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摘 要 组织工程皮肤是目前组织工程领域研究的热点,也是该领域发展最成熟的成果。国外许多组织工程皮肤产品已经被FDA批准进入临床应用。本文就组织工程皮肤的种类及应用进行综述。
关键词 组织工程 皮肤 应用
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.22.009
1987年华盛顿国家科学基金会生物工程会议上首次提出了组织工程的概念,它是指运用工程科学、生命科学的原理和方,法从根本上认识正常和病理的哺乳动物的组织结构-功能关系,并研究生物学替代物以恢复、维持和改进功能。皮肤是人体最大的器官,是机体与外界环境接触的屏障,具有保护、分泌、代谢、感觉等重要功能。然而各种原因造成皮肤缺损常常需要大量的皮肤进行修复。在自体皮源不足的情况下,皮肤替代物的研究就成为组织工程领域的一个热点。而且组织工程皮肤也是组织工程领域发展最成熟的,国外许多产品已经被FDA批准进入临床应用。组织工程皮肤经历了表皮替代物、真皮替代物、全层皮肤替代物的发展过程。
组织工程皮肤种类
表皮替代物:①Epicel:1975年Rheinwaid和Green等利用经致死量照射的3T3成纤维细胞作为滋养层培养人角质形成细胞,角质形成细胞在高Ca2+浓度下培养4周可以连接成片,形态与天然人表皮极为相似,解决了上皮细胞体外传代扩增的难题。随着研究的深入,人工表皮开始应用于临床使用并渐形成商品化的表皮替代物,如Epicel,由美国Genzyme Biosurgery 公司生产。它是分离患者自身的角质形成细胞和鼠细胞共培养所形成的表皮替代物。②EpiDex:是一种新奇的皮肤替代物,是采用患者毛囊外毛根鞘细胞作为种子细胞培养所得的表皮替代物,种子细胞保持了较高的增殖力,种子细胞的增殖力与患者的年龄大小无关。表皮替代物具有供皮面积小、细胞数大量扩增、异体膜片可迅速覆盖创面等优点。但是培养的大多是成熟或比较成熟的细胞,扩增次数有限;培养周期长,费用昂贵;缺乏真皮的机械支持和营养,故耐磨性、弹性差,易挛缩,易自发形成水疱等,限制其在临床的广泛应用。
真皮替代物:①Dermagraf:是由美国的Advanced Tissue Science公司生产的一种真皮替代物。是采用新生儿包皮成纤维细胞种植于聚乳酸、聚羟基乙酸纤维网中,成纤维细胞大量增殖并分泌胶原、纤维连接蛋白、蛋白聚糖、生长因子,形成由成纤维细胞、细胞外基质和可降解生物材料构成的人工真皮。其具有有效减少创面收缩,促进接种其上的表皮细胞膜片黏附、生长;抗胶原酶活性好;对创面要求不高,尤其适用于感染创面的修复;避免使用胶原传播疾病的风险;移植后无免疫反应等优点。但也存在制备中需大量的成纤维细胞;人造真皮的厚度较难调整;相容性差等缺点。②Integra:由Integra Life Science公司开发生产。它是将牛胶原与硫酸软骨素、氨基葡聚糖冷冻干燥制成胶原海绵,戊二醛交联形成,并以薄层硅胶膜覆盖。当移植到创面后,内层胶原海绵相当于真皮,硅胶膜起临时性表皮作用,可防止体液丧失和微生物入侵。2周后揭去硅胶层,再以极薄的自体皮片或培养的自体表皮细胞膜片覆盖。其优点是弹性、韧性好;色素沉着轻;瘢痕形成、挛缩不明显。缺点是所使用的醛类交联剂对组织有毒性;制备所需细胞数较多;对创面要求程度较高;手术成功率低;易皮下积液及诱发感染;而且还需要2次植皮封闭创面。③Alloderm:美国Lifecell公司生产。采用尸体皮或动物皮,通过反复冻融去除细胞,完整保留基底膜和细胞外基质形态结构。可与培养的成纤维细胞和表皮细胞结合构成复合膜片。优点:使用方便,对创面要求低,成活率高;去除细胞成分,大大降低了免疫原性。缺点:缺乏成纤维细胞,移植后患者真皮重建较慢;来源于异体皮肤,来源不广泛,而且有传播感染性疾病的危险;需要2次手术。④transcyte:1997年由加州Lajolla先进组织科学公司生产。将新生儿成纤维细胞在硅橡胶层的尼龙纤维上培养和增殖4～6周,形成一个含有高水平分泌的基质蛋白和大量生长因子的致密细胞组织,将该组织冻存使成纤维细胞失去活力,形成真皮替代物。其具有即刻使用,易于保存等优点。
