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摘要 病毒诱导基因沉默（virus-induced genetic silencing，VIGS）是携带目的基因片段的病毒侵染植物后，诱导植物体内相同序列基因不表达的现象，它是一种转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）现象。近年来，在烟草基因功能探究和抗病育种的研究中VIGS获得了广泛的应用。阐述了RNA沉默的发现和作用机制，VIGS在烟草基因功能鉴定上的发现和烟草育种上的进展，探讨了VIGS技术在烟草中影响沉默效率的因素、局限性和发展前景。
关键词 基因沉默；VIGS；病毒诱导；基因沉默
中图分类号 Q781 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）08-0013-03
Abstract Virus-induced genetic silencing is the silent phenomenon of plant inner identical sequence gene which is induced by the virus disseminated plant of carried target gene frame.It is a post-transcriptional gene silencing phenomenon（PTGS）.Recently，VIGS technology was used widely in the exploration of tobacco gene function and the research of breeding disease resistance.This review introduced the discovery of RNA silencing and mechanism of action，and described the VIGS technology in the discovery of tobacco gene function and the progress of breeding tobacco.Additionally，the factors that influenced efficiency of silencing，limitation and development prospect of VIGS were studied.
Key words genetic silencing；VIGS；virus-induced；genetic silencing
1 RNA沉默
RNA沉默，即双链RNA能够引发体内同源序列的mRNA特异性和高效率的降解，抑制其内源基因表达。VIGS是RNA沉默中的一种。
1.1 RNA沉默的发现
1990年，Rich Jorgensen等预想在矮牵牛花中过量表达了植物花青素合成的关键酶——查尔酮合酶（Chalcone Synthase，CHS），从而得到产生更多花青素、颜色更深的矮牵牛花，试验结果却产生了完全白色或在紫色上夹杂白色的矮牵牛花，花色发生了明显的褪色。通过对查尔酮合成酶表达量的测定，其浓度比正常矮牵牛花的查尔酮合成酶浓度低50多倍。Jargensen等推测是否外源转入的查尔酮合成酶基因不仅无法在原有基础上大量表达，反而抑制了其内源查尔酮合成酶的表达，从而导致了褪色现象[1]。这种外源基因转入抑制其同源序列内源基因表达的现象被称为共抑制（co-suppression）。
1992年，Ramano和Macino在粗糙链孢霉（Neuros-pcracrassa）中同样观察到了外源基因转入霉菌中，抑制其同源序列内源基因表达的现象，称为基因抑制（Quelling）[2]。
1995年，Guo和Kemphues在线虫中观察到，导入线虫体内的反义RNA会和内源的mRNA结合形成双链RNA从而被降解，相似正义RNA导入线虫体内，同样也被内源mRNA降解[3]。
