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摘要
[目的] 为罗非鱼的养殖提供技术参考。[方法]对吉富罗非鱼P0代和抗病选育P2代、奥尼罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥利亚罗非鱼进行人工感染无乳链球菌，评估不同品系罗非鱼的抗无乳链球菌病性能。[结果]从感染死亡率来看，奥尼罗非鱼的抗病性能优于其他品系，各组的感染死亡率大小依次为吉富罗非鱼P0代>尼罗罗非鱼>奥利亚罗非鱼>吉富罗非鱼抗病P2代>奥尼罗非鱼。其中，吉富罗非鱼抗病P2代的死亡率比P0代降低45.3%，与奥尼鱼的死亡率相近。从死亡历时来看，吉富罗非鱼抗病选育P2代在感染后48 h才出现死亡，而其他组均在感染后24 h内出现死亡。[结论]通过针对性选育能有效提高吉富罗非鱼的抗病性能，同时也为在罗非鱼苗种投放时品种的选择提供参考依据。
关键词罗非鱼；抗病选育；无乳链球菌
中图分类号S965.125文献标识码A文章编号0517-6611（2015）10-168-03
Abstract [Objective] The research aimed to provide technical references for the breeding of tilapia. [Method] GIFT P0 and diseaseresistant P2， Oreochromis niloticus， Oreochromis aureus， Oreochromis niloticus×O. aureus were challenged by Streptococcus agalactiae by artificial infection. The disease resistance of different tilapia cultivars to Streptococcus agalactiae was evaluated. [Result] From the infection mortality， the disease resistance of O. niloticus was better than that of other cultivars. The order of infection mortality was GIFT P0 >O. aureus> O. niloticus×O. aureus>GIFT diseaseresistant P2 >O. niloticus. The mortality of GIFT diseaseresistant P2 was 45.3% lower than GIFT P0， which was similar to that of O. niloticus. From the duration of death， GIFT diseaseresistant P2 died within 48 h after the artificial infection， but the fishes died within 24 h after the infection. [Conclusion] The disease resistance of GIFT tilapia could be greatly improved by selective breeding， and the research could provide references for the selection of tilapia cultivars.
Key words Tilapia； Diseaseresistance breeding； Streptococcus agalactiae
罗非鱼原产于非洲，1956年首次引入中国大陆[1]，经过几十年的发展我国已成为罗非鱼养殖和出口的第一大国，年均总产量和出口量约占世界总量的1/3。目前我国养殖的罗非鱼品种主要有吉富罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）、尼罗罗非鱼（Oreochromis aureus）、奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×O. aureus）、奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）、红罗非鱼（Oreochromis sp.）等[2]。近来年，随着养殖规模的盲目扩大和水质环境恶化等因素的影响，罗非鱼的病害日趋严重，尤其是2009年至今罗非鱼无乳链球菌病已成为罗非鱼养殖业的首要病害[3-5]，其中吉富罗非鱼发病最为严重，发病死亡率达60%以上。因此，有必要对现有的主养罗非鱼品种进行抗病性检测，筛选出抗病力强的品种用于推广养殖，减少疾病的危害，为罗非鱼养殖业的持续发展提供良种保证。