全层皮肤替代物:①Apligraf:1998年由Organogenesis公司注册生产。将新生儿包皮成纤维细胞接种于牛胶原凝胶中培养2周,形成细胞胶原凝胶,再在其表面接种新生儿角质形成细胞后浸没培养4天,角质形成细胞融合成片,然后进行气液界面培养1～2周。无论从形态、生物化学行为还是在代谢方面均类似于人类正常皮肤,是目前最成熟的既含有表皮层又含有真皮层的双层组织工程皮肤。与之类似的国产全层皮肤是陕西艾尔肤公司与第四军医大学合作生产的Activskin。其优点是制作过程中未使用交联剂,无明显的不良反应;提供了双层皮肤结构,一次手术完成。而缺点是易被胶原酶降解,支架寿命较短;韧性较差,手术操作难。②Orcel:支架由双层胶原基质构成,上层是经包被的胃蛋白酶处理过的无空隙的胶原凝胶,下层是交联的多空隙的牛胶原海绵。将角质形成细胞和成纤维细胞分别接种上、下两层培养形成的人工皮肤。优点是使创面加速愈合,减轻瘢痕形成。但有关临床应用资料较少。
临床应用
烧伤创面的治疗:烧伤创面是运用组织工程皮肤技术最早、最广泛的领域。刘亚玲等[1]采用全层组织工程皮肤Activskin修复创面31例,其中治疗组深Ⅱ°创面25例,愈合时间比对照组提前6天(P<0.05),Ⅲ°创面6例,愈合时间比对照组提前20天(P<0.05)。随访提示Activskin移植后组织相容性好,作为三维结构支架的牛胶原膜在体内可降解,无免疫排斥及局部炎症反应。说明了Activskin是一种具有生物活性、较理想的修复深度创面的新型皮肤代用品。大量的临床病例都说明了对于Ⅱ°以上的烧伤病例,组织工程皮肤对创面修复有很大的帮助,是一种比较理想的治疗方法。
溃疡的治疗:慢性溃疡如静脉溃疡、压力溃疡、糖尿病溃疡、放化疗术后皮肤溃疡等在临床上较难治愈,传统的治疗方法不能获得满意效果。有研究报道运用组织工程皮肤效果较好。Veves等报道了对糖尿病足溃疡的一项多中心、随机、对照、前瞻性研究,治疗组112例用Graftskin治疗,对照组96例用湿纱布治疗,两组都采用同样技术水平的广泛外科清创、足部减压等辅助治疗。治疗12周后,治疗组完全治愈率为56%,对照组为38%,治疗组伤口完全闭合时间是65天,对照组是90天,完全的伤口治愈优势比是2.14。两组不良反应的发生率相似。在一定程度上说明了Graftskin治疗糖尿病足溃疡疗效显著,为此类疾病的治疗提供了一个新的思路。
皮肤病的治疗:组织工程皮肤还可以用于多种皮肤及黏膜疾病的治疗,如巨大先天性黑素细胞痣。临床研究说明了组织工程皮肤疗法安全、有效,为该类疾病临床治疗提供了可供选择的途径。Ozerdem等[18]报道了在临床上用人工皮肤治疗2例皮膚病的效果。1例12岁的男孩因大疱性表皮松解症有广泛的皮肤缺损和左腋挛缩,Apligraf被用于躯干和面部的皮肤缺损治疗并外翻腋挛缩。1年后的追踪调查显示对移植物有较好的接受性,上肢的活动度也明显增加。另1例6岁男孩患有皮神经黑皮症,背部部分色素损害的切除造成大面积皮肤缺损,用Integra进行治疗。1周后皮肤移植物接受性令人满意。以上2例患者都取得了较好的治疗效果。
光化性紫癜又稱老年性紫癜,是由于衰老、暴露部位长期日光照射,皮肤变薄松弛萎缩,皮肤和皮下组织内血管脆性增大而引起的一种紫癜性损害。Meggan等先用手术刀片切除患区薄层皮片,后用有孔Apligaf覆盖创面,并加用敷料包扎。结果愈合良好,移植部位可正常耐受牵拉,美容效果较好。
总之,组织工程皮肤已用于许多难治性皮肤的治疗,给临床提供了新的治疗途径,丰富了皮肤美容手段,值得关注。