1998年，Andrew Fire和Mello将双链RNA（double-strand RNA，dsRNA）正义链和反义链同时注入线虫，发现同时注入正义链或反义链比单独注入能更有效地抑制基因的表达，由此推断双链RNA是引起基因沉默的主要原因，并称这种由于双链RNA引起的基因沉默现象为RNA干扰（RNA interference，RNAi）[4]。
RNA沉默在真核生物中普遍存在，特别是低等动植物以及微生物。RNA沉默现象在不同领域里名称不同，如植物中的共抑制、真菌中的基因抑制、动物中的RNA干扰，其本质都是转录后的基因沉默。
1.2 RNA沉默现象的机理
人们提出了RNA阈值模型、异位配对和双链RNA模型等假说来解释RNA沉默产生的机制，其中双链RNA模型是被人们普遍接受的假说。双链RNA（dsRNA）是病毒复制过程中的中间体，也被认为是引起RNA沉默的关键因子，一般伴随病毒在寄主体内复制而产生[5]。当外源核酸进入寄主体内并积累一定量，可以特异性地被Dicer（属于RNaseⅢ核酶家族成员）识别后与双链RNA结合，并将其剪成21～23 nt片段的小分子RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA随后与RNA解旋酶、核酸内切酶RNase组成RNA沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，在ATP的参与下解旋成单链RNA，使得RISC成为活性复合体，在RISC的介导下与具有反向序列的靶mRNA特异结合，从而导致mRNA的降解并抑制其翻译，阻止了靶向基因蛋白质和多肽的合成[6]。mRNA被切割，产生更多的21～23 nt的小片段，这些小片段又可以与siRNA重新产生新的结合，最后表现出基因沉默。这一机制是不断放大的，一旦启动就能加速进行，而这些21～23 nt的小片段也能很容易在细胞间进行远距离的移动扩大抑制范围[7-8]。 1.3 病毒诱导基因沉默
病毒诱导基因沉默（virus-induced genetic silencing，VIGS）是携带植物目的基因片段的病毒侵染植物后，诱导植物体同源序列的沉默效应，它是一种转录后基因沉默现象[9]。PTGS是植物应对病毒入侵的一种有效防御机制。
VIGS最先在RNA病毒病中发现。1995年，Kumagai等将八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase，PDS）的DNA片段插入烟草花叶病毒（Tabacco mosaic virus，TMV）中，PDS是类胡萝卜素合成的关键酶。再用重组病毒去侵染烟草后，发现烟草叶片褪色[10]。1998年，Ruiz等在马铃薯x病毒（Potato virus X，PVX）上插入PDS的DNA片段，重组病毒侵染植物后观察到同样的叶片褪色现象。推测PDS在植物中发生了基因沉默，导致表达受到抑制，类胡萝卜素合成受阻，表现出叶片漂白现象[11]。
1.4 VIGS病毒载体的开发
VIGS最先用于描述病毒入侵植物后，植物防御病毒入侵反应这一自然现象，后来越来越多地应用于重组病毒敲除植物内源基因的表达，即将病毒作为载体，将植物基因插入病毒中得到重组病毒，侵染植物后沉默同源的植物基因，以证明其植物基因的功能。1995年，Kumagai首次使用TMV以来，已发展三大类15种VIGS载体进行应用，如烟草花叶病毒[10]、马铃薯病毒X[11]、番茄金色花叶病毒（Tomato golden mosaic virus，TGMV）[12]、豌豆早枯病毒（Pea early browning virus）[13]、中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl china）和烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）[14]。根据病毒载体类型不同，其适用植物范围、基因沉默的部位和效果也不相同。目前，应用最为广泛和成熟的是TRV载体，被广泛地应用于本氏烟、拟南芥、马铃薯、番茄等。因为一种病毒侵染寄主范围有限，故开发更多的病毒载体成为诉求，应用于更广泛的植物。如CbLCV应用于拟南芥、豌豆早枯病毒（Pea early browning virus）应用于豆科植物。最早应用于VIGS研究的植物是本氏烟（Nicotiana benthamiana），也是应用最广泛的。本氏烟天然对于病毒侵染敏感，而基因沉默后性状稳定，可采用多种病毒载体如TMV、PVY、TRV等。关于VIGS的研究正逐渐应用到其他植物。