目前，国内外对罗非鱼链球菌病的研究主要集中在致病机理[6-9]、疫苗研发[10-11]、药物防控[12]及抗病育种[13]等方面。在抗病育种方面，朱佳杰等[13]通过家系选育和人工感染方式筛选出1批吉富罗非鱼高抗病家系和易感病家系；强俊等[14]分析了海豚链球菌感染对不同品系罗非鱼血液生化指标和肝脏HSP70 mRNA表达的影响；柯剑[15]比较了奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥尼罗非鱼、吉富罗非鱼及莫荷罗非鱼5个品系感染嗜水气单胞菌后的抗病力差异。目前，国内尚未见到关于不同品系罗非鱼感染无乳链球菌的报道。在前期开展吉富罗非鱼抗病选育的基础上，笔者将选育出的P2代群体分别与未选育的P0代、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及奥尼罗非鱼进行抗无乳链球菌病性能比较，一方面对吉富罗非鱼抗病育种的效果进行评价，另一个方面评估各个品系罗非鱼的抗病性能，以期为罗非鱼养殖提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
试验鱼。试验所用的罗非鱼均由国家级广西南宁罗非鱼良种场提供。其中吉富罗非鱼P0代为从国家级青岛罗非鱼良种场引种后群体选育的后代，而吉富罗非鱼抗病P2代则是在P0代的基础上开展抗无乳链球菌病针对性选育，目前已选育到第2代。奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥尼罗非鱼鱼苗均取自同一个家系的苗种。2013年将相同数量的这5种鱼苗在网箱中单独培育至规格50～60 g后进行人工感染无乳链球菌攻毒试验。试验前先对各品种鱼随机抽样进行细菌分离及PCR鉴定（参考黎炯[16]的方法）是否已感染无乳链球菌，将未感染无乳链球菌的鱼用于攻毒试验。 1.1.2
试验菌株。
攻毒感染试验用的无乳链球菌菌株（HN016）由广西水产科学研究院鱼病防治研究室馈赠，经过基因型和血清型鉴定[17]，该菌株为我国罗非鱼主产区的优势菌株。菌株保存在-80 ℃冰箱内，取出后接种于鸡血平板，28 ℃培养24 h，挑取单菌落进行革兰氏染色，鉴定细菌是否被污染；随机挑取单菌落于含有200 ml TSB培养基的1 000 ml锥形瓶中，28 ℃下振荡培养48 h，测定菌液的OD值，确定菌液浓度。然后，对菌液进行不同浓度稀释感染吉富罗非鱼P0代筛选出半数致死浓度，并以此浓度作为评估各组罗非鱼抗病力的标准。
1.2 试验方法
每组随机抽取同个家系的鱼200尾，设3个重复，每个重复50尾，另设置1个对照组。先在容量1 m3的大桶中暂养10 d，水温30～31 ℃，pH 6.7。每天早晚各投喂饲料1次，每隔2 d换水1次，正常充气，试验开始1 d前暂停投饵料。
经半数致死浓度预试验筛选，对每组鱼进行腹腔注射无乳链球菌，菌液浓度为1.47×108 CFU/ml，剂量为0.2 ml。对照组用等量无菌（0.85% NaCl）生理盐水注射。注射完成后将鱼放回原试验大桶饲养，每隔3 h捞出死亡鱼并记录数量，待各组均停止死亡后统计死亡鱼的数量和死亡时间。
1.3数据处理
采用Excel 2003软件进行数据统计分析及图表制作。
2结果与分析
2.1不同品系罗非鱼感染无乳链球菌后的抗病性能分析
试验组各品种罗非鱼感染无乳链球菌后均出现了不同程度的死亡。发病症状主要表现为：眼球突出，游动时出现侧翻和打转现象。解剖后发现鳃盖充血，肝脏及胆囊肿大、肠壁明显变薄等。对死鱼随机抽样进行脑组织细菌分离及PCR鉴定，证实为无乳链球菌感染致死。由表1可知，无乳链球菌感染后各试验组的死亡率大小依次为吉富罗非鱼P0代>美国尼罗罗非鱼>奥利亚罗非鱼>吉富罗非鱼抗病P2代>奥尼罗非鱼。其中，吉富罗非鱼抗病P2代的致死率为22.7%，比未经选育的P0代降低了45.3%，比尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的死亡率均低。结果表明，经过2个世代针对性的开展抗病选育，吉富罗非鱼抗病P2代的抗病性能与P0代相比获得了显著提高，已接近奥尼罗非鱼的抗病力水平，选育效果显著。
2.25种罗非鱼人工感染无乳链球菌后死亡时间
从图1可以看出，各试验组罗非鱼的死亡的变化趋势呈先逐渐上升后趋向于平稳。其中，吉富罗非鱼P0代的发病死亡高峰期主要集中在12～72 h，而尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、奥利亚罗非鱼、奥尼罗非鱼的发病死亡高峰期均集中24～96 h，而吉富罗非鱼抗病P2代的死亡时间则主要集中在48～96 h，感染后120 h各组的死亡数量逐渐趋向稳定。此试验的死亡规律与朱佳杰等[13]相似，说明此次感染是比较成功的。
3讨论
无乳链球菌属于人畜鱼共患病原菌，可以在人类、奶牛、小鼠、蜥蜴之间交叉感染。Lau[18]及Koh[19]等研究表明罗非鱼链球菌也能够传染给人类。CHEN M等[20]研究发现2009～2012年我国罗非鱼养殖的病害主要是无乳链球菌病，集中在每年6～10月，死亡率为30%～80%。研究表明，鱼类对疾病的抵抗力存在着物种间和个体的差异。因此，可以通过人工感染试验来培育抗病力强的品系。大西洋鲑（Salmo salar）[17]及牙鲆（Paralichthys olivaceus）[21]是鱼类抗病育种较成功的例子。该研究在2012年筛选出的11个吉富罗非鱼抗病家系的基础上，通过家系间杂交获得抗病P2代，并选择抗病力强的P2代家系与奥尼罗非鱼、吉富罗非鱼P0代、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼进行抗病性能比对，发现奥尼罗非鱼的抗病性能最强，这是种间杂交带来的杂种优势的体现。