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摘要：以银杏果肉质外种皮为原料、总黄酮含量为指标，采用冷凝回流法和超声波法提取，分别以料液比、乙醇浓度、提取温度和超声波功率、工作时长、超声时长为试验单因素，确定影响提取效果的因素及其水平，通过正交法优化，确定最佳提取工艺。采用还原力与清除羟自由基、超氧阴离子自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力对总黄酮进行抗氧化活性的评价。结果表明，当超声波功率为75 W、液料比为6 mL ∶ 1 g、乙醇浓度为70%、提取温度为60 ℃、工作总时长为1 080 s、工作时长为3s/次和间隙时长为10 s/次时，银杏外种皮的总黄酮提取率最高，为221%。研究还发现，银杏果外种皮总黄酮具有良好的抗氧化活性。
关键词：银杏;外种皮;总黄酮;抗氧化活性;提取工艺
银杏（Ginkgo biloba L.）为银杏科银杏属仅有的植物，素有植物“活化石”之称，在民间常用作中草药。银杏果实、叶片和树皮均有很高的药食价值，主要含有黄酮类、内酯类、有机酚酸类、聚戊烯醇类、多糖类等生物活性物质，其中黄酮类和内酯类是主要药用成分[1-4]。目前，银杏的药用成分在临床上主要用于治疗心脑血管疾病、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗炎、降低血液黏度、降血脂、提高机体免疫力等方面[4-8]，因而受到广泛关注，具有广阔的市场前景。银杏果外种皮是银杏种子（白果）硬壳外的肉质部分，俗称白果衣胞。我国在生产银杏种核时，每年约产生4.8万t外种皮，且常常被作为废弃物丢弃于环境中，既浪费了资源，又造成了严重的环境污染。近年来的研究发现，银杏外种皮含有多糖、酚酸、黄酮、萜内酯等多种化合物，具有较高的药用价值[9]，因此，加大对银杏外种皮的开发利用，可以节约有限的生物资源，减轻环境污染。
本研究采用冷凝回流提取法和超声波法提取银杏果外种皮总黄酮，以提取率为评价指标，在单因素试验的基础上采用正交试验优化提取工艺，并明确该总黄酮的抗氧化活性。
1 材料与仪器
1.1 试验材料
银杏果于2019年10月采自鹽城师范学院校园内，去核后于-80 ℃冰箱中冻存备用。
1.2 试验试剂
主要试剂：芸香苷标准品，购自上海佳和生物科技有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸铝（AlNO3）、氢氧化钠（NaOH）、1，10-菲咯啉、亚硫酸铁（FeSO4）、H2O2、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、L-蛋氨酸（L-Met）、乙二氨四乙酸二钠（EDTA-Na2）、核黄素（VB2）、铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）、三氯乙酸、三氯化铁（FeCl3）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、甲醇、乙醇、石油醚等其他试剂均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3 试验仪器
电子天平，购自ME204E 瑞士梅特勒公司;匀浆机[AD145S-P（8G/10G）]，购自上海昂尼公司;索氏抽提器（SXT-06型），购自上海洪纪仪器有限公司;超声波破碎仪（VCX150PB），购自美国SONICS公司;旋转蒸发仪（R-210型），购自瑞士Buchi公司;真空冷冻干燥机（Labconco立式18），购自美国Labconco公司;紫外可见分光光度计（UV-2100型），购自尤尼可上海仪器有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1 银杏果外种皮的预处理 摘取银杏果，去除果蒂后，清洗、自然风干表皮水分，剔除果核并匀浆，再用2倍量石油醚混合，用50 ℃回流法去除脂溶性物质，剩余滤渣备用。
1.4.2 银杏果外种皮总黄酮的提取