应用于烟草上的载体根据其载体种类可以分为RNA载体、DNA载体、卫星病毒载体。VIGS首先发现于TMV载体应用于本氏烟上，所以烟草上应用的载体相对其他种类植物也是选择最多的。应用于烟草上的RNA载体有5种，即烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、烟草脆裂病毒、杨树花叶病毒（Poplar mosaic virus）、番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus），TMV和PVX是最早被开发应用的病毒载体，但其本身致病病毒病症状明显，且易干扰观察沉默基因表现，效率不高不持久，对顶端分生组织无法产生沉默[15-16]。应用于烟草上的DNA载体有番茄金色花叶病毒（Tomato golden mosaic virus，TGMV），为单链环形DNA病毒，由DNA-A和DNA-B 2种核酸组成。应用于烟草上的卫星病毒载体有中国番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl China，TYLCCNV）的DNAβ构建而成的DNAmβ载体[17]。
应用于VIGS的载体一般只有2种核酸亚基因组，且影响病毒侵染、复制的基因集中于较少的亚基因组内。每种载体应用于特定的一种或几个科植物，范围单一，且病毒自身引起的病毒病症状要轻。故对于更有效、范围更广泛的VIGS载体开发是有重要作用的。
2 VIGS的应用
2.1 VIGS在烟草基因组学上的应用
VIGS现在已开发成为通过插入目的基因进入病毒载体，沉默目的基因内源基因表达的遗传技术，用于研究目的基因的功能。相比化学突变分析、转座子、农杆菌插入突变分析，VIGS可在未知目的基因片段的情况下对基因进行沉默，也无需大量筛选突变体。与传统基因敲除相比较，效率更高，方法更为简单。蛋白激酶（CDPK）被认为是植物抗病反应的关键酶。Romeis从烟草中分离出2个CDPK，并对其中一个CDPK基因序列进行基因沉默，被试植物表现出过敏反应滞后现象[18]。 锌指蛋白在基因调控方面有重要作用，通过VIGS沉默烟草锌指蛋白，并在载体上放置荧光蛋白，确定蛋白定位于叶绿体上，尤其是气孔周围的保卫细胞中的叶绿体[19]。NBS-LRR结构域会与相应的病原体无毒基因发生作用，使细胞发生程序性死亡，从而限制病原物的扩散，以起到防护作用。匡汉辉等通过克隆NBS-LRR结构域基因，证明了N家族基因对TMV的抗性[20]。通过VIGS还证明了NbHSP90c-1、NbHSP70c-1、WIPK在植物抗病中的功能。
2.2 VIGS在抗病毒病和育种上的应用
VIGS除了应用在探究基因组功能方面，也逐步应用于作物品种改良方面[21]。例如沉默某个不希望表达的基因，或者将病毒基因片段导入到植物中，使其产生对这一病毒或有亲缘关系的其他病毒抗性；还应用于植物抗虫，烟草会产生尼古丁以防御昆虫危害，茉莉酸是烟草尼古丁防御系统中的关键因子，通过沉默茉莉酸以提高尼古丁含量，来抵抗昆虫取食[22]。1999年，Ratcliff 在TRV载体中转入绿色荧光蛋白基因（GFP）介导对PVX-GFP的抗性[23]。2001年，郭兴启克隆马铃薯坏死株系（PVYN）的CP基因，插入到pROK2质粒中，通过根癌农杆菌转化入烟草，获得7株对PVYN高抗的转基因烟草[24]。2013年，江 彤等通过将马铃薯Y病毒部分基因转入到烟草中，获得了具有PVY抗性的烟草株系[25]。 3 VIGS条件优化
植物的培育条件会直接影响到病毒的侵染、复制。故在有利于病毒侵染的条件下，VIGS沉默的效果也最好。温度对VIGS沉默的效果影响巨大，不同载体引发沉默最适宜的温度不同，同一载体对不同寄主的沉默适宜温度也不同。TRV在本氏烟上沉默最适温度为22～25 ℃[26]；TYLCCNV卫星病毒载体在32 ℃下也可以发生VIGS沉默[27]。湿度对于VIGS沉默效果也会有影响，有报道低湿度环境下有利于TRV载体发生VIGS[28]。
