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摘 要：通过石蜡制片法研究缺氮对玉米根系细胞结构的影响，分别以缺氮玉米及正常玉米的根系组织作为实验材料，利用传统石蜡切片法，对组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色等一系列处理，通过显微技术得到组织图片，获得了厚度为10μm且染色清晰、组织结构完整的缺氮和正常玉米根横切切片，通过本实验，明显可以观察到三叶一心的玉米经缺氮处理后其根部通气组织有明显变化，可为玉米氮吸收的机理研究提供一定参考。
关键词：玉米；缺氮处理；石蜡制片
玉米是世界上最重要的粮食、淀粉和工业原料作物。玉米作为我国第一大作物，其生产在国民经济发展中占有极其重要的地位。玉米也是一种重要的对高等植物进行遗传学和基因组学研究的模式生物。氮肥是农业生产中最重要与用量最大的肥料，但玉米种植中氮肥的大量使用也造成了严重的环境问题，例如环境污染以及由于过度使用肥料，尤其是氮肥造成的土壤酸化，损害了农业的可持续发展。而低氮条件下玉米生理结构的改变研究对如何提高玉米氮肥利用效率与耐低氮具有重要意义。本试验通过对缺氮玉米的根系组织进行了切片制作及显微分析，旨在了解缺氮对玉米根系组织结构及营养状况的影响。
一、材料与方法
1.材料的处理
选取颗粒饱满，籽粒均一的玉米种子，30%的H2O2浸泡15min用蒸馏水将玉米残留的H2O2冲洗干净，25℃下浸泡8h后萌发36h。待种子根部生长至2cm时，移入8个水培盆中，先用1/2Hoagland培养液培养1d后换为Hoagland营养液培养，待玉米生长至三叶一心时期，取4盆换用Hoagland缺氮培养液作为处理组（UN），另外4盆仍用Hoagland培养液作为对照组（CK），待缺氮玉米出现明显变化后，分别取实验组（UN）和对照组（CK）玉米根系组织，液氮速冻后保存于-80℃待用。
2.实验方法
（1）样品的分割与固定。将处理和对照根切成长约2毫米的小段，割取后立即投入预先准备好的FAA固定液中，将气泡抽出，使材料下沉进行固定。
（2）冲洗与苯胺番红整体染色。材料固定后，用70%酒精冲洗材料，冲洗2次，每次放置30 min，再经50%、30%、酒精复水至蒸馏水，每级1h。再入苯胺番红溶液整染过夜。
（3）石蜡制片。材料整染后，用蒸馏水洗掉浮色，经20%、30%、50%、70%脱水，每级1h；85%、95%、100%、100%各级酒精脱水，每级1h，然后依次使用1/2二甲苯 1/2纯酒精、二甲苯、二甲苯透明，每级1h。
（4）浸蜡。将组织留在透明剂（二甲苯）瓶中，在小半瓶冷的二甲苯上中填满已熔化的石蜡，倒入的石蜡即凝成固体，然后将材料放在35—37℃之间的温箱内放置2d。将材料移入56℃的恒温箱中停留2—5h，换三次新鲜的纯石蜡，使留在组织内的透明剂全部排除后包埋。
（5）包埋。将浸蜡完成后的石蜡和根组织一起倒入包埋用的纸盒中，根据切片的要求，将材料每隔1cm放置一个 ，除去气泡、插入标签后将纸盒放入冷水水槽，使盒中包埋块迅速冷却，1h时后将纸盒打开取出包埋的蜡块贮藏备用。
（6）切片、贴片、展片与烤片。使用切片机切出10μm厚度的蜡带，将切好的蜡带用赫伯特粘贴剂将蜡片粘贴在载玻片上。然后将带有蜡带的载玻片放在40℃展片台上伸展，蜡片完全伸平后，吸去多余的水，烤干后放入切片盒中。
（7）脱蜡、复染（固绿）与封片。将烤干的切片入二甲苯（2次）脱蜡，每级30min，然后入100% 酒精、95%酒精复水，每级5min，苯胺固绿溶液复染3—5 min，95%酒精分色2 min；然后用100% 酒精脱水2次，二甲苯透明2次，每级5 min；最后用封固剂封片。
（8）观察。使用显微镜对玉米各切片进行观察。
二、结果与分析
1.玉米处理结果