基础研究领域的应用
皮肤生理学:组织工程皮肤替代物为皮肤生理学研究提供了模型。通过这个模型,研究者分析了与成纤维细胞分泌细胞外基质有关的真皮重建,进行了细胞间联系通路的研究,应用于对树突状细胞、黑素细胞、Merkel细胞功能及细胞间相互作用等许多方面的研究,阐明了许多皮肤生理现象。
皮肤药理学:组织工程皮肤模型已被用来评估许多药物对皮肤的效果。其原因是:①用于做此类研究的动物皮、人皮比较短缺,而且由于在不同供者之间皮肤存在着多样性,所以缺乏标准,使实验没有可比性;②由于某些实验会给动物带来痛苦,动物保护组织呼声逐渐提高,促进各国相继立法,保护实验动物福利。2002年11月欧盟决定:从2009年起禁止用动物做化妆品测试,于是许多国外研究者构建皮肤模型来做此类研究。国内张兆清等[2]用组织工程皮肤模型来检测10种化学品的皮肤刺激性,结果构建的检测模型能够分辨7种化学品的刺激性。与传统检测方法相比,成本低、可信度高,更符合伦理学要求。
问题和展望
组织工程皮肤已取得较好效果,但目前的人工皮肤仍不具备完整的皮肤结构,尤其是缺乏毛囊、皮脂腺、汗腺等附属结构及功能,也非真正意义上的功能皮肤。理想的皮肤替代物应具备以下条件:具有表皮层和真皮层,真皮层可以快速血管化和神经再分布;真皮层可促进快速的生理性的伤口修复;表皮层可以快速地获得充分的屏障和保护功能;与伤口创面充分一体化[3]。
参考文献
1 刘亚玲,金岩,聂鑫.人组织工程全层活性皮肤在深度烧伤创面的临床应用[J].第四军医大学学报,2004,25(3):224-228.
2 张兆清,金岩,余春艳,等.化学品刺激性组织工程皮肤检测模型的构建[J].中国工业医学杂志,2006,19(2):81-83.
3 Francois AA,Francois B,Veronique M,et al.Tissue-engineered skin substitutes:from in vitro constructs to in vivo applications.Biotechnol.Appl.Biochem,2004,39:263-275.
关键词 组织工程 皮肤 应用
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.22.009
1987年华盛顿国家科学基金会生物工程会议上首次提出了组织工程的概念,它是指运用工程科学、生命科学的原理和方,法从根本上认识正常和病理的哺乳动物的组织结构-功能关系,并研究生物学替代物以恢复、维持和改进功能。皮肤是人体最大的器官,是机体与外界环境接触的屏障,具有保护、分泌、代谢、感觉等重要功能。然而各种原因造成皮肤缺损常常需要大量的皮肤进行修复。在自体皮源不足的情况下,皮肤替代物的研究就成为组织工程领域的一个热点。而且组织工程皮肤也是组织工程领域发展最成熟的,国外许多产品已经被FDA批准进入临床应用。组织工程皮肤经历了表皮替代物、真皮替代物、全层皮肤替代物的发展过程。
组织工程皮肤种类
表皮替代物:①Epicel:1975年Rheinwaid和Green等利用经致死量照射的3T3成纤维细胞作为滋养层培养人角质形成细胞,角质形成细胞在高Ca2+浓度下培养4周可以连接成片,形态与天然人表皮极为相似,解决了上皮细胞体外传代扩增的难题。随着研究的深入,人工表皮开始应用于临床使用并渐形成商品化的表皮替代物,如Epicel,由美国Genzyme Biosurgery 公司生产。它是分离患者自身的角质形成细胞和鼠细胞共培养所形成的表皮替代物。②EpiDex:是一种新奇的皮肤替代物,是采用患者毛囊外毛根鞘细胞作为种子细胞培养所得的表皮替代物,种子细胞保持了较高的增殖力,种子细胞的增殖力与患者的年龄大小无关。表皮替代物具有供皮面积小、细胞数大量扩增、异体膜片可迅速覆盖创面等优点。但是培养的大多是成熟或比较成熟的细胞,扩增次数有限;培养周期长,费用昂贵;缺乏真皮的机械支持和营养,故耐磨性、弹性差,易挛缩,易自发形成水疱等,限制其在临床的广泛应用。
