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摘 要:花粉管通道法介导韭菜转基因尚处于研究阶段,它是基因工程技术与常规杂交育种相结合的育种方法。本文详尽介绍了外源DNA片段在韭菜基因组中整合的理论基础和受精过程转化的理论基础,韭菜利用花粉管通道法转基因的操作程序、影响因素及优缺点和前景。
关键词:花粉管通道法;韭菜;转基因育种
中图分类号:S633.3;Q781 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)03-0008-03
韭菜,属百合科,是原产于我国的多年生单子叶宿根蔬菜,抗寒﹑耐热﹑适应性强,在全国各地普遍栽种,是我国生产范围最广泛的香辛叶类蔬菜之一,经济效益十分可观[1]。
花粉管通道法早在20世纪70年代末80年代初就已在远缘杂交中开始应用,是基因工程技术与常规杂交育种相结合的方法[2]。它可以越过受体组织培养的过程,直接利用花粉粒为媒体,因此操作简单﹑方便易行,而且所需仪器设备少,成本低廉。利用该法可加快韭菜新品种的选育进程,改良其品质,提高其产量,增强其抗性,从而有效防治病虫害,减少使用化学药剂引起的环境污染。
1 外源DNA片段在韭菜基因组中整合的理论基础
从现代分子生物学水平看,植物DNA分子间常含有同源序列部分,韭菜DNA中就存在着大量高度重复序列,很多基础代谢酶系的基因是一样的。因此,外源植物DNA片段与韭菜基因组DNA杂交重组是有可能的。许多实验证明,原生质体直接吸收的DNA片段可以整合到核DNA。尽管目前对其整合机理尚不清楚,但大量实验证据均表明外源DNA是可以整合到卵细胞核DNA的。
2 韭菜受精过程转化的理论基础
韭菜花呈伞状花序,每一总苞一般有30～180朵小花,每朵小花有6片花瓣、6枚雄蕊,中央有1枚雌蕊。选择花位较好的小花作为转化对象。小花开放初期,柱头针尖状,2～3 d后柱头伸长,顶端膨大,分三裂,并有黏液出现,此时是授粉的最佳时期[3]。传粉完成后,花粉便在柱头上萌发出花粉管,管内产生雄性配子——精子,通过花粉管伸长,直达胚珠的胚囊内部,与卵细胞和极核互相融合,这是有性生殖过程的重要阶段。受精后胚珠进一步发育为种子,受精极核发育成胚乳。受精过程的主要环节是花粉粒的萌发、花粉管的伸长和精卵细胞的融合。 由此,理论上可知:①滴注在柱头上的外源DNA片段可以随着花粉管进入胚囊,因为花粉管是先进入助细胞或胚囊后再破裂,所以外源DNA悬浮液不管在花粉管腔内或腔外都可以进入胚囊;②卵细胞在远离珠孔端,无细胞壁,仅有细胞膜,进入胚囊的精核先是染色体附着在核膜上,然后断裂分散,并与卵核DNA融合;③在胚发育初期,即原胚期间细胞无厚的细胞壁,具有很强的分裂能力,并从胚囊中吸取营养物质,外源DNA可被吸入这些细胞,参与核的融合;④花粉管导入外源DNA的关键在于掌握受精过程的时间。
3 花粉管通道法介导韭菜转基因的操作程序
3.1 外源DNA制备
3.1.1 从供体中提取DNA ①提取供体的总DNA;②DNA纯化,测定230、260、280 nm处的光吸收值,计算比值;③酶切:用核酸内切酶HindⅢ、BamHⅠ等酶切成片段;④DNA导入液:配制SSC溶液(0.15 mol/L NaCl,0.015 mol/L柠檬酸钠,用10 mmol/L NaOH调至pH 7.0,高压灭菌),制备浓度为500～1 000 μg/ml的DNA导入液,用光谱扫描显示出典型的核酸吸收图谱,符合外源 DNA导入要求。
3.1.2 从细菌中提取质粒DNA 可以直接从大肠杆菌中提取中介载体质粒DNA,并酶切后制备符合要求的外源DNA导入液。
3.1.3 从重组Ti质粒中获得DNA 从农杆菌中提取已重组构建的Ti质粒,获得带有npt-Ⅱ或gus等报告基因及目的基因的质粒DNA,酶切后制备成符合要求的外源DNA导入液。
3.2 外源DNA导入的方法及时间