对玉米缺氮处理后，其生长的结果（图1）显示：1、与对照组相比缺氮玉米叶片出现明显发黄，特别是靠近叶根基部的第一片叶子已经明显变黄，该叶片所在茎区颜色明显变红；2、与对照组相比缺氮玉米根生长变快，根长明显增加，侧根生长加快、变长變细。与谢孟琳等人的研究结果一致，缺氮条件下植物根系伸长变细以增加对氮素的吸收面积从而提高对低氮胁迫的响应能力，Liu等人的在羊草中的研究也有类似的结果。
2.制片效果及对照玉米组织结构分析
石蜡切片中植物组织形态和结构是否完整，颜色是否鲜明是判断切片质量的主要指标。从图2、3可以得到组织结构完整、番红-固绿二重染色对比清晰的玉米根及叶部分组织的横切图片。
玉米根基部横切面（图2），由外向内依次为表皮细胞、由薄壁细胞组成的外皮层，中皮层，及内皮层等机械组织、凯氏带、中柱鞘、木质部、韧皮部组成的维管束。在外皮层的部分明显能观察到通气组织，通气组织是植物薄壁组织内一些气腔或空腔的集合，在缺氧条件下，如水淹时一些植物根皮层细胞会发生死亡解体而形成通气组织利用把氧气运送到根基部以保证根的代谢需要这一过程对于植物在缺氧条件下的生长具有重要的意义。维管束由内到外依次为初生韧皮部、次生韧皮部、次生木质部、初生木质部，髓鞘；在中柱鞘中穿插有外侧的筛管和内侧的导管。
3.缺氮玉米组织分析
对图2、图3对比后发现，玉米经缺氮处理后，其根部皮层地的通气组织结构变化最为明显，正常玉米根部的通气组织（图2-8）可分为多个气室，气室较小，气室之间分割明显，各薄壁细胞为球形，结构基本完整，可清晰辨别出各气室。而缺氮玉米根部的通气组织（图3-8）各气室两侧的薄壁细胞基本溶解，气室相互连通，排布杂乱，单个气室不可辨别，所有气室围绕在凯氏带外侧连接形成环状空缺，周围的薄壁细胞形状为不规则形，结构破裂。除皮层外其他根组织结构（如维管束）基本没有变化，结构完整。该结果表明玉米在氮缺乏的情况下，根系的皮层组织会产生一定的破坏，使得通气组织分布扩大，进而提高蒸腾拉力，促进根系对氮素的吸收。 三、讨论
玉米经缺氮处理后，叶片变黄，玉米根生长变快，根长明显增加，侧根生长加快、变长变细，说明氮素的供应不足严重的导致了玉米的生长状况，使得玉米叶片表现出发黄枯死的症状。而且，在玉米氮供应不足的情况下，玉米必须通过增加根与地面的相对表面积从而提高氮的吸收效率。
本实验获得了厚度为10μm且染色清晰、组织结构完整的玉米缺氮和正常根及玉米正常叶横切切片。切片分析结果显示三叶一心的玉米经缺氮处理后其根部通气组织产生了明显变化，张绪成等人的研究显示氮胁迫下玉米的蒸腾作用增加，通过蒸腾拉力更好的吸收营养和水分；王宝山的研究指出由环境胁迫引起的生物自由基的积累可导致膜的完整性破坏和差别透性丧失，如氮胁迫下丙二醛含量的增加，会导致膜结构的破坏。因此，我们推测，氮胁迫下玉米需要提高机体中氮的吸收效率，通过增加丙二醛等生物自由基的积累破坏根系的皮层组织，从而使得根皮层中通气组织的分布大量增加，进而提高蒸腾拉力，促进根系对氮素的吸收。
参考文献：
[1] 姚启伦，胡芳，许 江，等.低氮胁迫下玉米地方品种形态特征和光合特性的变化[J]. 河南农业科学.2011，40（5）：37-41）.
[2]武永军， 沈玉芳， 颜秦峰，等. 缺氮复氮处理对玉米根系生长、根系活力、硝态氮及氨基酸含量的影响[J]. 西北农业学报，.2012， 21（12）： 61–64）.
[3]谢孟林，李强，查丽，等. 低氮胁迫对不同耐低氮性玉米品种幼苗根系形态和生理特征的影响[J]. 中国生态农业学报. 2015， 23（8）： 946-953）.
[4] Liu B S，Kang C L，WangX，Bao G Z. physiological and morphological responses of Leymuschinensis to saline-alkali stress. Grassland Science. 2015，61（4）：217-226.）.