真皮替代物:①Dermagraf:是由美国的Advanced Tissue Science公司生产的一种真皮替代物。是采用新生儿包皮成纤维细胞种植于聚乳酸、聚羟基乙酸纤维网中,成纤维细胞大量增殖并分泌胶原、纤维连接蛋白、蛋白聚糖、生长因子,形成由成纤维细胞、细胞外基质和可降解生物材料构成的人工真皮。其具有有效减少创面收缩,促进接种其上的表皮细胞膜片黏附、生长;抗胶原酶活性好;对创面要求不高,尤其适用于感染创面的修复;避免使用胶原传播疾病的风险;移植后无免疫反应等优点。但也存在制备中需大量的成纤维细胞;人造真皮的厚度较难调整;相容性差等缺点。②Integra:由Integra Life Science公司开发生产。它是将牛胶原与硫酸软骨素、氨基葡聚糖冷冻干燥制成胶原海绵,戊二醛交联形成,并以薄层硅胶膜覆盖。当移植到创面后,内层胶原海绵相当于真皮,硅胶膜起临时性表皮作用,可防止体液丧失和微生物入侵。2周后揭去硅胶层,再以极薄的自体皮片或培养的自体表皮细胞膜片覆盖。其优点是弹性、韧性好;色素沉着轻;瘢痕形成、挛缩不明显。缺点是所使用的醛类交联剂对组织有毒性;制备所需细胞数较多;对创面要求程度较高;手术成功率低;易皮下积液及诱发感染;而且还需要2次植皮封闭创面。③Alloderm:美国Lifecell公司生产。采用尸体皮或动物皮,通过反复冻融去除细胞,完整保留基底膜和细胞外基质形态结构。可与培养的成纤维细胞和表皮细胞结合构成复合膜片。优点:使用方便,对创面要求低,成活率高;去除细胞成分,大大降低了免疫原性。缺点:缺乏成纤维细胞,移植后患者真皮重建较慢;来源于异体皮肤,来源不广泛,而且有传播感染性疾病的危险;需要2次手术。④transcyte:1997年由加州Lajolla先进组织科学公司生产。将新生儿成纤维细胞在硅橡胶层的尼龙纤维上培养和增殖4～6周,形成一个含有高水平分泌的基质蛋白和大量生长因子的致密细胞组织,将该组织冻存使成纤维细胞失去活力,形成真皮替代物。其具有即刻使用,易于保存等优点。
全层皮肤替代物:①Apligraf:1998年由Organogenesis公司注册生产。将新生儿包皮成纤维细胞接种于牛胶原凝胶中培养2周,形成细胞胶原凝胶,再在其表面接种新生儿角质形成细胞后浸没培养4天,角质形成细胞融合成片,然后进行气液界面培养1～2周。无论从形态、生物化学行为还是在代谢方面均类似于人类正常皮肤,是目前最成熟的既含有表皮层又含有真皮层的双层组织工程皮肤。与之类似的国产全层皮肤是陕西艾尔肤公司与第四军医大学合作生产的Activskin。其优点是制作过程中未使用交联剂,无明显的不良反应;提供了双层皮肤结构,一次手术完成。而缺点是易被胶原酶降解,支架寿命较短;韧性较差,手术操作难。②Orcel:支架由双层胶原基质构成,上层是经包被的胃蛋白酶处理过的无空隙的胶原凝胶,下层是交联的多空隙的牛胶原海绵。将角质形成细胞和成纤维细胞分别接种上、下两层培养形成的人工皮肤。优点是使创面加速愈合,减轻瘢痕形成。但有关临床应用资料较少。
临床应用
烧伤创面的治疗:烧伤创面是运用组织工程皮肤技术最早、最广泛的领域。刘亚玲等[1]采用全层组织工程皮肤Activskin修复创面31例,其中治疗组深Ⅱ°创面25例,愈合时间比对照组提前6天(P<0.05),Ⅲ°创面6例,愈合时间比对照组提前20天(P<0.05)。随访提示Activskin移植后组织相容性好,作为三维结构支架的牛胶原膜在体内可降解,无免疫排斥及局部炎症反应。说明了Activskin是一种具有生物活性、较理想的修复深度创面的新型皮肤代用品。大量的临床病例都说明了对于Ⅱ°以上的烧伤病例,组织工程皮肤对创面修复有很大的帮助,是一种比较理想的治疗方法。