寄主植物的不同生育期发生VIGS沉默的效果也会有差异。因为一般植物在苗期比较容易受到病毒的侵染，不同生育期对病毒侵入、增殖、移动有影响，可能相应对VIGS沉默效率也产生影响。一般情况下在较小的苗期沉默效果比较好。但TRV在本氏烟上VIGS沉默效果受寄主生育期影响比较小，而TYLCCNV卫星病毒载体完全不受生育期影响[29]。
VIGS导入植物的方法根据载体的不同方法也不同。初始导入的量越大，其沉默起始的量也越大，沉默效果相应显著。目前，使用方法有机械接种、金属粒子轰击和农杆菌介导。RNA病毒一般直接采用机械接种，DNA病毒TGMV则采用粒子轰击。农杆菌介导是应用最广、最方便、有效的导入方法。将VIGS载体导入农杆菌，再用农杆菌菌液侵入植物寄主。用农杆菌侵染植物有以下几种方式：针筒侵润法、牙签穿刺法、抽真空侵润法和灌根法。由于针筒侵润法和牙签穿刺法沉默效率低，工作量大，而抽真空法在应用上要求比较高，所以一般在烟草上使用灌根法进行大规模操作。对于农杆菌菌液的制备也会影响到VIGS的效率，有报道称，TRV和DNAmβ在OD600 2.0的浓度下，在200 μmol/L乙酰丁香酮的溶液中复苏2 h后导入寄主植物沉默效果最佳[30-31]。
4 VIGS技术局限和前景
基因沉默在基因功能的研究、植物抗病毒的应用、转基因植物育种都取得了巨大的成绩，特别是在 烟草上的研究成绩斐然。随着研究的不断深入，VIGS技术也显现出不足之处。
首先，VIGS对于一些小量表达的基因沉默效果不明显，基因沉默首要条件就是在植物体内有一定量的dsRNA累积，当处理一些本身就是小量表达的基因时，就会表现出沉默效果不佳；其次，当有几个相同或者近似相同的序列同时存在时，都会受到VIGS的干扰，这样在观察表现型时，表现就不明显或者不确定是哪个基因引起的沉默现象。再次，在某些非表现的基因中预测其功能，就不能通过基因沉默来观察其表现型。目前，克服这一缺陷是在病毒载体里放置指示基因，如放置PDS发生光漂白，放置荧光基因，通过观察指示性状来判断；最后，在植物抗病方面为了使得沉默的有效发生，刻意提高沉默序列的特异性的同时，抗病变得抗病窄谱。并且病毒载体本身也具有侵染性，所以在不同烟草上可能会引起不同程度病毒病症状[32-34]。
自从发现VIGS技术以来，在烟草上使用的载体有7种，占已开发使用病毒载体的50%，从稳定性、时效性来看也是最好的。在基因功能研究方面，从植物基本生长发育基因功能方面进行研究，不仅研究其烟草基因功能，了解其生长发育特性，同时也为其他植物基因功能提供了参考。对植物抗虫抗病方面，在其他植物VIGS技术基本还只是应用在基因功能研究层面，在烟草上已经有多个抗性品种被研究待推广。
从目前VIGS技术在烟草上的研究来看，未来将从以下几个方面加强。一是在病毒载体方面，筛选出更为简单方便操作的载体，才能加大对烟草基因功能的研究。而筛选出弱毒病毒载体，为大面积推广抗病品种成为可能。二是研究出更为有效、经济的侵染方式，现在最经济的方式是农杆菌侵染，但菌体不易保存，操作环境复杂，也是VIGS技术不能应用到实际生产中的重要问题。总之，VIGS技术在烟草基因功能和育种方面还有很大的发展空间，并且能为将来的烟草产业发展提供重要技术支持。
5 参考文献
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Key words genetic silencing；VIGS；virus-induced；genetic silencing
1 RNA沉默
RNA沉默，即双链RNA能够引发体内同源序列的mRNA特异性和高效率的降解，抑制其内源基因表达。VIGS是RNA沉默中的一种。
1.1 RNA沉默的发现
1990年，Rich Jorgensen等预想在矮牵牛花中过量表达了植物花青素合成的关键酶——查尔酮合酶（Chalcone Synthase，CHS），从而得到产生更多花青素、颜色更深的矮牵牛花，试验结果却产生了完全白色或在紫色上夹杂白色的矮牵牛花，花色发生了明显的褪色。通过对查尔酮合成酶表达量的测定，其浓度比正常矮牵牛花的查尔酮合成酶浓度低50多倍。Jargensen等推测是否外源转入的查尔酮合成酶基因不仅无法在原有基础上大量表达，反而抑制了其内源查尔酮合成酶的表达，从而导致了褪色现象[1]。这种外源基因转入抑制其同源序列内源基因表达的现象被称为共抑制（co-suppression）。