[5]張绪成，上官周平. 施氮量对小麦叶片硝酸还原酶活性、一氧化氮含量和气体交换的影响 [J] 应用生态学报.2017，18（7） 1447-1452）
[6]王宝山生物自由基与植物膜伤害[J]. 植物生理学通讯.1988（2）12-16）.
关键词：玉米；缺氮处理；石蜡制片
玉米是世界上最重要的粮食、淀粉和工业原料作物。玉米作为我国第一大作物，其生产在国民经济发展中占有极其重要的地位。玉米也是一种重要的对高等植物进行遗传学和基因组学研究的模式生物。氮肥是农业生产中最重要与用量最大的肥料，但玉米种植中氮肥的大量使用也造成了严重的环境问题，例如环境污染以及由于过度使用肥料，尤其是氮肥造成的土壤酸化，损害了农业的可持续发展。而低氮条件下玉米生理结构的改变研究对如何提高玉米氮肥利用效率与耐低氮具有重要意义。本试验通过对缺氮玉米的根系组织进行了切片制作及显微分析，旨在了解缺氮对玉米根系组织结构及营养状况的影响。
一、材料与方法
1.材料的处理
选取颗粒饱满，籽粒均一的玉米种子，30%的H2O2浸泡15min用蒸馏水将玉米残留的H2O2冲洗干净，25℃下浸泡8h后萌发36h。待种子根部生长至2cm时，移入8个水培盆中，先用1/2Hoagland培养液培养1d后换为Hoagland营养液培养，待玉米生长至三叶一心时期，取4盆换用Hoagland缺氮培养液作为处理组（UN），另外4盆仍用Hoagland培养液作为对照组（CK），待缺氮玉米出现明显变化后，分别取实验组（UN）和对照组（CK）玉米根系组织，液氮速冻后保存于-80℃待用。
2.实验方法
（1）样品的分割与固定。将处理和对照根切成长约2毫米的小段，割取后立即投入预先准备好的FAA固定液中，将气泡抽出，使材料下沉进行固定。
（2）冲洗与苯胺番红整体染色。材料固定后，用70%酒精冲洗材料，冲洗2次，每次放置30 min，再经50%、30%、酒精复水至蒸馏水，每级1h。再入苯胺番红溶液整染过夜。
（3）石蜡制片。材料整染后，用蒸馏水洗掉浮色，经20%、30%、50%、70%脱水，每级1h；85%、95%、100%、100%各级酒精脱水，每级1h，然后依次使用1/2二甲苯 1/2纯酒精、二甲苯、二甲苯透明，每级1h。
（4）浸蜡。将组织留在透明剂（二甲苯）瓶中，在小半瓶冷的二甲苯上中填满已熔化的石蜡，倒入的石蜡即凝成固体，然后将材料放在35—37℃之间的温箱内放置2d。将材料移入56℃的恒温箱中停留2—5h，换三次新鲜的纯石蜡，使留在组织内的透明剂全部排除后包埋。
（5）包埋。将浸蜡完成后的石蜡和根组织一起倒入包埋用的纸盒中，根据切片的要求，将材料每隔1cm放置一个 ，除去气泡、插入标签后将纸盒放入冷水水槽，使盒中包埋块迅速冷却，1h时后将纸盒打开取出包埋的蜡块贮藏备用。
（6）切片、贴片、展片与烤片。使用切片机切出10μm厚度的蜡带，将切好的蜡带用赫伯特粘贴剂将蜡片粘贴在载玻片上。然后将带有蜡带的载玻片放在40℃展片台上伸展，蜡片完全伸平后，吸去多余的水，烤干后放入切片盒中。
（7）脱蜡、复染（固绿）与封片。将烤干的切片入二甲苯（2次）脱蜡，每级30min，然后入100% 酒精、95%酒精复水，每级5min，苯胺固绿溶液复染3—5 min，95%酒精分色2 min；然后用100% 酒精脱水2次，二甲苯透明2次，每级5 min；最后用封固剂封片。
（8）观察。使用显微镜对玉米各切片进行观察。
二、结果与分析
1.玉米处理结果
对玉米缺氮处理后，其生长的结果（图1）显示：1、与对照组相比缺氮玉米叶片出现明显发黄，特别是靠近叶根基部的第一片叶子已经明显变黄，该叶片所在茎区颜色明显变红；2、与对照组相比缺氮玉米根生长变快，根长明显增加，侧根生长加快、变长變细。与谢孟琳等人的研究结果一致，缺氮条件下植物根系伸长变细以增加对氮素的吸收面积从而提高对低氮胁迫的响应能力，Liu等人的在羊草中的研究也有类似的结果。