3.2.1 柱头涂抹法 未授粉前,先用DNA导入液涂抹柱头,再人工授粉,迅速套袋。
3.2.2 柱头切除法 当受体韭菜自花授粉一定时间后(一般2～3 h),切去花柱,将DNA导入液滴于切口,迅速套袋,1 h后复滴1次。
3.2.3 花粉粒吸入法 提前去雄并套袋隔离,用DNA导入液处理花粉粒,使外源DNA进入花粉粒,然后进行人工授粉套袋。
各实验均以不含DNA的等量SSC溶液作对照。
3.3 后代材料处理将获得的韭菜子代点播在同一实验田,进行田间试验,综合考察以便获得新品种。
3.4 转基因目标性状的鉴定
转基因后收获的种子进行鉴定时,必须以原韭菜受体品种为对照。程序如下:
(1)转基因的受体韭菜上有标记基因时,可进行标记基因的表达鉴定,具有速度快、费用低、可大大减少工作量的优点。但应注意,在长期研究中,存在着标记基因表达与转基因表达之间的不完全相关关系。
(2)生物学测定:针对转基因后应当表达的表现型,直接应用生物学的方法进行鉴定以明确目的基因能否在受体韭菜中表达出目标性状及其表达水平,如抗虫性等。
(3)目的基因及其表达的分子鉴定:采用PCR方法和Southern Blot方法进行目的基因整合的分析,采用Western Blot等方法进行目的基因在受体中表达及表达水平的分析。
(4)从分子基础上明确转基因插入韭菜受体基因组之后的存在状态,为进一步的分子遗传研究提供依据。
4 韭菜花粉管通道法转基因应用的影响因素及其优缺点
4.1 韭菜花粉管通道法转基因应用中的影响因素
(1)关键因素在于精确掌握韭菜的受精过程及时间规律;
(2)DNA导入液的浓度、pH值等;
(3)导入DNA的分子结构及其片段大小。环状分子难以转化,大片段DNA转化率低,片段太小不能保证完整基因存在,要选用大小适宜的DNA片段,这需要长期的实验积累。
4.2 优点
(1)利用韭菜的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA,无需细胞、原生质体等的组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。
(2)方法简便,育种工作者易于掌握。
(3)育种时间缩短。在自花授粉的基础上只有部分外源DNA片段进入受体韭菜基因组,避免了供体基因与受体基因组全面重组,因而易于稳定。
(4)可以任意选择生产上的当家品种进行外源DNA的导入,达到目的性状基因的转移。可避免一般生物技术的实验室研究与大田要求脱节的问题。
4.3 缺点
(1) 外源DNA片段的导入,可能带入少量目的性状基因以外的DNA片段。
(2) 该技术限于韭菜开花时(7月底～9月中旬)才能应用。
(3)外源DNA能否与韭菜受体基因组整合,决定于目的性状基因的结构与功能是否与受体韭菜基因组和细胞代谢相容。不受单基因或单片段DNA控制的多基因性状,不能或很难通过这一技术导入。
(4)外源基因的导入具有很大的随机性,和染色体配对完全不同,应根据导入受体韭菜植株的单株记录,单株扩种检验、繁殖获得目的性状的后代,必须从整体看是否符合育种要求。
5 结语
在20世纪70年代周光宇先生提出了DNA片段杂交假说[4],并在80年代建立了利用花粉管通道法直接导入外源DNA的技术。在随后二三十年中,许多学者采用此技术开展了水稻[5,6]、小麦[7,8]、玉米[9]、大豆[10,11]、棉花[12,13]等多种农作物改良研究,而且都有成功先例。花粉管导入外源DNA转化韭菜的转基因方法利用自身的生殖系统作为载体是得天独厚的长处,可创造变异,优化农艺性状,实现韭菜的分子育种,为韭菜育种提供新种质,拓宽了韭菜的基因库,为现阶段韭菜育种增加了新技术新方法。相信随着花粉管通道法在韭菜转基因中的应用研究进一步深入,其必能在韭菜育种中发挥重要作用。
参 考 文 献:
[1] 吴国兴主编.韭菜保护地栽培[M].北京:金盾出版社,2001,1.
