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（西南交通大学 药学院，四川 峨眉山 614202）
摘 要：目的：探讨抗瘤胶囊抗小鼠实验性肝癌的作用和机理，为进一步研究开发抗肝癌中药新药奠定良好的实验和理论基础。方法：抗瘤胶囊由仙鹤草、山豆根提取物按一定处方比例配比组成。建立小鼠肝癌（H22）动物移植肿瘤模型，随机将小鼠分为正常组、模型组、阳性组、药物小、中、大剂量组并分别给药。实验结束后，进行抑瘤率、胸腺指数、脾指数、肿瘤组织病理等相关指标检测。结果：抗瘤胶囊各组对荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用，低、中、高剂量组的抑瘤率分别为32.11%、41.58%和45.26%，呈现良好的量效关系。病理学观察显示，模型组肿瘤细胞生长旺盛，而各用药组则出现不同程度的肿瘤细胞坏死，但各组胸腺指数和脾指数经统计学处理没有显著性差异。结论：抗瘤胶囊对小鼠肝癌（H22）动物肝癌模型有明显的抑瘤作用，但在提高机体免疫功能方面的作用还有待进一步研究。
关键词：抗瘤胶囊；肝癌（H22）动物肿瘤模型；抑瘤率
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）10-0023-03
原发性肝癌(下称肝癌)为我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第三位，仅次于胃癌和食管癌［1］。近年来，通过大量的临床及实验研究，中医中药对肝癌的疗效正日益受到人们的肯定和重视，其作用机理与直接杀伤或抑制肝癌细胞、保护和调节机体免疫功能、抑制癌前病变、破坏或抑制癌细胞遗传物质合成、诱导癌细胞凋亡及调控癌基因表达等因素有关［2］。
本研究对2005年版《中国药典》收载的仙鹤草（Agrimonia pilosa Ledeb）和山豆根（Sophora tonkinensis Gagnep）进行研究，进一步了解其疗效和探讨其作用机制，并为研究开发抗肿瘤中药新药奠定良好的实验和理论基础。本研究采用小鼠肝癌（H22）动物肿瘤模型，以抑瘤率、胸腺指数、脾指数和肿瘤组织的病理学观察为检测指标，探讨抗瘤胶囊抗肝癌作用及其相关机理。
1 材料
1.1 动物
昆明种封闭群一级小白鼠60只，雌雄各半，体重20±3g，乐山长征制药厂提供。
1.2 瘤株
小鼠移植性肝癌（H22）瘤株：由四川大学华西医学中心免疫实验室提供。1.3 药物
替加氟片：上海医药（集团）有限公司华联制药厂生产，批号：060601，用蒸馏水配成8.33mg/mL的实验用液，密封置4℃冰箱中冷藏备用。
抗瘤胶囊：乙醇浸提仙鹤草，加热回流提取山豆根等药，提取后分别浓缩成1∶1浓缩液，然后按一定处方比例进行适当配比。仙鹤草、山豆根均购于成都荷花池药材市场，经西南交通大学药学院宋良科副教授鉴定。
2 方法
2.1 肝癌动物模型建立及分组
无菌操作，取荷肝癌（H22）小鼠腹水，用0.9%的生理盐水稀释到含瘤细胞1×107/mL，每只鼠左腋皮下接种0.2mL，并将接种过的小鼠随机分为荷瘤模型组、阳性对照组、药物小剂量组、中剂量组、大剂量组，另设未接种瘤细胞的正常组共6组，每组10只，雌雄各半。
2.2 用药方法
小鼠接种瘤细胞24h后开始给药。正常对照组和模型对照组每天灌服纯净水0.5mL/只；阳性对照组每天灌胃替加氟片溶液（8.33mg/mL）0.5mL/只；三个抗瘤胶囊治疗组灌胃不同剂量实验用药，皆为每天0.5mL/只，qd，连续给药10d。
