同时检测这2种抗生素的方法尚未见报道。该方法通过对流动相的反复选择最终实现了这2种物质的分离，达到了同时检测的目的。
（3）一般通过应用蛋白沉淀剂和提取剂（如乙腈、甲醇、乙醇等有机溶剂）[11-13]，去除生鲜乳样品中大量脂肪和蛋白质等物质对基质的干扰，参阅文献[13]中的方法并进行优化，最终采用10%三氯乙酸作为提取液直接从生鲜乳中提取残留药物，发现不仅除蛋白、脂肪效果好，而且提取时回收率较为理想，可以较好满足确证方法的要求，且重现性好。
参考文献
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[3] CINQUINA A L，ROBERTI P，GIANNETTI L.Determination of enrofloxacin And its metabolite ciprofloxaein in goat milk by high performance liquid Chromatography with diode-array detection optimization and validation[J].J Chromatogr"A，2003，987（I/2）：221-226.
[4] HERNANDEZ M，BORROLL F，CALULL M.Using nonaqueous capillary electra-phoresis To analyze several quinolones in pig kidney samples[J].Electrophoresis，2002，23（3）：506-511.
[5] HOLTZAPPLE C K，BUCKLEY S A，STANKER L H.Determination of fluoroquinolones in zerum using an on-line clean--up column coupled to high-performance immunoafllnity-revered-phase liquid chromatography [J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl，2001.754（1）：l-9.
[6] NOUWS J， EGMOND H， SMULDERS I，et al.A microbiological assay system for assessment of raw milk exceeding EU maximum residue levels[J]. International Diary Journal， 1999（9）：85-90.
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[13] PECORELLI I，GALARINI R，BIBI R，et al.Simultaneous determination of 13 quinolones from feeds using accelerated solvent extraction and liquid chromatography[J].Anal Chim Acta，2003，483：81-89.