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摘要：【目的】通过在复合垂直潜流人工湿地系统中筛选高效的硝化细菌和反硝化细菌，以降低氮素污染对养殖水域生态系统的危害，为加强人工湿地氮素净化功能提供科技支撑。【方法】在复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统的不同运行阶段采集样品，利用选择性培养基定向筛选，选择一株高效硝化细菌和一株高效反硝化细菌，对其进行菌种鉴定，并分别研究对应菌株的硝化特性或反硝化特性。【结果】通过个体形态特征观察、生理生化鉴定及16S rDNA同源性比对分析，确定硝化菌株ZX2属于不动杆菌属（Acinetobacter），反硝化菌株ZF7属于假单胞菌属（Pseudomonas）。在pH为7.0，温度为30 ℃，亚硝酸钠浓度为0.8 g/L的条件下硝化菌株ZX2的硝化能力最强，OD600可达0.80以上，硝化速率达68.4 mg/（L·d）。在pH为7.0，温度为35 ℃，接种量为6%的条件下反硝化菌株ZF7的反硝化能力最强，OD600可达1.00以上，脱氮率达94.5%。【结论】筛选得到的硝化细菌和反硝化细菌具有很好的氮素净化效果，可为下一步强化人工湿地氮素净化功能提供备用菌株。
关键词： 人工湿地;硝化细菌;反硝化细菌;氮素污染;含氮废水净化
中图分类号： S182 文獻标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）04-0736-09
Abstract：【Objective】A high-efficiency nitrifying bacteria and denitrifying bacteria was screened in the integrated vertical subsurface flow constructed wetlands system to reduce the harm of nitrogen pollution to the aquaculture water ecosystem， and provided a theoretical basis for strengthening the nitrogen purification function of the constructed wetlands.【Method】Samples were collected at different operational stages of the integrated vertical subsurface flow constructed wetland-pond recirculating aquaculture system. A selective media was used for targeted screening，then a high-efficiency nitrifying bacteria and a highly efficient denitrifying bacteria were selected for strain identification and studying separately the nitrification or denitrification characteristics of the corresponding strain. 【Result】The nitrifying strain ZX2 was initially identified as Acinetobacter and the denitrifying strain ZF7 was Pseudomonas based on its morphological observation， physio-logical and biochemical tests as well as 16S rDNA phylogenetic analysis. The nitrification ability of nitrifying strain ZX2 was the highest under the conditions of pH 7.0， temperature 30 ℃，and sodium nitrite concentration 0.8 g/L. OD600 value could reach above 0.80，and the nitrification rate reached 68.4 mg/（L·d）. Under the conditions of pH 7， temperature 35 ℃， the inoculum amount 6%，the denitrification capacity of denitrifying strain ZF7 was the highest. OD600 value could reach above 1.00， and the denitrification rate reached 94.5%. 【Conclusion】The nitrifying bacteria and denitrifying bacteria screened in this study have good effect on nitrogen purification， and can provide a spare strain for further strengthening the nitrogen purification function of the constructed wetlands.