2.3 标本的采集、制备
停药次日，处死小鼠，解剖并完整剥离肿瘤组织，用电子天平称瘤重计算抑瘤率，并将肿瘤组织浸泡在10%甲醛溶液中，进行石蜡包埋、切片、HE染色，以作显微镜下病理学观察。同时胸腺和脾脏进行解剖后称重，以计算各组的胸腺指数和脾指数。
2.4 检测指标
2.4.1 抑瘤率测定
计算方法：抑瘤率（%）=（1-T/C）×100%（T/C：治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重）
2.4.2 胸腺指数及脾指数的测定
胸腺指数=胸腺重量（mg）/体重（g）；脾指数=脾重（mg）/体重（g）
2.4.3 肿瘤组织病理学检查
采用石蜡切片法。病理标本固定后，进行取材、脱水、浸蜡、包埋、切片和染色。
2.5 统计
将各组数据进行方差分析后采用t检验，检验方法采用SPSS13.0统计软件计算。
3 结果
3.1 对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用
见表1。
表1 对肿瘤生长的抑制作用
注：与模型对照组相比：△△示P<0.01
表1表明，抗瘤胶囊对荷肝癌（H22）小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用，低、中、高三个剂量组的平均瘤重均显著低于模型组（P<0.01），抑瘤率分别为32.11%、41.58%和45.26%，且实验用药组的抑瘤率均明显高于阳性对照组。
3.2 对荷瘤小鼠胸腺指数及脾指数的影响
3.2.1 对荷瘤小鼠胸腺指数的影响
见表2。
表2表明，各组小鼠胸腺重及胸腺指数经统计学处理没有显著性差异（P>0.05）。
3.2.2 对荷瘤小鼠脾指数的影响
见表3。
表3 对脾重及脾指数的影响（ ±s）
表3表明，各组小鼠脾重及脾指数经统计学处理没有显著性差异（P>0.05）。
3.3 对荷瘤小鼠肿瘤组织病理观察
肿瘤组织的大小一般在2~3cm之间，呈半球形或不规则状，颜色为灰白色，其中有许多白色斑点，硬度和一般的软组织相当，组织切面呈蜂巢状。
显微镜下，各组肿瘤细胞表现如下：
①模型对照组：肿瘤细胞呈团簇状密集、旺盛生长，排列紧实，形态各异，异型性明显（附图1、附图2）。
图1 模型对照组（HE 400×）
图2 模型对照组（HE 100×）
②阳性对照组：肿瘤细胞生长旺盛，可见有部分浅染的细胞坏死（附图3）。③抗瘤胶囊各组：可见大面积浅染肿瘤细胞的坏死区（附图4、5、6）。
图3 阳性对照组（HE 100×）
图4 药物低剂量组（HE 100×）
图5 药物中剂量组（HE 100×）
图6 药物高剂量组（HE 100×）
4 讨论
仙鹤草为蔷薇科多年生草本植物龙牙草的全草，其性微甘、平，味苦、涩，临床上主要用于各种血症及痢疾等。现代中医药研究发现，仙鹤草还具有较强的抗癌功效。仙鹤草拥有极为复杂的化学成分［3］，主要有仙鹤草酚、挥发油、微量元素、仙鹤草素、仙鹤草内酯、鞣质、甾醇、有机酸、酚类化合物、黄酮类和糖苷类等化合物，其中鞣质类化合物有重要的抗癌活性［4］;山豆根为豆科蔓生性矮小灌木植物越南槐的干燥根及根茎，味苦，性寒，归肺、胃经，具有清热解毒、利咽消肿的功效，近年来用于早期肺癌、喉癌、膀胱癌等均有一定的疗效。山豆根化学成份主要有生物碱、多糖、黄酮等，其中具抗肿瘤活性的主要是山豆根的总生物碱，包括氧化苦参碱、苦参碱、金雀花碱、槐果碱等［5］。