1992年，Ramano和Macino在粗糙链孢霉（Neuros-pcracrassa）中同样观察到了外源基因转入霉菌中，抑制其同源序列内源基因表达的现象，称为基因抑制（Quelling）[2]。
1995年，Guo和Kemphues在线虫中观察到，导入线虫体内的反义RNA会和内源的mRNA结合形成双链RNA从而被降解，相似正义RNA导入线虫体内，同样也被内源mRNA降解[3]。
1998年，Andrew Fire和Mello将双链RNA（double-strand RNA，dsRNA）正义链和反义链同时注入线虫，发现同时注入正义链或反义链比单独注入能更有效地抑制基因的表达，由此推断双链RNA是引起基因沉默的主要原因，并称这种由于双链RNA引起的基因沉默现象为RNA干扰（RNA interference，RNAi）[4]。
RNA沉默在真核生物中普遍存在，特别是低等动植物以及微生物。RNA沉默现象在不同领域里名称不同，如植物中的共抑制、真菌中的基因抑制、动物中的RNA干扰，其本质都是转录后的基因沉默。
1.2 RNA沉默现象的机理
人们提出了RNA阈值模型、异位配对和双链RNA模型等假说来解释RNA沉默产生的机制，其中双链RNA模型是被人们普遍接受的假说。双链RNA（dsRNA）是病毒复制过程中的中间体，也被认为是引起RNA沉默的关键因子，一般伴随病毒在寄主体内复制而产生[5]。当外源核酸进入寄主体内并积累一定量，可以特异性地被Dicer（属于RNaseⅢ核酶家族成员）识别后与双链RNA结合，并将其剪成21～23 nt片段的小分子RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA随后与RNA解旋酶、核酸内切酶RNase组成RNA沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，在ATP的参与下解旋成单链RNA，使得RISC成为活性复合体，在RISC的介导下与具有反向序列的靶mRNA特异结合，从而导致mRNA的降解并抑制其翻译，阻止了靶向基因蛋白质和多肽的合成[6]。mRNA被切割，产生更多的21～23 nt的小片段，这些小片段又可以与siRNA重新产生新的结合，最后表现出基因沉默。这一机制是不断放大的，一旦启动就能加速进行，而这些21～23 nt的小片段也能很容易在细胞间进行远距离的移动扩大抑制范围[7-8]。 1.3 病毒诱导基因沉默
病毒诱导基因沉默（virus-induced genetic silencing，VIGS）是携带植物目的基因片段的病毒侵染植物后，诱导植物体同源序列的沉默效应，它是一种转录后基因沉默现象[9]。PTGS是植物应对病毒入侵的一种有效防御机制。
VIGS最先在RNA病毒病中发现。1995年，Kumagai等将八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase，PDS）的DNA片段插入烟草花叶病毒（Tabacco mosaic virus，TMV）中，PDS是类胡萝卜素合成的关键酶。再用重组病毒去侵染烟草后，发现烟草叶片褪色[10]。1998年，Ruiz等在马铃薯x病毒（Potato virus X，PVX）上插入PDS的DNA片段，重组病毒侵染植物后观察到同样的叶片褪色现象。推测PDS在植物中发生了基因沉默，导致表达受到抑制，类胡萝卜素合成受阻，表现出叶片漂白现象[11]。
1.4 VIGS病毒载体的开发