1.4.2.1 冷凝回流法 将10 g银杏果外种皮经过匀浆和脱脂后，加入不同浓度和体积的乙醇溶液，并将冷凝回流提取器于不同温度提取3 h后取出，冷却，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清，用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，定容至 100 mL，4 ℃保存，用于总黄酮含量的测定。根据上述单因素试验结果，用正交试验法对其工艺参数进行进一步优化，以明确该提取方法的最佳技术参数。
1.4.2.2 超声波法 将10 g银杏果外种皮经匀浆和脱脂后，按1 g ∶ 5 mL的料液比与70%乙醇溶液混合，经不同功率超声波作用不同时间后取出，于 4 ℃、5 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清，用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，定容至100 mL，于 4 ℃ 保存，用于总黄酮含量的测定。根据上述单因素试验结果，采用正交试验法对其工艺参数进行进一步优化，以明确该提取方法的最佳技术参数。
1.4.3 总黄酮的测定 称取芸香苷标准品 5.00 mg，加水溶解后定容于50 mL容量瓶内，得100 mg/L芸香苷标准溶液。分别移取2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL芸香苷标准溶液于25.00 mL容量瓶内，定容得浓度梯度标准液的稀释液。取 1 mL 梯度稀释液和4.00 mL 30%乙醇溶液混合，再加入0.40 mL 5% NaNO2，摇匀静置6 min，加入040 mL 10% AlNO3显色剂，摇匀静置10 min，再加入4% NaOH，摇匀静置15 min，以不添加芸香苷的标准溶液作为空白对照，于波长510 nm处测定吸光度。以标准溶液浓度为横坐标、以吸光度为纵坐标建立回归方程。按上述方法测定银杏果外种皮提取液的吸光度，根据回归方程计算总黄酮含量。
1.4.4 银杏果外种皮总黄酮的抗氧化活性
1.4.4.1 还原力 按照Oyaizu的方法测定还原力[10]。取不同浓度的0.25 mL样品，依次加pH值为6.6的0.2 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）和1% K3[Fe（CN）6]各2.5 mL，充分混匀后于50 ℃恒温水浴20 min，取出后再加入2.5 mL 10%三氯乙酸混匀，10 000 r/min离心10 min。取5.0 mL上清液，依次加入5.0 mL H2O、1.0 mL 0.1% FeCl3，于 700 nm 处测定吸光度。 1.4.4.2 清除羟自由基 采用邻二氮菲-Fe2 氧化法测定清除羟自由基的能力，具体步骤参照Jin等的方法[11]，并略有改动。（1）依次取1 mL 0.75 mol/L 邻二氮菲、2 mL 0.2 mmol/L pH值为74的PBS和1 mL ddH2O，充分混匀，再加1 mL 075 mmol/L FeSO4，混匀后加入1 mL 0.01% H2O2，于37 ℃恒温水浴60 min，在波长536 nm处测定吸光度（Df）。步骤（2）与步骤（1）相同，仅H2O代替H2O2，吸光度记作D0。步骤（3）与步骤（1）相同，仅样品代替ddH2O，吸光度记作Dx。步骤（4）与步骤（1）相同，仅样品代替H2O2，吸光度记作Ds。清除羟自由基活性计算方法为：
1.4.4.3 清除超氧阴离子自由基 采用氯化硝基四氮唑蓝光还原法测定清除超氧阴离子自由基的能力，具体步骤见Duan等的方法[12]，并略有改动。取5 mL含有15.6 mmol/L L-Met、0.112 5 mmol/L NBT、0.3 mmol/L EDTA-Na2和pH值为7.8的005 mol/L PBS反应混合液，对照组加入0.5 mL ddH2O，样品本底吸收校正组和试验组各加0.5 mL不同浓度的总黄酮提取液，3种试验组再加1 mL VB2后，将调零组和校正组立即置于暗处，试验组于25 ℃照光15 min后，立即遮光，在波长560 nm处测定吸光度。清除超氧阴离子活性按下式计算：