Key words： constructed wetland; nitrifying bacteria; denitrifying bacteria;nitrogen pollution; nitrogen-containing wastewater purification 0 引言
【研究意义】发展高密度养殖和集约化管理是我国水产养殖业的发展趋势，高密度集约化养殖在促进渔业增效和渔民增收的同时，不可避免地带来养殖水环境污染问题。在水产养殖过程中，鱼类排泄物和未被消耗饲料的降解使得养殖水体中的氨氮剧增，氨氮和亚硝酸氮含量过高会对水产养殖动物产生毒害作用，甚至导致大规模死亡现象发生;此外，未经处理的养殖废水排放到自然水体中也会造成富营养化，严重影响水产养殖业的绿色可持续发展（梁新雪，2011;刘国锋等，2018）。因此，解决高密度水产养殖废水的净化问题迫在眉睫。【前人研究进展】目前水产养殖业中氮素净化应用较广泛的技术是微生物处理技术和生态处理技术。微生物处理技术是利用硝化或反硝化能力强的微生物对水产养殖废水进行净化，具有氮素净化作用的微生物主要有硝化细菌（王薇等，2007）、红球菌属（张艳等，2007）、产碱杆菌属（王弘宇等，2009）、固氮弧菌属（王小菊等，2013）、假单胞菌属（杨浩锋等，2014）、不动杆菌属（颜薇芝等，2017）等，但该技术在处理效果、处理成本、推广适用性等方面尚有待进一步探究。在生态处理技术方面，已有研究表明人工湿地中存在相当数量与氮素净化相关的菌种（雷旭等，2015），且硝化细菌和反硝化细菌分布状况在一定程度上受湿地结构和湿地植物的影響（王爱平等，2010）;研究显示，表面流人工湿地（鲁敏等，2012）、水平潜流人工湿地（李宝华等，2013）及垂直潜流人工湿地（董玉峰，2014）对水体中的氮磷、重金属等有较稳定的处理能力，但随着使用年限的增长，人工湿地的净化效率和稳定性必然会下降（尹炜等，2004）。【本研究切入点】复合垂直潜流人工湿地作为生态处理技术的一种典型应用模式，其对于水产养殖废水氮素的去除效果明显（董玉峰，2014）。微生物的硝化和反硝化作用是去除氮素的最主要途径（张鸿等，1999），目前研究报道具有氮素净化作用的微生物种类较多，但关于复合垂直潜流人工湿地中硝化和反硝化细菌的筛选、鉴定及其特性分析的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过特定生境下硝化及反硝化细菌的筛选、鉴定、分析及应用，实现人工湿地氮素处理效率的提升，以期为加强人工湿地氮素净化功能提供技术支撑。
1 材料与方法
1. 1 试验地点及概况
1. 1. 1 复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统结构 试验地点位于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心大浦科研试验基地。复合垂直潜流人工湿地主要由5个单元构成，即沉淀池、上行垂直潜流湿地、下行垂直潜流湿地、预警池及清水池，面积约600 m2。湿地基质为直径8～10 cm大鹅卵石、4～6 cm小鹅卵石和2～4 cm生物陶粒。湿地植物为生长周期较长的梭鱼草（Pontederia cordata）和再力花（Thalia dealbata），上行池主要种植再力花，下行池种植梭鱼草，再力花株距60 cm，梭鱼草株距40 cm，种植时间为5月初。池塘养殖鲫鱼、团头鲂、鲢鱼和鳙鱼，密度依次为0.011、0.136、0.020和0.006 kg/m3，每天上午9：00—10：00和下午16：00—17：00投喂饲料。试验于2017年湿地运行的6—10月进行。复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统结构如图1所示。
1. 1. 2 复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统基本数据 人工湿地水力负荷（HLR）和水力停留时间（HRT）根据公式计算得出。
式中，S为人工湿地主体面积（m2），W为污水设计流量（100 m3/d），γ为人工湿地孔隙度（%），h为人工湿地深度（m）。
复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统基本数据见表1，不同时间段的人工湿地温度、pH和溶氧量见表2。
1. 2 样品采集及培养基制备
1. 2. 1 样品采集 在湿地运行初期（6月底）、中期（8月底）和末期（10月底），采用三点取样法在上行池和下行池进行采样，分别采集湿地植物根系、根系附近基质及植物附近水样，每个取样点选取3株相邻植株进行平行取样，装入取样袋，置于4 ℃环境中冷藏待用。
1. 2. 2 培养基制备 硝化液体富集培养基：亚硝酸钠1.0 g、硫酸镁0.5 g、碳酸钠1.0 g和硫酸亚铁0.4 g，加蒸馏水定容至l L。该培养液在灭菌前用氢氧化钠调pH至7.5～8.0，再加0.5 g磷酸氢钾（磷酸盐单独灭菌，且在培养液冷却至室温后加入）（王小菊等，2013）。