[2] Zhou G Y,Weng J,Zeng Y,et al.Introduction of exogenous DNA into cotton embryos [J].Methods in Enzymology,1983,101:433-481.
[3] 尹守恒,刘宏敏,等编著.韭菜[M].郑州:河南科学技术出版社,2007,23.
[4] 周光宇.从生物化学的角度探讨远缘杂交的理论[J] .中国农业科学,1978,2:16-20.
[5] 刘国华,陈立云,洪亚辉,等.外源DNA导入诱导水稻高蛋白质变异的研究[J].湖南农业大学学报,2000,26(6):415-417.
[6] 李建粤,范士靖,邹 征,等.大豆DNA导入引起稻米蛋白质含量变异的遗传稳定性及赖氨酸含量分析[J].种子,2001,6:3-7.
[7] 王亚馥,陈克明,焦成瑾,等.外源DNA导入小麦后的变异系生物学特性及胚乳蛋白的研究[J].作物学报,1995,21(4):404-411.
[8] 朱新产,赵文明.豌豆花DNA导入小麦对籽粒蛋白质的影响 [J].西北农业大学学报,1995,23(2):103-105.
[9] 耿庆汉,张海明,莫力根,等.小麦DNA导入玉米引起性状变异的研究[J].内蒙古农牧学院学报,1992,13(1):14-21.
[10]雷勃钧,尹光初,卢翠华,等.外源DNA直接导入大豆的研究[J].大豆科学,1991,10(1):58-62.
[11]雷勃钧,钱 华,李希臣,等.通过直接引入外源DNA育成高产、优质、高蛋白大豆新品种黑生101[J].作物学报,2000,26(6):725-730.
[12]黄骏麒,钱思颖,刘桂铃,等.外源海岛棉DNA导致陆地棉性状的变异[J].遗传学报,1981,8(1):56-62.
[13]龚蓁蓁,沈慰芳,周光宇,等.受粉后外源DNA导入植物技术 [J].中国科学B辑,1988,6:611-614.
关键词:花粉管通道法;韭菜;转基因育种
中图分类号:S633.3;Q781 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)03-0008-03
韭菜,属百合科,是原产于我国的多年生单子叶宿根蔬菜,抗寒﹑耐热﹑适应性强,在全国各地普遍栽种,是我国生产范围最广泛的香辛叶类蔬菜之一,经济效益十分可观[1]。
花粉管通道法早在20世纪70年代末80年代初就已在远缘杂交中开始应用,是基因工程技术与常规杂交育种相结合的方法[2]。它可以越过受体组织培养的过程,直接利用花粉粒为媒体,因此操作简单﹑方便易行,而且所需仪器设备少,成本低廉。利用该法可加快韭菜新品种的选育进程,改良其品质,提高其产量,增强其抗性,从而有效防治病虫害,减少使用化学药剂引起的环境污染。
1 外源DNA片段在韭菜基因组中整合的理论基础
从现代分子生物学水平看,植物DNA分子间常含有同源序列部分,韭菜DNA中就存在着大量高度重复序列,很多基础代谢酶系的基因是一样的。因此,外源植物DNA片段与韭菜基因组DNA杂交重组是有可能的。许多实验证明,原生质体直接吸收的DNA片段可以整合到核DNA。尽管目前对其整合机理尚不清楚,但大量实验证据均表明外源DNA是可以整合到卵细胞核DNA的。
2 韭菜受精过程转化的理论基础