1.4.4.4 清除DPPH自由基 具体参照Manivasagan等的方法并略有改动[13]。将0.2 mL不同浓度的样品与5 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液混合，在室温下遮光反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度（D）;以0.2 mL ddH2O代替样品作为空白对照（D′），以甲醇代替含有DPPH的甲醇溶液作为样品本底吸收校正（Dj）。清除二苯代苦味酰基自由基活性按下式计算：
2 结果与分析
2.1 冷凝回流法提取率的影响因素及其水平的確定
2.1.1 液料比对提取率的影响 由图1可知，在乙醇浓度为70%、提取温度为60 ℃、提取时间为3 h和液料比为1～5 mL ∶ 1 g的条件下，随着液料比的增加，银杏外种皮总黄酮提取率逐渐提高;当液料比从1 mL ∶ 1 g增加到2 mL ∶ 1 g时，提取率线性提高;当液料比从4 mL ∶ 1 g增加到 5 mL ∶ 1 g 时，提取率从1.22%提高到1.45%，变化平缓，仅增加023百分点。因此，综合提取效率，选择4 mL ∶ 1 g、 5 mL ∶ 1 g和6 mL ∶ 1 g等3个液料比水平进行正交试验。
2.1.2 温度对提取率的影响 如图2所示，在提取时长为3 h、液料比为5 mL ∶ 1 g、乙醇浓度为70%、温度为30～70 ℃的条件下，随着提取温度逐渐提高，总黄酮提取率呈先升高后降低的趋势;当提取温度为60 ℃时，总黄酮提取率最高，为1.49%。因此，选择50、60、70 ℃这3个温度水平进一步进行正交试验。
2.1.3 乙醇浓度对提取率的影响 如图3所示，在提取温度为60 ℃、提取时间为3 h、液料比为 5 mL ∶ 1 g 和乙醇浓度为60%～100%的条件下，随着乙醇浓度的提高，总黄酮提取率呈先升高后降低的趋势。当乙醇浓度为80%时，总黄酮提取率最高，为1.73%。因此，选择70%、80%、90% 3个水平的乙醇浓度进一步进行正交试验。
2.1.4 正交优化 冷凝回流法正交试验因素与水平设计见表1，正交试验结果见表2。由极差大小可知，3个因素对提取率的影响程度依次为液料比（C）>乙醇浓度（A）>温度（B）。均值代表了每个因素的最佳水平条件，对同一因素的3个水平进行比较可知：A1
关键词：银杏;外种皮;总黄酮;抗氧化活性;提取工艺
银杏（Ginkgo biloba L.）为银杏科银杏属仅有的植物，素有植物“活化石”之称，在民间常用作中草药。银杏果实、叶片和树皮均有很高的药食价值，主要含有黄酮类、内酯类、有机酚酸类、聚戊烯醇类、多糖类等生物活性物质，其中黄酮类和内酯类是主要药用成分[1-4]。目前，银杏的药用成分在临床上主要用于治疗心脑血管疾病、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗炎、降低血液黏度、降血脂、提高机体免疫力等方面[4-8]，因而受到广泛关注，具有广阔的市场前景。银杏果外种皮是银杏种子（白果）硬壳外的肉质部分，俗称白果衣胞。我国在生产银杏种核时，每年约产生4.8万t外种皮，且常常被作为废弃物丢弃于环境中，既浪费了资源，又造成了严重的环境污染。近年来的研究发现，银杏外种皮含有多糖、酚酸、黄酮、萜内酯等多种化合物，具有较高的药用价值[9]，因此，加大对银杏外种皮的开发利用，可以节约有限的生物资源，减轻环境污染。
本研究采用冷凝回流提取法和超声波法提取银杏果外种皮总黄酮，以提取率为评价指标，在单因素试验的基础上采用正交试验优化提取工艺，并明确该总黄酮的抗氧化活性。
1 材料与仪器
1.1 试验材料
银杏果于2019年10月采自鹽城师范学院校园内，去核后于-80 ℃冰箱中冻存备用。
1.2 试验试剂