VIGS最先用于描述病毒入侵植物后，植物防御病毒入侵反应这一自然现象，后来越来越多地应用于重组病毒敲除植物内源基因的表达，即将病毒作为载体，将植物基因插入病毒中得到重组病毒，侵染植物后沉默同源的植物基因，以证明其植物基因的功能。1995年，Kumagai首次使用TMV以来，已发展三大类15种VIGS载体进行应用，如烟草花叶病毒[10]、马铃薯病毒X[11]、番茄金色花叶病毒（Tomato golden mosaic virus，TGMV）[12]、豌豆早枯病毒（Pea early browning virus）[13]、中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl china）和烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）[14]。根据病毒载体类型不同，其适用植物范围、基因沉默的部位和效果也不相同。目前，应用最为广泛和成熟的是TRV载体，被广泛地应用于本氏烟、拟南芥、马铃薯、番茄等。因为一种病毒侵染寄主范围有限，故开发更多的病毒载体成为诉求，应用于更广泛的植物。如CbLCV应用于拟南芥、豌豆早枯病毒（Pea early browning virus）应用于豆科植物。最早应用于VIGS研究的植物是本氏烟（Nicotiana benthamiana），也是应用最广泛的。本氏烟天然对于病毒侵染敏感，而基因沉默后性状稳定，可采用多种病毒载体如TMV、PVY、TRV等。关于VIGS的研究正逐渐应用到其他植物。
应用于烟草上的载体根据其载体种类可以分为RNA载体、DNA载体、卫星病毒载体。VIGS首先发现于TMV载体应用于本氏烟上，所以烟草上应用的载体相对其他种类植物也是选择最多的。应用于烟草上的RNA载体有5种，即烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、烟草脆裂病毒、杨树花叶病毒（Poplar mosaic virus）、番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus），TMV和PVX是最早被开发应用的病毒载体，但其本身致病病毒病症状明显，且易干扰观察沉默基因表现，效率不高不持久，对顶端分生组织无法产生沉默[15-16]。应用于烟草上的DNA载体有番茄金色花叶病毒（Tomato golden mosaic virus，TGMV），为单链环形DNA病毒，由DNA-A和DNA-B 2种核酸组成。应用于烟草上的卫星病毒载体有中国番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl China，TYLCCNV）的DNAβ构建而成的DNAmβ载体[17]。
应用于VIGS的载体一般只有2种核酸亚基因组，且影响病毒侵染、复制的基因集中于较少的亚基因组内。每种载体应用于特定的一种或几个科植物，范围单一，且病毒自身引起的病毒病症状要轻。故对于更有效、范围更广泛的VIGS载体开发是有重要作用的。
2 VIGS的应用
2.1 VIGS在烟草基因组学上的应用
VIGS现在已开发成为通过插入目的基因进入病毒载体，沉默目的基因内源基因表达的遗传技术，用于研究目的基因的功能。相比化学突变分析、转座子、农杆菌插入突变分析，VIGS可在未知目的基因片段的情况下对基因进行沉默，也无需大量筛选突变体。与传统基因敲除相比较，效率更高，方法更为简单。蛋白激酶（CDPK）被认为是植物抗病反应的关键酶。Romeis从烟草中分离出2个CDPK，并对其中一个CDPK基因序列进行基因沉默，被试植物表现出过敏反应滞后现象[18]。 锌指蛋白在基因调控方面有重要作用，通过VIGS沉默烟草锌指蛋白，并在载体上放置荧光蛋白，确定蛋白定位于叶绿体上，尤其是气孔周围的保卫细胞中的叶绿体[19]。NBS-LRR结构域会与相应的病原体无毒基因发生作用，使细胞发生程序性死亡，从而限制病原物的扩散，以起到防护作用。匡汉辉等通过克隆NBS-LRR结构域基因，证明了N家族基因对TMV的抗性[20]。通过VIGS还证明了NbHSP90c-1、NbHSP70c-1、WIPK在植物抗病中的功能。
2.2 VIGS在抗病毒病和育种上的应用
VIGS除了应用在探究基因组功能方面，也逐步应用于作物品种改良方面[21]。例如沉默某个不希望表达的基因，或者将病毒基因片段导入到植物中，使其产生对这一病毒或有亲缘关系的其他病毒抗性；还应用于植物抗虫，烟草会产生尼古丁以防御昆虫危害，茉莉酸是烟草尼古丁防御系统中的关键因子，通过沉默茉莉酸以提高尼古丁含量，来抵抗昆虫取食[22]。1999年，Ratcliff 在TRV载体中转入绿色荧光蛋白基因（GFP）介导对PVX-GFP的抗性[23]。2001年，郭兴启克隆马铃薯坏死株系（PVYN）的CP基因，插入到pROK2质粒中，通过根癌农杆菌转化入烟草，获得7株对PVYN高抗的转基因烟草[24]。2013年，江 彤等通过将马铃薯Y病毒部分基因转入到烟草中，获得了具有PVY抗性的烟草株系[25]。 3 VIGS条件优化