反硝化液体富集培养基：硝酸钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、磷酸氢钾0.5 g和酒石酸钾钠20.0 g，加蒸馏水定容至1 L;pH 7.0～7.5（曾庆武等，2008）。
平板分离培养基：在富集培养基中加入约1.8%琼脂糖即可。
纯化培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g和氯化钠10.0 g，加水定容至1 L;氢氧化钠调pH至7.0。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 细菌筛选 取湿地水样10 mL、基质若干及适量植物根系加入到含100 mL灭菌蒸馏水的250 mL三角烧瓶中，30 ℃下170 r/min振荡30 min后，取10 mL上清液加入到含100 mL硝化液体培养基的250 mL三角瓶中，另取10 mL上清液加入到含100 mL反硝化液体培养基的250 mL三角瓶中（夏辉和梁运祥，2006）;在30 ℃、170 r/min条件下，硝化培养液振荡富集培养10 d（每2 d吸取适量硝化富集液，在白瓷板上与二苯胺试剂发生显色反应，根据显色反应判断液体培养基中亚硝酸根的减少和硝酸根的生成状况）（胡朝松等，2009），反硝化培养液静置密闭富集培养3 d。选取颜色变深的硝化培养液和富集培养3 d后的反硝化培养液按稀释分离方法稀释至10-2、10-3和10-4 3个稀释度，分别在硝化细菌和反硝化细菌固体培养基上涂布分离，硝化固体培养基在30 ℃恒温培养箱中培养10 d左右，反硝化固体培养基培养3 d左右。挑选8株典型单菌落，经溶菌肉汤（LB）培养基多次划线纯化，转入斜面保存备用。 1. 3. 2 备用菌液培养 将上述分离得到且保存在斜面的单菌株分别接种到含20 mL LB液体培养基的100 mL三角瓶中，28 ℃下170 r/min振荡培养24 h，作为备用菌液。
1. 3. 3 脱氮率和硝化速率测定 将1.3.2获得的备用硝化菌液按6%的接种量接种至含有硝化液体培养基的三角瓶中，反硝化菌液按2%的接种量接种至含有反硝化液体培养基的三角瓶中（其中1瓶不接种，作为对照），设3个平行，结果取其平均值。3 d后参照曾庆武等（2008）的方法检测硝酸盐和亚硝酸盐含量，并计算脱氮率，以硝酸盐降解、亚硝酸盐积累及脱氮率为反硝化细菌的筛选指标，其中以脱氮率为主要指标。
10 d后利用比色法（国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会，2002）测定亚硝酸根量。硝化速率以单位时间、单位体积培养液转化亚硝酸根的量（亚硝酸根的减少量）表示（王小菊等，2013）。
式中，C1为不接种样品中亚硝酸根浓度（mg/L），C0为接种样品中亚硝酸根浓度（mg/L），t为培养时间（d）。
1. 3. 4 菌种鉴定 选取工作效率最高的硝化和反硝化细菌，参照蔡妙英和东秀珠（2001）的方法进行菌株形态和生理生化鉴定;同时，测定16S rDNA序列和构建系统发育进化树。
1. 3. 5 菌种特性分析
1. 3. 5. 1 温度对菌株特性的影响 硝化细菌按备用菌液6%的量接种至含有硝化培养液的三角瓶中（亚硝酸钠浓度1.0 g/L），反硝化细菌按备用菌液2%的量接种至含有反硝化培养液的三角瓶中。初始pH控制在7.0，温度依次设为10、20、30、35和40 ℃，以不加菌液的三角瓶为对照，每个试验3次重复。硝化细菌每24 h测定一次OD600指示菌株的生长情况，5 d后检测亚硝酸盐含量，并计算硝化速率;反硝化细菌每6 h测定一次OD600，同时测定硝酸盐和亚硝酸盐含量，并计算脱氮率。
1. 3. 5. 2 pH对菌株特性的影响 试验设计同1.3.5.1，初始温度控制在30 ℃，pH依次设为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。
1. 3. 5. 3 亚硝酸钠浓度对硝化特性的影响 试验设计同1.3.5.1，初始温度控制在30 ℃，pH控制在7.0，亚硝酸钠浓度依次设为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L。
1. 3. 5. 4 接种量对反硝化特性的影响 初始温度30 ℃，pH 7.0，接种量依次设为2%、4%、6%和8%。每6 h测定一次OD600，48 h后测定硝酸盐和亚硝酸盐含量，并计算脱氮率。
1. 3. 6 数据测定方法 硝酸盐含量采用紫外分光光度法测定;亚硝酸盐含量采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法测定;菌株的生长情况使用可见分光光度法测定。