其次是吉富罗非鱼抗病P2代，主要表现在感染死亡率及死亡历时2个方面。它感染无乳链球菌以后的死亡率比吉富罗非鱼P0代、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼均低，表明经过针对性的选育能显著提升吉富罗非鱼的抗病水平；死亡历时时间也比其他品系有所延长，这在养殖生产中为药物防治或疫苗免疫赢得了宝贵的时间。该研究结果与王瑞[22]比较吉富罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、奥尼罗非鱼感染海豚链球菌的抗病力结果相似，但因菌株、感染剂量及试验鱼规格不同，各品系间的感染死亡率有所差异。
家系育种作为选择育种的重要手段之一，已在鱼类育种工作中得到广泛应用。Bolivar等[23]通过家系选育对尼罗罗非鱼16周时的体重进行连续10年选育，平均每个世代的体重增长12.4%，效果非常理想。该研究中的吉富罗非鱼抗病P2代是在P0代的基础上通过家系间杂交选育出来的，其感染后死亡率比P0代降低45.3%，表明家系选育在罗非鱼抗病育种中确实有效。究其原因，是因为将抗病性能优秀的家系进行多个世代系统定向选育，既避免了近亲繁殖，又增加了群体内抗病基因的富集，逐步稳定性状最终达到育成新品系的目的。
该研究对5个不同品系进行抗无乳链球菌病性能评估，一方面证实了家系选育确实能有效提高吉富罗非鱼的抗病性能，另一方面也为广大养殖户在罗非鱼苗种投放时品种的选择提供参考依据。
参考文献
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[目的] 为罗非鱼的养殖提供技术参考。[方法]对吉富罗非鱼P0代和抗病选育P2代、奥尼罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥利亚罗非鱼进行人工感染无乳链球菌，评估不同品系罗非鱼的抗无乳链球菌病性能。[结果]从感染死亡率来看，奥尼罗非鱼的抗病性能优于其他品系，各组的感染死亡率大小依次为吉富罗非鱼P0代>尼罗罗非鱼>奥利亚罗非鱼>吉富罗非鱼抗病P2代>奥尼罗非鱼。其中，吉富罗非鱼抗病P2代的死亡率比P0代降低45.3%，与奥尼鱼的死亡率相近。从死亡历时来看，吉富罗非鱼抗病选育P2代在感染后48 h才出现死亡，而其他组均在感染后24 h内出现死亡。[结论]通过针对性选育能有效提高吉富罗非鱼的抗病性能，同时也为在罗非鱼苗种投放时品种的选择提供参考依据。
关键词罗非鱼；抗病选育；无乳链球菌
中图分类号S965.125文献标识码A文章编号0517-6611（2015）10-168-03
Abstract [Objective] The research aimed to provide technical references for the breeding of tilapia. [Method] GIFT P0 and diseaseresistant P2， Oreochromis niloticus， Oreochromis aureus， Oreochromis niloticus×O. aureus were challenged by Streptococcus agalactiae by artificial infection. The disease resistance of different tilapia cultivars to Streptococcus agalactiae was evaluated. [Result] From the infection mortality， the disease resistance of O. niloticus was better than that of other cultivars. The order of infection mortality was GIFT P0 >O. aureus> O. niloticus×O. aureus>GIFT diseaseresistant P2 >O. niloticus. The mortality of GIFT diseaseresistant P2 was 45.3% lower than GIFT P0， which was similar to that of O. niloticus. From the duration of death， GIFT diseaseresistant P2 died within 48 h after the artificial infection， but the fishes died within 24 h after the infection. [Conclusion] The disease resistance of GIFT tilapia could be greatly improved by selective breeding， and the research could provide references for the selection of tilapia cultivars.