溃疡的治疗:慢性溃疡如静脉溃疡、压力溃疡、糖尿病溃疡、放化疗术后皮肤溃疡等在临床上较难治愈,传统的治疗方法不能获得满意效果。有研究报道运用组织工程皮肤效果较好。Veves等报道了对糖尿病足溃疡的一项多中心、随机、对照、前瞻性研究,治疗组112例用Graftskin治疗,对照组96例用湿纱布治疗,两组都采用同样技术水平的广泛外科清创、足部减压等辅助治疗。治疗12周后,治疗组完全治愈率为56%,对照组为38%,治疗组伤口完全闭合时间是65天,对照组是90天,完全的伤口治愈优势比是2.14。两组不良反应的发生率相似。在一定程度上说明了Graftskin治疗糖尿病足溃疡疗效显著,为此类疾病的治疗提供了一个新的思路。
皮肤病的治疗:组织工程皮肤还可以用于多种皮肤及黏膜疾病的治疗,如巨大先天性黑素细胞痣。临床研究说明了组织工程皮肤疗法安全、有效,为该类疾病临床治疗提供了可供选择的途径。Ozerdem等[18]报道了在临床上用人工皮肤治疗2例皮膚病的效果。1例12岁的男孩因大疱性表皮松解症有广泛的皮肤缺损和左腋挛缩,Apligraf被用于躯干和面部的皮肤缺损治疗并外翻腋挛缩。1年后的追踪调查显示对移植物有较好的接受性,上肢的活动度也明显增加。另1例6岁男孩患有皮神经黑皮症,背部部分色素损害的切除造成大面积皮肤缺损,用Integra进行治疗。1周后皮肤移植物接受性令人满意。以上2例患者都取得了较好的治疗效果。
光化性紫癜又稱老年性紫癜,是由于衰老、暴露部位长期日光照射,皮肤变薄松弛萎缩,皮肤和皮下组织内血管脆性增大而引起的一种紫癜性损害。Meggan等先用手术刀片切除患区薄层皮片,后用有孔Apligaf覆盖创面,并加用敷料包扎。结果愈合良好,移植部位可正常耐受牵拉,美容效果较好。
总之,组织工程皮肤已用于许多难治性皮肤的治疗,给临床提供了新的治疗途径,丰富了皮肤美容手段,值得关注。
基础研究领域的应用
皮肤生理学:组织工程皮肤替代物为皮肤生理学研究提供了模型。通过这个模型,研究者分析了与成纤维细胞分泌细胞外基质有关的真皮重建,进行了细胞间联系通路的研究,应用于对树突状细胞、黑素细胞、Merkel细胞功能及细胞间相互作用等许多方面的研究,阐明了许多皮肤生理现象。
皮肤药理学:组织工程皮肤模型已被用来评估许多药物对皮肤的效果。其原因是:①用于做此类研究的动物皮、人皮比较短缺,而且由于在不同供者之间皮肤存在着多样性,所以缺乏标准,使实验没有可比性;②由于某些实验会给动物带来痛苦,动物保护组织呼声逐渐提高,促进各国相继立法,保护实验动物福利。2002年11月欧盟决定:从2009年起禁止用动物做化妆品测试,于是许多国外研究者构建皮肤模型来做此类研究。国内张兆清等[2]用组织工程皮肤模型来检测10种化学品的皮肤刺激性,结果构建的检测模型能够分辨7种化学品的刺激性。与传统检测方法相比,成本低、可信度高,更符合伦理学要求。
问题和展望
组织工程皮肤已取得较好效果,但目前的人工皮肤仍不具备完整的皮肤结构,尤其是缺乏毛囊、皮脂腺、汗腺等附属结构及功能,也非真正意义上的功能皮肤。理想的皮肤替代物应具备以下条件:具有表皮层和真皮层,真皮层可以快速血管化和神经再分布;真皮层可促进快速的生理性的伤口修复;表皮层可以快速地获得充分的屏障和保护功能;与伤口创面充分一体化[3]。
参考文献
1 刘亚玲,金岩,聂鑫.人组织工程全层活性皮肤在深度烧伤创面的临床应用[J].第四军医大学学报,2004,25(3):224-228.
2 张兆清,金岩,余春艳,等.化学品刺激性组织工程皮肤检测模型的构建[J].中国工业医学杂志,2006,19(2):81-83.
3 Francois AA,Francois B,Veronique M,et al.Tissue-engineered skin substitutes:from in vitro constructs to in vivo applications.Biotechnol.Appl.Biochem,2004,39:263-275.