韭菜花呈伞状花序,每一总苞一般有30～180朵小花,每朵小花有6片花瓣、6枚雄蕊,中央有1枚雌蕊。选择花位较好的小花作为转化对象。小花开放初期,柱头针尖状,2～3 d后柱头伸长,顶端膨大,分三裂,并有黏液出现,此时是授粉的最佳时期[3]。传粉完成后,花粉便在柱头上萌发出花粉管,管内产生雄性配子——精子,通过花粉管伸长,直达胚珠的胚囊内部,与卵细胞和极核互相融合,这是有性生殖过程的重要阶段。受精后胚珠进一步发育为种子,受精极核发育成胚乳。受精过程的主要环节是花粉粒的萌发、花粉管的伸长和精卵细胞的融合。 由此,理论上可知:①滴注在柱头上的外源DNA片段可以随着花粉管进入胚囊,因为花粉管是先进入助细胞或胚囊后再破裂,所以外源DNA悬浮液不管在花粉管腔内或腔外都可以进入胚囊;②卵细胞在远离珠孔端,无细胞壁,仅有细胞膜,进入胚囊的精核先是染色体附着在核膜上,然后断裂分散,并与卵核DNA融合;③在胚发育初期,即原胚期间细胞无厚的细胞壁,具有很强的分裂能力,并从胚囊中吸取营养物质,外源DNA可被吸入这些细胞,参与核的融合;④花粉管导入外源DNA的关键在于掌握受精过程的时间。
3 花粉管通道法介导韭菜转基因的操作程序
3.1 外源DNA制备
3.1.1 从供体中提取DNA ①提取供体的总DNA;②DNA纯化,测定230、260、280 nm处的光吸收值,计算比值;③酶切:用核酸内切酶HindⅢ、BamHⅠ等酶切成片段;④DNA导入液:配制SSC溶液(0.15 mol/L NaCl,0.015 mol/L柠檬酸钠,用10 mmol/L NaOH调至pH 7.0,高压灭菌),制备浓度为500～1 000 μg/ml的DNA导入液,用光谱扫描显示出典型的核酸吸收图谱,符合外源 DNA导入要求。
3.1.2 从细菌中提取质粒DNA 可以直接从大肠杆菌中提取中介载体质粒DNA,并酶切后制备符合要求的外源DNA导入液。
3.1.3 从重组Ti质粒中获得DNA 从农杆菌中提取已重组构建的Ti质粒,获得带有npt-Ⅱ或gus等报告基因及目的基因的质粒DNA,酶切后制备成符合要求的外源DNA导入液。
3.2 外源DNA导入的方法及时间
3.2.1 柱头涂抹法 未授粉前,先用DNA导入液涂抹柱头,再人工授粉,迅速套袋。
3.2.2 柱头切除法 当受体韭菜自花授粉一定时间后(一般2～3 h),切去花柱,将DNA导入液滴于切口,迅速套袋,1 h后复滴1次。
3.2.3 花粉粒吸入法 提前去雄并套袋隔离,用DNA导入液处理花粉粒,使外源DNA进入花粉粒,然后进行人工授粉套袋。
各实验均以不含DNA的等量SSC溶液作对照。
3.3 后代材料处理将获得的韭菜子代点播在同一实验田,进行田间试验,综合考察以便获得新品种。
3.4 转基因目标性状的鉴定
转基因后收获的种子进行鉴定时,必须以原韭菜受体品种为对照。程序如下:
(1)转基因的受体韭菜上有标记基因时,可进行标记基因的表达鉴定,具有速度快、费用低、可大大减少工作量的优点。但应注意,在长期研究中,存在着标记基因表达与转基因表达之间的不完全相关关系。
(2)生物学测定:针对转基因后应当表达的表现型,直接应用生物学的方法进行鉴定以明确目的基因能否在受体韭菜中表达出目标性状及其表达水平,如抗虫性等。
(3)目的基因及其表达的分子鉴定:采用PCR方法和Southern Blot方法进行目的基因整合的分析,采用Western Blot等方法进行目的基因在受体中表达及表达水平的分析。
(4)从分子基础上明确转基因插入韭菜受体基因组之后的存在状态,为进一步的分子遗传研究提供依据。
4 韭菜花粉管通道法转基因应用的影响因素及其优缺点
4.1 韭菜花粉管通道法转基因应用中的影响因素
(1)关键因素在于精确掌握韭菜的受精过程及时间规律;
(2)DNA导入液的浓度、pH值等;
(3)导入DNA的分子结构及其片段大小。环状分子难以转化,大片段DNA转化率低,片段太小不能保证完整基因存在,要选用大小适宜的DNA片段,这需要长期的实验积累。
4.2 优点
(1)利用韭菜的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA,无需细胞、原生质体等的组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。