2.制片效果及对照玉米组织结构分析
石蜡切片中植物组织形态和结构是否完整，颜色是否鲜明是判断切片质量的主要指标。从图2、3可以得到组织结构完整、番红-固绿二重染色对比清晰的玉米根及叶部分组织的横切图片。
玉米根基部横切面（图2），由外向内依次为表皮细胞、由薄壁细胞组成的外皮层，中皮层，及内皮层等机械组织、凯氏带、中柱鞘、木质部、韧皮部组成的维管束。在外皮层的部分明显能观察到通气组织，通气组织是植物薄壁组织内一些气腔或空腔的集合，在缺氧条件下，如水淹时一些植物根皮层细胞会发生死亡解体而形成通气组织利用把氧气运送到根基部以保证根的代谢需要这一过程对于植物在缺氧条件下的生长具有重要的意义。维管束由内到外依次为初生韧皮部、次生韧皮部、次生木质部、初生木质部，髓鞘；在中柱鞘中穿插有外侧的筛管和内侧的导管。
3.缺氮玉米组织分析
对图2、图3对比后发现，玉米经缺氮处理后，其根部皮层地的通气组织结构变化最为明显，正常玉米根部的通气组织（图2-8）可分为多个气室，气室较小，气室之间分割明显，各薄壁细胞为球形，结构基本完整，可清晰辨别出各气室。而缺氮玉米根部的通气组织（图3-8）各气室两侧的薄壁细胞基本溶解，气室相互连通，排布杂乱，单个气室不可辨别，所有气室围绕在凯氏带外侧连接形成环状空缺，周围的薄壁细胞形状为不规则形，结构破裂。除皮层外其他根组织结构（如维管束）基本没有变化，结构完整。该结果表明玉米在氮缺乏的情况下，根系的皮层组织会产生一定的破坏，使得通气组织分布扩大，进而提高蒸腾拉力，促进根系对氮素的吸收。 三、讨论
玉米经缺氮处理后，叶片变黄，玉米根生长变快，根长明显增加，侧根生长加快、变长变细，说明氮素的供应不足严重的导致了玉米的生长状况，使得玉米叶片表现出发黄枯死的症状。而且，在玉米氮供应不足的情况下，玉米必须通过增加根与地面的相对表面积从而提高氮的吸收效率。
本实验获得了厚度为10μm且染色清晰、组织结构完整的玉米缺氮和正常根及玉米正常叶横切切片。切片分析结果显示三叶一心的玉米经缺氮处理后其根部通气组织产生了明显变化，张绪成等人的研究显示氮胁迫下玉米的蒸腾作用增加，通过蒸腾拉力更好的吸收营养和水分；王宝山的研究指出由环境胁迫引起的生物自由基的积累可导致膜的完整性破坏和差别透性丧失，如氮胁迫下丙二醛含量的增加，会导致膜结构的破坏。因此，我们推测，氮胁迫下玉米需要提高机体中氮的吸收效率，通过增加丙二醛等生物自由基的积累破坏根系的皮层组织，从而使得根皮层中通气组织的分布大量增加，进而提高蒸腾拉力，促进根系对氮素的吸收。
参考文献：
[1] 姚启伦，胡芳，许 江，等.低氮胁迫下玉米地方品种形态特征和光合特性的变化[J]. 河南农业科学.2011，40（5）：37-41）.
[2]武永军， 沈玉芳， 颜秦峰，等. 缺氮复氮处理对玉米根系生长、根系活力、硝态氮及氨基酸含量的影响[J]. 西北农业学报，.2012， 21（12）： 61–64）.
[3]谢孟林，李强，查丽，等. 低氮胁迫对不同耐低氮性玉米品种幼苗根系形态和生理特征的影响[J]. 中国生态农业学报. 2015， 23（8）： 946-953）.
[4] Liu B S，Kang C L，WangX，Bao G Z. physiological and morphological responses of Leymuschinensis to saline-alkali stress. Grassland Science. 2015，61（4）：217-226.）.
[5]張绪成，上官周平. 施氮量对小麦叶片硝酸还原酶活性、一氧化氮含量和气体交换的影响 [J] 应用生态学报.2017，18（7） 1447-1452）
[6]王宝山生物自由基与植物膜伤害[J]. 植物生理学通讯.1988（2）12-16）.