主要试剂：芸香苷标准品，购自上海佳和生物科技有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸铝（AlNO3）、氢氧化钠（NaOH）、1，10-菲咯啉、亚硫酸铁（FeSO4）、H2O2、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、L-蛋氨酸（L-Met）、乙二氨四乙酸二钠（EDTA-Na2）、核黄素（VB2）、铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）、三氯乙酸、三氯化铁（FeCl3）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、甲醇、乙醇、石油醚等其他试剂均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3 试验仪器
电子天平，购自ME204E 瑞士梅特勒公司;匀浆机[AD145S-P（8G/10G）]，购自上海昂尼公司;索氏抽提器（SXT-06型），购自上海洪纪仪器有限公司;超声波破碎仪（VCX150PB），购自美国SONICS公司;旋转蒸发仪（R-210型），购自瑞士Buchi公司;真空冷冻干燥机（Labconco立式18），购自美国Labconco公司;紫外可见分光光度计（UV-2100型），购自尤尼可上海仪器有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1 银杏果外种皮的预处理 摘取银杏果，去除果蒂后，清洗、自然风干表皮水分，剔除果核并匀浆，再用2倍量石油醚混合，用50 ℃回流法去除脂溶性物质，剩余滤渣备用。
1.4.2 银杏果外种皮总黄酮的提取
1.4.2.1 冷凝回流法 将10 g银杏果外种皮经过匀浆和脱脂后，加入不同浓度和体积的乙醇溶液，并将冷凝回流提取器于不同温度提取3 h后取出，冷却，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清，用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，定容至 100 mL，4 ℃保存，用于总黄酮含量的测定。根据上述单因素试验结果，用正交试验法对其工艺参数进行进一步优化，以明确该提取方法的最佳技术参数。
1.4.2.2 超声波法 将10 g银杏果外种皮经匀浆和脱脂后，按1 g ∶ 5 mL的料液比与70%乙醇溶液混合，经不同功率超声波作用不同时间后取出，于 4 ℃、5 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清，用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，定容至100 mL，于 4 ℃ 保存，用于总黄酮含量的测定。根据上述单因素试验结果，采用正交试验法对其工艺参数进行进一步优化，以明确该提取方法的最佳技术参数。
1.4.3 总黄酮的测定 称取芸香苷标准品 5.00 mg，加水溶解后定容于50 mL容量瓶内，得100 mg/L芸香苷标准溶液。分别移取2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL芸香苷标准溶液于25.00 mL容量瓶内，定容得浓度梯度标准液的稀释液。取 1 mL 梯度稀释液和4.00 mL 30%乙醇溶液混合，再加入0.40 mL 5% NaNO2，摇匀静置6 min，加入040 mL 10% AlNO3显色剂，摇匀静置10 min，再加入4% NaOH，摇匀静置15 min，以不添加芸香苷的标准溶液作为空白对照，于波长510 nm处测定吸光度。以标准溶液浓度为横坐标、以吸光度为纵坐标建立回归方程。按上述方法测定银杏果外种皮提取液的吸光度，根据回归方程计算总黄酮含量。
1.4.4 银杏果外种皮总黄酮的抗氧化活性