本实验用药抗瘤胶囊主要由仙鹤草、山豆根等中药组成。从对肿瘤生长的实验结果来看，抗瘤胶囊低、中、高三个剂量组的平均瘤重均显著低于模型组（P<0.01），抑瘤率分别为32.11%、41.58%和45.26%，呈良好的量效关系，且所用实验用药组的抑瘤率均明显高于阳性对照组，表明抗瘤胶囊对荷肝癌（H22）小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用。
肿瘤组织病理结果显示，模型对照组肿瘤细胞呈团簇状密集、旺盛生长，而各用药组可见有部分浅染的肿瘤细胞坏死，尤其是抗瘤胶囊各组可见大面积浅染肿瘤细胞的坏死区，表明抗瘤胶囊对肿瘤细胞有直接杀伤作用。
从荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数上看，各组经统计学处理没有显著性差异，但总的来说，用药组的胸腺指数和脾指数都有减小的趋势。这可能和仙鹤草用量和山豆根的毒性有关，由此，关于本处方药物之间的配比比例，有待在进一步研究中继续优化，从而使抗瘤胶囊在杀灭肿瘤细胞和提高机体自身免疫功能两个方面都发挥出良好的功效。
参考文献：
［1］ 刘厚钰.原发性肝癌［M］.北京：人民卫生出版社，2005：450.
［2］ 蒋时红，周宜强.中医药防治肝癌机理及实验研究［J］.中国中医基础医学，2003，9(4)：309-311.
［3］ 赵莹，刘金平，李平亚.仙鹤草化学成分及药理研究进展［J］.特产研究，2001（1）：50-53.
［4］ 丁维俊，张天娥，王宇，等.仙鹤草抗癌活性成分及机理探讨［J］.辽宁中医，2006，33(2)：251-252.
［5］ 姚仲青，朱虹，王光凤.山豆根总生物碱抗肿瘤作用的初步研究［J］.南京中医药大学学报，2005，21(4)：253-254.
（责任编辑：姜付平）
摘 要：目的：探讨抗瘤胶囊抗小鼠实验性肝癌的作用和机理，为进一步研究开发抗肝癌中药新药奠定良好的实验和理论基础。方法：抗瘤胶囊由仙鹤草、山豆根提取物按一定处方比例配比组成。建立小鼠肝癌（H22）动物移植肿瘤模型，随机将小鼠分为正常组、模型组、阳性组、药物小、中、大剂量组并分别给药。实验结束后，进行抑瘤率、胸腺指数、脾指数、肿瘤组织病理等相关指标检测。结果：抗瘤胶囊各组对荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用，低、中、高剂量组的抑瘤率分别为32.11%、41.58%和45.26%，呈现良好的量效关系。病理学观察显示，模型组肿瘤细胞生长旺盛，而各用药组则出现不同程度的肿瘤细胞坏死，但各组胸腺指数和脾指数经统计学处理没有显著性差异。结论：抗瘤胶囊对小鼠肝癌（H22）动物肝癌模型有明显的抑瘤作用，但在提高机体免疫功能方面的作用还有待进一步研究。
关键词：抗瘤胶囊；肝癌（H22）动物肿瘤模型；抑瘤率
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）10-0023-03
原发性肝癌(下称肝癌)为我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第三位，仅次于胃癌和食管癌［1］。近年来，通过大量的临床及实验研究，中医中药对肝癌的疗效正日益受到人们的肯定和重视，其作用机理与直接杀伤或抑制肝癌细胞、保护和调节机体免疫功能、抑制癌前病变、破坏或抑制癌细胞遗传物质合成、诱导癌细胞凋亡及调控癌基因表达等因素有关［2］。