16S rDNA序列测定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，所得测序拼接结果提交GenBank进行BLAST比对分析，获得同源性最高种属的16S rDNA序列，采用MEGA 5.2的邻位相连法（Neighbor-joining method）进行系统发育进化树分析，以确定菌株分类地位。
1. 4 统计分析
采用SPSS 22.0进行单因素方差分析（One-way ANVOA），并进行Duncan’s多重比较。在数据统计分析前，试验数据需進行正态性和方差齐性检验（Zar，1999）。
2 结果与分析
2. 1 硝化和反硝化细菌的筛选鉴定结果
由表3可知，湿地运行不同阶段菌株的工作效率有所不同。选择硝化速率最高的菌株，即湿地运行初期从再力花根基样品中筛选出的硝化细菌，命名为ZX2;选择反硝化速率最高的菌株，即湿地运行末期从再力花根基样品中筛选出的反硝化细菌，命名为ZF7。
硝化菌株ZX2的菌落生态特征及生理生化特征：菌体呈浅褐色球状，不透明，革兰氏染色阴性;葡萄糖氧化呈阳性，V-P试验及甲基红试验呈阳性，不能水解淀粉，不利用柠檬酸，不产H2S，不具运动性，过氧化氢试验、吲哚试验和氧化酶试验均呈阴性。根据菌株生态及生理生化特征，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》（布坎南和吉本斯，1984）及16S rDNA序列鉴定结果，可确定ZX2菌株为不动杆菌属（Acinetobacter）。对菌株ZX2进行系统发育进化树分析，结果（图2-A）表明，该菌株与不动杆菌属中的约氏不动杆菌（A. johnsonii）的遗传进化距离最近。
反硝化菌株ZF7的菌落生态特征及生理生化特征：菌体呈黄白色圆形，半透明，表面光滑，边缘整齐，革兰氏染色阴性;氧化酶试验呈阳性，精氨酸双水解酶和硝酸盐还原阳性，甲基红和V-P试验呈阴性，不液化明胶，不水解淀粉。根据菌株生态及生理生化特征，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》（布坎南和吉本斯，1984）及16S rDNA序列鉴定结果，可确定ZF7菌株为假单胞菌属（Pseudomonas）。对菌株ZF7进行系统发育进化树分析，结果（图2-B）表明，该菌株与恶臭假单胞菌（P. putida）的遗传进化距离最近。
2. 2 菌种特性分析结果
2. 2. 1 温度的影响 将菌株ZX2按照一定量接入硝化细菌培养液中，不同温度下菌株ZX2的硝化速率变化如图3所示。不同温度对硝化速率有显著影响（P<0.05，下同），在10～30 ℃范围内硝化速率随温度的升高呈显著上升趋势，但温度超过30 ℃后，硝化速率随温度的持续升高而呈下降趋势。该菌株最适宜的硝化温度为30 ℃，硝化速率达62.9 mg/（L·d）。
温度对菌株ZF7反硝化作用脱氮率的影响如图4所示，不同温度条件下，菌株ZF7的脱氮率随培养时间的延长总体上呈逐步上升后趋于稳定的变化趋势;48 h内菌株ZF7在35 ℃下反硝化能力最强，脱氮效果最佳，最高脱氮率达93.9%，温度过高或过低均会影响菌株反硝化作用的效率。 通过定时测定培养液OD600的变化来反映菌株的生长状态，菌株ZX2在不同温度下的生长变化如图5-A所示，不同温度条件下菌株ZX2的OD600随培养时间的延长总体呈先上升后趋于稳定的变化趋势，该菌株在30 ℃下细菌浓度最大（0.87），生长状态最佳;图5-B反映温度对菌株ZF7生长的影响情况，菌株ZF7在35 ℃下生长状态最佳，利用硝酸盐的能力最强，同时在30和35 ℃条件下，培养48 h OD600均可达1.00以上。
2. 2. 2 pH的影响 在不同pH条件下，菌株ZX2的硝化速率和细菌浓度呈先上升后下降的变化趋势，且pH为7.0时，菌株ZX2所表现的硝化速率和细菌浓度均最高，分别为68.4 mg/（L·d）和0.72（图6）。图7显示，在不同pH条件下，随着培养时间的延长，菌株ZF7的脱氮率和细菌浓度呈先上升后趋于稳定的变化趋势，pH为7.0时，菌株ZF7表现的脱氮率和细菌浓度均最高（分别为94.4%和1.39），培养至48 h，pH 6.0～8.0的脱氮率可维持在80.0%以上，且OD600大于0.80。
2. 2. 3 亚硝酸钠浓度对菌株ZX2硝化特性的影响 将菌株ZX2按照一定量接种至硝化细菌培养液中，在不同亚硝酸钠浓度下培养，硝化速率和细菌浓度OD600如图8所示，随着亚硝酸钠浓度的升高，硝化速率和细菌浓度总体呈先上升后下降的变化趋势;菌株ZX2在亚硝酸钠浓度为0.8 g/L时的生长状态最佳，硝化速率最高[65.6 mg/（L·d）]，当亚硝酸浓度高于1.2 g/L后，硝化速率和细菌浓度均迅速下降。
2. 2. 4 接种量对菌株ZF7反硝化特性的影响 图9显示，在48 h培养时间内，菌株ZF7在接种量为6%的条件下OD600始终最高，生长状态最佳（图9-A）;接种量对脱氮率的影响较小，4个接种量在培养48 h后脱氮率均达80.0%以上，其中6%接种量的脱氮率最高（94.5%），显著高于4%接种量，与2%和8%接种量的脱氮率差异不显著（P>0.05）（图9-B）。