植物的培育条件会直接影响到病毒的侵染、复制。故在有利于病毒侵染的条件下，VIGS沉默的效果也最好。温度对VIGS沉默的效果影响巨大，不同载体引发沉默最适宜的温度不同，同一载体对不同寄主的沉默适宜温度也不同。TRV在本氏烟上沉默最适温度为22～25 ℃[26]；TYLCCNV卫星病毒载体在32 ℃下也可以发生VIGS沉默[27]。湿度对于VIGS沉默效果也会有影响，有报道低湿度环境下有利于TRV载体发生VIGS[28]。
寄主植物的不同生育期发生VIGS沉默的效果也会有差异。因为一般植物在苗期比较容易受到病毒的侵染，不同生育期对病毒侵入、增殖、移动有影响，可能相应对VIGS沉默效率也产生影响。一般情况下在较小的苗期沉默效果比较好。但TRV在本氏烟上VIGS沉默效果受寄主生育期影响比较小，而TYLCCNV卫星病毒载体完全不受生育期影响[29]。
VIGS导入植物的方法根据载体的不同方法也不同。初始导入的量越大，其沉默起始的量也越大，沉默效果相应显著。目前，使用方法有机械接种、金属粒子轰击和农杆菌介导。RNA病毒一般直接采用机械接种，DNA病毒TGMV则采用粒子轰击。农杆菌介导是应用最广、最方便、有效的导入方法。将VIGS载体导入农杆菌，再用农杆菌菌液侵入植物寄主。用农杆菌侵染植物有以下几种方式：针筒侵润法、牙签穿刺法、抽真空侵润法和灌根法。由于针筒侵润法和牙签穿刺法沉默效率低，工作量大，而抽真空法在应用上要求比较高，所以一般在烟草上使用灌根法进行大规模操作。对于农杆菌菌液的制备也会影响到VIGS的效率，有报道称，TRV和DNAmβ在OD600 2.0的浓度下，在200 μmol/L乙酰丁香酮的溶液中复苏2 h后导入寄主植物沉默效果最佳[30-31]。
4 VIGS技术局限和前景
基因沉默在基因功能的研究、植物抗病毒的应用、转基因植物育种都取得了巨大的成绩，特别是在 烟草上的研究成绩斐然。随着研究的不断深入，VIGS技术也显现出不足之处。
首先，VIGS对于一些小量表达的基因沉默效果不明显，基因沉默首要条件就是在植物体内有一定量的dsRNA累积，当处理一些本身就是小量表达的基因时，就会表现出沉默效果不佳；其次，当有几个相同或者近似相同的序列同时存在时，都会受到VIGS的干扰，这样在观察表现型时，表现就不明显或者不确定是哪个基因引起的沉默现象。再次，在某些非表现的基因中预测其功能，就不能通过基因沉默来观察其表现型。目前，克服这一缺陷是在病毒载体里放置指示基因，如放置PDS发生光漂白，放置荧光基因，通过观察指示性状来判断；最后，在植物抗病方面为了使得沉默的有效发生，刻意提高沉默序列的特异性的同时，抗病变得抗病窄谱。并且病毒载体本身也具有侵染性，所以在不同烟草上可能会引起不同程度病毒病症状[32-34]。
自从发现VIGS技术以来，在烟草上使用的载体有7种，占已开发使用病毒载体的50%，从稳定性、时效性来看也是最好的。在基因功能研究方面，从植物基本生长发育基因功能方面进行研究，不仅研究其烟草基因功能，了解其生长发育特性，同时也为其他植物基因功能提供了参考。对植物抗虫抗病方面，在其他植物VIGS技术基本还只是应用在基因功能研究层面，在烟草上已经有多个抗性品种被研究待推广。
从目前VIGS技术在烟草上的研究来看，未来将从以下几个方面加强。一是在病毒载体方面，筛选出更为简单方便操作的载体，才能加大对烟草基因功能的研究。而筛选出弱毒病毒载体，为大面积推广抗病品种成为可能。二是研究出更为有效、经济的侵染方式，现在最经济的方式是农杆菌侵染，但菌体不易保存，操作环境复杂，也是VIGS技术不能应用到实际生产中的重要问题。总之，VIGS技术在烟草基因功能和育种方面还有很大的发展空间，并且能为将来的烟草产业发展提供重要技术支持。
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