Key words Tilapia； Diseaseresistance breeding； Streptococcus agalactiae
罗非鱼原产于非洲，1956年首次引入中国大陆[1]，经过几十年的发展我国已成为罗非鱼养殖和出口的第一大国，年均总产量和出口量约占世界总量的1/3。目前我国养殖的罗非鱼品种主要有吉富罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）、尼罗罗非鱼（Oreochromis aureus）、奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×O. aureus）、奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）、红罗非鱼（Oreochromis sp.）等[2]。近来年，随着养殖规模的盲目扩大和水质环境恶化等因素的影响，罗非鱼的病害日趋严重，尤其是2009年至今罗非鱼无乳链球菌病已成为罗非鱼养殖业的首要病害[3-5]，其中吉富罗非鱼发病最为严重，发病死亡率达60%以上。因此，有必要对现有的主养罗非鱼品种进行抗病性检测，筛选出抗病力强的品种用于推广养殖，减少疾病的危害，为罗非鱼养殖业的持续发展提供良种保证。
目前，国内外对罗非鱼链球菌病的研究主要集中在致病机理[6-9]、疫苗研发[10-11]、药物防控[12]及抗病育种[13]等方面。在抗病育种方面，朱佳杰等[13]通过家系选育和人工感染方式筛选出1批吉富罗非鱼高抗病家系和易感病家系；强俊等[14]分析了海豚链球菌感染对不同品系罗非鱼血液生化指标和肝脏HSP70 mRNA表达的影响；柯剑[15]比较了奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥尼罗非鱼、吉富罗非鱼及莫荷罗非鱼5个品系感染嗜水气单胞菌后的抗病力差异。目前，国内尚未见到关于不同品系罗非鱼感染无乳链球菌的报道。在前期开展吉富罗非鱼抗病选育的基础上，笔者将选育出的P2代群体分别与未选育的P0代、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及奥尼罗非鱼进行抗无乳链球菌病性能比较，一方面对吉富罗非鱼抗病育种的效果进行评价，另一个方面评估各个品系罗非鱼的抗病性能，以期为罗非鱼养殖提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
试验鱼。试验所用的罗非鱼均由国家级广西南宁罗非鱼良种场提供。其中吉富罗非鱼P0代为从国家级青岛罗非鱼良种场引种后群体选育的后代，而吉富罗非鱼抗病P2代则是在P0代的基础上开展抗无乳链球菌病针对性选育，目前已选育到第2代。奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥尼罗非鱼鱼苗均取自同一个家系的苗种。2013年将相同数量的这5种鱼苗在网箱中单独培育至规格50～60 g后进行人工感染无乳链球菌攻毒试验。试验前先对各品种鱼随机抽样进行细菌分离及PCR鉴定（参考黎炯[16]的方法）是否已感染无乳链球菌，将未感染无乳链球菌的鱼用于攻毒试验。 1.1.2
试验菌株。
攻毒感染试验用的无乳链球菌菌株（HN016）由广西水产科学研究院鱼病防治研究室馈赠，经过基因型和血清型鉴定[17]，该菌株为我国罗非鱼主产区的优势菌株。菌株保存在-80 ℃冰箱内，取出后接种于鸡血平板，28 ℃培养24 h，挑取单菌落进行革兰氏染色，鉴定细菌是否被污染；随机挑取单菌落于含有200 ml TSB培养基的1 000 ml锥形瓶中，28 ℃下振荡培养48 h，测定菌液的OD值，确定菌液浓度。然后，对菌液进行不同浓度稀释感染吉富罗非鱼P0代筛选出半数致死浓度，并以此浓度作为评估各组罗非鱼抗病力的标准。
1.2 试验方法
每组随机抽取同个家系的鱼200尾，设3个重复，每个重复50尾，另设置1个对照组。先在容量1 m3的大桶中暂养10 d，水温30～31 ℃，pH 6.7。每天早晚各投喂饲料1次，每隔2 d换水1次，正常充气，试验开始1 d前暂停投饵料。
经半数致死浓度预试验筛选，对每组鱼进行腹腔注射无乳链球菌，菌液浓度为1.47×108 CFU/ml，剂量为0.2 ml。对照组用等量无菌（0.85% NaCl）生理盐水注射。注射完成后将鱼放回原试验大桶饲养，每隔3 h捞出死亡鱼并记录数量，待各组均停止死亡后统计死亡鱼的数量和死亡时间。
1.3数据处理
采用Excel 2003软件进行数据统计分析及图表制作。
2结果与分析
2.1不同品系罗非鱼感染无乳链球菌后的抗病性能分析