1.4.4.1 还原力 按照Oyaizu的方法测定还原力[10]。取不同浓度的0.25 mL样品，依次加pH值为6.6的0.2 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）和1% K3[Fe（CN）6]各2.5 mL，充分混匀后于50 ℃恒温水浴20 min，取出后再加入2.5 mL 10%三氯乙酸混匀，10 000 r/min离心10 min。取5.0 mL上清液，依次加入5.0 mL H2O、1.0 mL 0.1% FeCl3，于 700 nm 处测定吸光度。 1.4.4.2 清除羟自由基 采用邻二氮菲-Fe2 氧化法测定清除羟自由基的能力，具体步骤参照Jin等的方法[11]，并略有改动。（1）依次取1 mL 0.75 mol/L 邻二氮菲、2 mL 0.2 mmol/L pH值为74的PBS和1 mL ddH2O，充分混匀，再加1 mL 075 mmol/L FeSO4，混匀后加入1 mL 0.01% H2O2，于37 ℃恒温水浴60 min，在波长536 nm处测定吸光度（Df）。步骤（2）与步骤（1）相同，仅H2O代替H2O2，吸光度记作D0。步骤（3）与步骤（1）相同，仅样品代替ddH2O，吸光度记作Dx。步骤（4）与步骤（1）相同，仅样品代替H2O2，吸光度记作Ds。清除羟自由基活性计算方法为：
1.4.4.3 清除超氧阴离子自由基 采用氯化硝基四氮唑蓝光还原法测定清除超氧阴离子自由基的能力，具体步骤见Duan等的方法[12]，并略有改动。取5 mL含有15.6 mmol/L L-Met、0.112 5 mmol/L NBT、0.3 mmol/L EDTA-Na2和pH值为7.8的005 mol/L PBS反应混合液，对照组加入0.5 mL ddH2O，样品本底吸收校正组和试验组各加0.5 mL不同浓度的总黄酮提取液，3种试验组再加1 mL VB2后，将调零组和校正组立即置于暗处，试验组于25 ℃照光15 min后，立即遮光，在波长560 nm处测定吸光度。清除超氧阴离子活性按下式计算：
1.4.4.4 清除DPPH自由基 具体参照Manivasagan等的方法并略有改动[13]。将0.2 mL不同浓度的样品与5 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液混合，在室温下遮光反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度（D）;以0.2 mL ddH2O代替样品作为空白对照（D′），以甲醇代替含有DPPH的甲醇溶液作为样品本底吸收校正（Dj）。清除二苯代苦味酰基自由基活性按下式计算：
2 结果与分析
2.1 冷凝回流法提取率的影响因素及其水平的確定
2.1.1 液料比对提取率的影响 由图1可知，在乙醇浓度为70%、提取温度为60 ℃、提取时间为3 h和液料比为1～5 mL ∶ 1 g的条件下，随着液料比的增加，银杏外种皮总黄酮提取率逐渐提高;当液料比从1 mL ∶ 1 g增加到2 mL ∶ 1 g时，提取率线性提高;当液料比从4 mL ∶ 1 g增加到 5 mL ∶ 1 g 时，提取率从1.22%提高到1.45%，变化平缓，仅增加023百分点。因此，综合提取效率，选择4 mL ∶ 1 g、 5 mL ∶ 1 g和6 mL ∶ 1 g等3个液料比水平进行正交试验。
2.1.2 温度对提取率的影响 如图2所示，在提取时长为3 h、液料比为5 mL ∶ 1 g、乙醇浓度为70%、温度为30～70 ℃的条件下，随着提取温度逐渐提高，总黄酮提取率呈先升高后降低的趋势;当提取温度为60 ℃时，总黄酮提取率最高，为1.49%。因此，选择50、60、70 ℃这3个温度水平进一步进行正交试验。
2.1.3 乙醇浓度对提取率的影响 如图3所示，在提取温度为60 ℃、提取时间为3 h、液料比为 5 mL ∶ 1 g 和乙醇浓度为60%～100%的条件下，随着乙醇浓度的提高，总黄酮提取率呈先升高后降低的趋势。当乙醇浓度为80%时，总黄酮提取率最高，为1.73%。因此，选择70%、80%、90% 3个水平的乙醇浓度进一步进行正交试验。
2.1.4 正交优化 冷凝回流法正交试验因素与水平设计见表1，正交试验结果见表2。由极差大小可知，3个因素对提取率的影响程度依次为液料比（C）>乙醇浓度（A）>温度（B）。均值代表了每个因素的最佳水平条件，对同一因素的3个水平进行比较可知：A1