【摘 要】
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目的利用高内涵分析(HCA)方法用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞建立人δ阿片受体(h DOR)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的蛋白激酶A催化亚基(PKAcat)融合蛋白(PKAcat-EGFP)稳定共表
【机 构】
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军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所; 抗毒药物与毒理学国家重点实验室; 神经精神药理学北京市重点实验室;
【基金项目】
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国家科技重大专项(2015ZX09501003)~~
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目的利用高内涵分析(HCA)方法用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞建立人δ阿片受体(h DOR)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的蛋白激酶A催化亚基(PKAcat)融合蛋白(PKAcat-EGFP)稳定共表达的细胞模型,为体外高通量筛选作用于h DOR的药物及药物分子机制研究奠定基础。方法通过脂质体介导法将潮霉素B抗性的h DOR重组质粒(pc DNA3.1/Hygro(+)-h DOR)转染入已稳定表达PKAcat-EGFP的CHO细胞中,随后用含潮霉素B的选择性培养基培养细胞,有限稀释法挑取耐药单克隆,PKA重分布实验筛选阳性克隆,利用Z′因子对建立的细胞模型的可靠性进行评价,利用PKA重分布实验与LANCE c AMP 384试剂盒检测受体功能。结果 PKA重分布实验与LANCE c AMP 384试剂盒检测结果表明,CHO-PKAcatEGFP/h DOR-3号克隆反应性良好,特异性DOR激动剂SNC80 100 nmol·L-1作用时的Z′平均值为0.615,表明该细胞模型可靠,经多次传代后,细胞中的h DOR在40代以内能保持稳定表达,SNC80可浓度依赖性地激活细胞上的h DOR,其EC50值为(6.192±1.225)×10-9mol·L-1。结论成功建立了h DOR与PKAcatEGFP融合蛋白稳定共表达的细胞模型CHO-PKAcat-EGFP/h DOR-3。
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