试验组各品种罗非鱼感染无乳链球菌后均出现了不同程度的死亡。发病症状主要表现为：眼球突出，游动时出现侧翻和打转现象。解剖后发现鳃盖充血，肝脏及胆囊肿大、肠壁明显变薄等。对死鱼随机抽样进行脑组织细菌分离及PCR鉴定，证实为无乳链球菌感染致死。由表1可知，无乳链球菌感染后各试验组的死亡率大小依次为吉富罗非鱼P0代>美国尼罗罗非鱼>奥利亚罗非鱼>吉富罗非鱼抗病P2代>奥尼罗非鱼。其中，吉富罗非鱼抗病P2代的致死率为22.7%，比未经选育的P0代降低了45.3%，比尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的死亡率均低。结果表明，经过2个世代针对性的开展抗病选育，吉富罗非鱼抗病P2代的抗病性能与P0代相比获得了显著提高，已接近奥尼罗非鱼的抗病力水平，选育效果显著。
2.25种罗非鱼人工感染无乳链球菌后死亡时间
从图1可以看出，各试验组罗非鱼的死亡的变化趋势呈先逐渐上升后趋向于平稳。其中，吉富罗非鱼P0代的发病死亡高峰期主要集中在12～72 h，而尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、奥利亚罗非鱼、奥尼罗非鱼的发病死亡高峰期均集中24～96 h，而吉富罗非鱼抗病P2代的死亡时间则主要集中在48～96 h，感染后120 h各组的死亡数量逐渐趋向稳定。此试验的死亡规律与朱佳杰等[13]相似，说明此次感染是比较成功的。
3讨论
无乳链球菌属于人畜鱼共患病原菌，可以在人类、奶牛、小鼠、蜥蜴之间交叉感染。Lau[18]及Koh[19]等研究表明罗非鱼链球菌也能够传染给人类。CHEN M等[20]研究发现2009～2012年我国罗非鱼养殖的病害主要是无乳链球菌病，集中在每年6～10月，死亡率为30%～80%。研究表明，鱼类对疾病的抵抗力存在着物种间和个体的差异。因此，可以通过人工感染试验来培育抗病力强的品系。大西洋鲑（Salmo salar）[17]及牙鲆（Paralichthys olivaceus）[21]是鱼类抗病育种较成功的例子。该研究在2012年筛选出的11个吉富罗非鱼抗病家系的基础上，通过家系间杂交获得抗病P2代，并选择抗病力强的P2代家系与奥尼罗非鱼、吉富罗非鱼P0代、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼进行抗病性能比对，发现奥尼罗非鱼的抗病性能最强，这是种间杂交带来的杂种优势的体现。其次是吉富罗非鱼抗病P2代，主要表现在感染死亡率及死亡历时2个方面。它感染无乳链球菌以后的死亡率比吉富罗非鱼P0代、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼均低，表明经过针对性的选育能显著提升吉富罗非鱼的抗病水平；死亡历时时间也比其他品系有所延长，这在养殖生产中为药物防治或疫苗免疫赢得了宝贵的时间。该研究结果与王瑞[22]比较吉富罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、奥尼罗非鱼感染海豚链球菌的抗病力结果相似，但因菌株、感染剂量及试验鱼规格不同，各品系间的感染死亡率有所差异。
家系育种作为选择育种的重要手段之一，已在鱼类育种工作中得到广泛应用。Bolivar等[23]通过家系选育对尼罗罗非鱼16周时的体重进行连续10年选育，平均每个世代的体重增长12.4%，效果非常理想。该研究中的吉富罗非鱼抗病P2代是在P0代的基础上通过家系间杂交选育出来的，其感染后死亡率比P0代降低45.3%，表明家系选育在罗非鱼抗病育种中确实有效。究其原因，是因为将抗病性能优秀的家系进行多个世代系统定向选育，既避免了近亲繁殖，又增加了群体内抗病基因的富集，逐步稳定性状最终达到育成新品系的目的。
该研究对5个不同品系进行抗无乳链球菌病性能评估，一方面证实了家系选育确实能有效提高吉富罗非鱼的抗病性能，另一方面也为广大养殖户在罗非鱼苗种投放时品种的选择提供参考依据。
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[4] 李莉萍，王瑞，黄婷，等.广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析[J].水产学报，2013，37（6）：927-935. [5] 李莉萍，王瑞，黄婷，等.海南、福建3省罗非鱼链球菌流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析[J].西南农业学报，2013（5）：2133-2140.
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