3 讨论
3. 1 关于菌种鉴定结果
通过个体形态特征观察、生理生化鉴定及16S rDNA同源性比对分析，表明筛选的反硝化细菌属于假单胞菌属，硝化细菌属于不动杆菌属。目前，已报道假单胞菌属中具有反硝化功能的细菌包括产碱假单胞菌（P. pseudoalcaligenes）（楊基先等，2008）、恶臭假单胞菌（王弘宇等，2009）、施氏假单胞菌（P. stutzeri）（胡国元等，2012）及荧光假单胞菌（P. fluorescens）（连红民等，2015）。本研究得到反硝化菌株初步鉴定为假单胞菌属的恶臭假单胞菌。本研究对恶臭假单胞菌的反硝化特性进行分析，发现菌株ZF7具备很强的反硝化脱氮能力，在pH为7.0、温度为35 ℃，接种量为6%的条件下，其脱氮率可达94.5%，一定程度上加深了对恶臭假单胞菌在氮素净化特性的认识。
国内外对于具备硝化功能不动杆菌属的研究较少，但近几年不动杆菌属的异养硝化和好氧反硝化特点引起学者的广泛关注。目前，已报道不动杆菌属中具有氮净化功能的细菌包括鲍曼不动杆菌（A. baumannii）（孔庆鑫，2004）、溶血不动杆菌（A. haemolyticus）（刘玉香，2012）、约氏不动杆菌（刘小英等，2016）和琼氏不动杆菌（A. junii）（颜薇芝等，2017）。金少锋（2018）在池塘底部筛选的1株不动杆菌对氨氮和硝酸盐氮具有很好的去除能力，好氧反硝化能力处于较高水平。本研究筛选获得的硝化细菌初步鉴定为约氏不动杆菌，该菌株在适宜条件下去除氮素的效率可达68.4 mg/（L·d），120 h内对硝氮去除率可达49.2%，去除效率处于较高水平。刘小英等（2016）筛选的约氏不动杆菌在120 h内对硝氮去除率为56.9%，表明约氏不动杆菌有较强的硝化去氮能力，本研究结果与其相吻合。
3. 2 关于菌株ZF7反硝化特性
本研究结果表明，不同接种量下细菌浓度OD600在培养48 h后均可达0.70以上，4个接种量在培养48 h后脱氮率均在80.0%以上，初始接种量对于脱氮率的影响不明显，由此可得出菌株ZF7在OD600大于0.70后对脱氮率的影响不显著。颜薇芝等（2017）对1株不动杆菌的脱氮性能研究中也得到类似结果，在不同碳源情况下，当OD600大于1.00以上时，OD600的增加并未使脱氮效率提高。
3. 3 关于筛选菌株应用于氮素净化
已有学者通过构建小型盆栽人工湿地（陈朋，2009）或利用工业废水（赵志岚，2013）对实验室条件下筛选得到的硝化细菌或反硝化细菌的氮素净化效果进行相关研究，但目前国内外对于将筛选得到的硝化细菌或反硝化细菌应用于大型人工湿地净化效果的研究仍较少。本研究通过对复合垂直潜流人工湿地运行期间的pH和温度进行连续监测，pH变化范围基本在6.0～8.0，温度范围为19～33 ℃。菌株ZF7在该pH和温度范围内有很好的生长状态，OD600可达1.00以上，脱氮率在80.0%以上;菌株ZX2硝化速率在50.0～60.0 mg/（L·d）范围内波动。表明复合垂直潜流人工湿地运行期间，在pH和温度的适宜波动范围内筛选获得的反硝化细菌和硝化细菌能发挥其氮素净化效果，但具体效果仍需通过进一步的实际应用来检验。
4 结论
本研究从复合垂直潜流人工湿地运行过程中筛选得到氮素去除效果较好的硝化细菌和反硝化细菌，经鉴定硝化细菌属于不动杆菌属，反硝化细菌属于假单胞菌属。在pH 7.0、温度30 ℃、亚硝酸钠浓度0.8 g/L条件下硝化菌株ZX2的硝化能力最强;在pH 7.0、温度35 ℃，接种量6%条件下反硝化菌株ZF7的反硝化能力最强，即可为下一步强化人工湿地氮素净化功能提供备用菌株。 参考文献：
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（责任编辑 罗 丽）
关键词： 人工湿地;硝化细菌;反硝化细菌;氮素污染;含氮废水净化
中图分类号： S182 文獻标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）04-0736-09