本研究对2005年版《中国药典》收载的仙鹤草（Agrimonia pilosa Ledeb）和山豆根（Sophora tonkinensis Gagnep）进行研究，进一步了解其疗效和探讨其作用机制，并为研究开发抗肿瘤中药新药奠定良好的实验和理论基础。本研究采用小鼠肝癌（H22）动物肿瘤模型，以抑瘤率、胸腺指数、脾指数和肿瘤组织的病理学观察为检测指标，探讨抗瘤胶囊抗肝癌作用及其相关机理。
1 材料
1.1 动物
昆明种封闭群一级小白鼠60只，雌雄各半，体重20±3g，乐山长征制药厂提供。
1.2 瘤株
小鼠移植性肝癌（H22）瘤株：由四川大学华西医学中心免疫实验室提供。1.3 药物
替加氟片：上海医药（集团）有限公司华联制药厂生产，批号：060601，用蒸馏水配成8.33mg/mL的实验用液，密封置4℃冰箱中冷藏备用。
抗瘤胶囊：乙醇浸提仙鹤草，加热回流提取山豆根等药，提取后分别浓缩成1∶1浓缩液，然后按一定处方比例进行适当配比。仙鹤草、山豆根均购于成都荷花池药材市场，经西南交通大学药学院宋良科副教授鉴定。
2 方法
2.1 肝癌动物模型建立及分组
无菌操作，取荷肝癌（H22）小鼠腹水，用0.9%的生理盐水稀释到含瘤细胞1×107/mL，每只鼠左腋皮下接种0.2mL，并将接种过的小鼠随机分为荷瘤模型组、阳性对照组、药物小剂量组、中剂量组、大剂量组，另设未接种瘤细胞的正常组共6组，每组10只，雌雄各半。
2.2 用药方法
小鼠接种瘤细胞24h后开始给药。正常对照组和模型对照组每天灌服纯净水0.5mL/只；阳性对照组每天灌胃替加氟片溶液（8.33mg/mL）0.5mL/只；三个抗瘤胶囊治疗组灌胃不同剂量实验用药，皆为每天0.5mL/只，qd，连续给药10d。
2.3 标本的采集、制备
停药次日，处死小鼠，解剖并完整剥离肿瘤组织，用电子天平称瘤重计算抑瘤率，并将肿瘤组织浸泡在10%甲醛溶液中，进行石蜡包埋、切片、HE染色，以作显微镜下病理学观察。同时胸腺和脾脏进行解剖后称重，以计算各组的胸腺指数和脾指数。
2.4 检测指标
2.4.1 抑瘤率测定
计算方法：抑瘤率（%）=（1-T/C）×100%（T/C：治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重）
2.4.2 胸腺指数及脾指数的测定
胸腺指数=胸腺重量（mg）/体重（g）；脾指数=脾重（mg）/体重（g）
2.4.3 肿瘤组织病理学检查
采用石蜡切片法。病理标本固定后，进行取材、脱水、浸蜡、包埋、切片和染色。
2.5 统计
将各组数据进行方差分析后采用t检验，检验方法采用SPSS13.0统计软件计算。
3 结果
3.1 对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用
见表1。
表1 对肿瘤生长的抑制作用
注：与模型对照组相比：△△示P<0.01
表1表明，抗瘤胶囊对荷肝癌（H22）小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用，低、中、高三个剂量组的平均瘤重均显著低于模型组（P<0.01），抑瘤率分别为32.11%、41.58%和45.26%，且实验用药组的抑瘤率均明显高于阳性对照组。
3.2 对荷瘤小鼠胸腺指数及脾指数的影响
3.2.1 对荷瘤小鼠胸腺指数的影响
见表2。
表2表明，各组小鼠胸腺重及胸腺指数经统计学处理没有显著性差异（P>0.05）。
3.2.2 对荷瘤小鼠脾指数的影响
见表3。