(2)方法简便,育种工作者易于掌握。
(3)育种时间缩短。在自花授粉的基础上只有部分外源DNA片段进入受体韭菜基因组,避免了供体基因与受体基因组全面重组,因而易于稳定。
(4)可以任意选择生产上的当家品种进行外源DNA的导入,达到目的性状基因的转移。可避免一般生物技术的实验室研究与大田要求脱节的问题。
4.3 缺点
(1) 外源DNA片段的导入,可能带入少量目的性状基因以外的DNA片段。
(2) 该技术限于韭菜开花时(7月底～9月中旬)才能应用。
(3)外源DNA能否与韭菜受体基因组整合,决定于目的性状基因的结构与功能是否与受体韭菜基因组和细胞代谢相容。不受单基因或单片段DNA控制的多基因性状,不能或很难通过这一技术导入。
(4)外源基因的导入具有很大的随机性,和染色体配对完全不同,应根据导入受体韭菜植株的单株记录,单株扩种检验、繁殖获得目的性状的后代,必须从整体看是否符合育种要求。
5 结语
在20世纪70年代周光宇先生提出了DNA片段杂交假说[4],并在80年代建立了利用花粉管通道法直接导入外源DNA的技术。在随后二三十年中,许多学者采用此技术开展了水稻[5,6]、小麦[7,8]、玉米[9]、大豆[10,11]、棉花[12,13]等多种农作物改良研究,而且都有成功先例。花粉管导入外源DNA转化韭菜的转基因方法利用自身的生殖系统作为载体是得天独厚的长处,可创造变异,优化农艺性状,实现韭菜的分子育种,为韭菜育种提供新种质,拓宽了韭菜的基因库,为现阶段韭菜育种增加了新技术新方法。相信随着花粉管通道法在韭菜转基因中的应用研究进一步深入,其必能在韭菜育种中发挥重要作用。
参 考 文 献:
[1] 吴国兴主编.韭菜保护地栽培[M].北京:金盾出版社,2001,1.
[2] Zhou G Y,Weng J,Zeng Y,et al.Introduction of exogenous DNA into cotton embryos [J].Methods in Enzymology,1983,101:433-481.
[3] 尹守恒,刘宏敏,等编著.韭菜[M].郑州:河南科学技术出版社,2007,23.
[4] 周光宇.从生物化学的角度探讨远缘杂交的理论[J] .中国农业科学,1978,2:16-20.
[5] 刘国华,陈立云,洪亚辉,等.外源DNA导入诱导水稻高蛋白质变异的研究[J].湖南农业大学学报,2000,26(6):415-417.
[6] 李建粤,范士靖,邹 征,等.大豆DNA导入引起稻米蛋白质含量变异的遗传稳定性及赖氨酸含量分析[J].种子,2001,6:3-7.
[7] 王亚馥,陈克明,焦成瑾,等.外源DNA导入小麦后的变异系生物学特性及胚乳蛋白的研究[J].作物学报,1995,21(4):404-411.
[8] 朱新产,赵文明.豌豆花DNA导入小麦对籽粒蛋白质的影响 [J].西北农业大学学报,1995,23(2):103-105.
[9] 耿庆汉,张海明,莫力根,等.小麦DNA导入玉米引起性状变异的研究[J].内蒙古农牧学院学报,1992,13(1):14-21.
[10]雷勃钧,尹光初,卢翠华,等.外源DNA直接导入大豆的研究[J].大豆科学,1991,10(1):58-62.
[11]雷勃钧,钱 华,李希臣,等.通过直接引入外源DNA育成高产、优质、高蛋白大豆新品种黑生101[J].作物学报,2000,26(6):725-730.
[12]黄骏麒,钱思颖,刘桂铃,等.外源海岛棉DNA导致陆地棉性状的变异[J].遗传学报,1981,8(1):56-62.
[13]龚蓁蓁,沈慰芳,周光宇,等.受粉后外源DNA导入植物技术 [J].中国科学B辑,1988,6:611-614.