表3 对脾重及脾指数的影响（ ±s）
表3表明，各组小鼠脾重及脾指数经统计学处理没有显著性差异（P>0.05）。
3.3 对荷瘤小鼠肿瘤组织病理观察
肿瘤组织的大小一般在2~3cm之间，呈半球形或不规则状，颜色为灰白色，其中有许多白色斑点，硬度和一般的软组织相当，组织切面呈蜂巢状。
显微镜下，各组肿瘤细胞表现如下：
①模型对照组：肿瘤细胞呈团簇状密集、旺盛生长，排列紧实，形态各异，异型性明显（附图1、附图2）。
图1 模型对照组（HE 400×）
图2 模型对照组（HE 100×）
②阳性对照组：肿瘤细胞生长旺盛，可见有部分浅染的细胞坏死（附图3）。③抗瘤胶囊各组：可见大面积浅染肿瘤细胞的坏死区（附图4、5、6）。
图3 阳性对照组（HE 100×）
图4 药物低剂量组（HE 100×）
图5 药物中剂量组（HE 100×）
图6 药物高剂量组（HE 100×）
4 讨论
仙鹤草为蔷薇科多年生草本植物龙牙草的全草，其性微甘、平，味苦、涩，临床上主要用于各种血症及痢疾等。现代中医药研究发现，仙鹤草还具有较强的抗癌功效。仙鹤草拥有极为复杂的化学成分［3］，主要有仙鹤草酚、挥发油、微量元素、仙鹤草素、仙鹤草内酯、鞣质、甾醇、有机酸、酚类化合物、黄酮类和糖苷类等化合物，其中鞣质类化合物有重要的抗癌活性［4］;山豆根为豆科蔓生性矮小灌木植物越南槐的干燥根及根茎，味苦，性寒，归肺、胃经，具有清热解毒、利咽消肿的功效，近年来用于早期肺癌、喉癌、膀胱癌等均有一定的疗效。山豆根化学成份主要有生物碱、多糖、黄酮等，其中具抗肿瘤活性的主要是山豆根的总生物碱，包括氧化苦参碱、苦参碱、金雀花碱、槐果碱等［5］。
本实验用药抗瘤胶囊主要由仙鹤草、山豆根等中药组成。从对肿瘤生长的实验结果来看，抗瘤胶囊低、中、高三个剂量组的平均瘤重均显著低于模型组（P<0.01），抑瘤率分别为32.11%、41.58%和45.26%，呈良好的量效关系，且所用实验用药组的抑瘤率均明显高于阳性对照组，表明抗瘤胶囊对荷肝癌（H22）小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用。
肿瘤组织病理结果显示，模型对照组肿瘤细胞呈团簇状密集、旺盛生长，而各用药组可见有部分浅染的肿瘤细胞坏死，尤其是抗瘤胶囊各组可见大面积浅染肿瘤细胞的坏死区，表明抗瘤胶囊对肿瘤细胞有直接杀伤作用。
从荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数上看，各组经统计学处理没有显著性差异，但总的来说，用药组的胸腺指数和脾指数都有减小的趋势。这可能和仙鹤草用量和山豆根的毒性有关，由此，关于本处方药物之间的配比比例，有待在进一步研究中继续优化，从而使抗瘤胶囊在杀灭肿瘤细胞和提高机体自身免疫功能两个方面都发挥出良好的功效。
参考文献：
［1］ 刘厚钰.原发性肝癌［M］.北京：人民卫生出版社，2005：450.
［2］ 蒋时红，周宜强.中医药防治肝癌机理及实验研究［J］.中国中医基础医学，2003，9(4)：309-311.
［3］ 赵莹，刘金平，李平亚.仙鹤草化学成分及药理研究进展［J］.特产研究，2001（1）：50-53.
［4］ 丁维俊，张天娥，王宇，等.仙鹤草抗癌活性成分及机理探讨［J］.辽宁中医，2006，33(2)：251-252.
［5］ 姚仲青，朱虹，王光凤.山豆根总生物碱抗肿瘤作用的初步研究［J］.南京中医药大学学报，2005，21(4)：253-254.
（责任编辑：姜付平）