Abstract：【Objective】A high-efficiency nitrifying bacteria and denitrifying bacteria was screened in the integrated vertical subsurface flow constructed wetlands system to reduce the harm of nitrogen pollution to the aquaculture water ecosystem， and provided a theoretical basis for strengthening the nitrogen purification function of the constructed wetlands.【Method】Samples were collected at different operational stages of the integrated vertical subsurface flow constructed wetland-pond recirculating aquaculture system. A selective media was used for targeted screening，then a high-efficiency nitrifying bacteria and a highly efficient denitrifying bacteria were selected for strain identification and studying separately the nitrification or denitrification characteristics of the corresponding strain. 【Result】The nitrifying strain ZX2 was initially identified as Acinetobacter and the denitrifying strain ZF7 was Pseudomonas based on its morphological observation， physio-logical and biochemical tests as well as 16S rDNA phylogenetic analysis. The nitrification ability of nitrifying strain ZX2 was the highest under the conditions of pH 7.0， temperature 30 ℃，and sodium nitrite concentration 0.8 g/L. OD600 value could reach above 0.80，and the nitrification rate reached 68.4 mg/（L·d）. Under the conditions of pH 7， temperature 35 ℃， the inoculum amount 6%，the denitrification capacity of denitrifying strain ZF7 was the highest. OD600 value could reach above 1.00， and the denitrification rate reached 94.5%. 【Conclusion】The nitrifying bacteria and denitrifying bacteria screened in this study have good effect on nitrogen purification， and can provide a spare strain for further strengthening the nitrogen purification function of the constructed wetlands.
Key words： constructed wetland; nitrifying bacteria; denitrifying bacteria;nitrogen pollution; nitrogen-containing wastewater purification 0 引言
【研究意义】发展高密度养殖和集约化管理是我国水产养殖业的发展趋势，高密度集约化养殖在促进渔业增效和渔民增收的同时，不可避免地带来养殖水环境污染问题。在水产养殖过程中，鱼类排泄物和未被消耗饲料的降解使得养殖水体中的氨氮剧增，氨氮和亚硝酸氮含量过高会对水产养殖动物产生毒害作用，甚至导致大规模死亡现象发生;此外，未经处理的养殖废水排放到自然水体中也会造成富营养化，严重影响水产养殖业的绿色可持续发展（梁新雪，2011;刘国锋等，2018）。因此，解决高密度水产养殖废水的净化问题迫在眉睫。【前人研究进展】目前水产养殖业中氮素净化应用较广泛的技术是微生物处理技术和生态处理技术。微生物处理技术是利用硝化或反硝化能力强的微生物对水产养殖废水进行净化，具有氮素净化作用的微生物主要有硝化细菌（王薇等，2007）、红球菌属（张艳等，2007）、产碱杆菌属（王弘宇等，2009）、固氮弧菌属（王小菊等，2013）、假单胞菌属（杨浩锋等，2014）、不动杆菌属（颜薇芝等，2017）等，但该技术在处理效果、处理成本、推广适用性等方面尚有待进一步探究。在生态处理技术方面，已有研究表明人工湿地中存在相当数量与氮素净化相关的菌种（雷旭等，2015），且硝化细菌和反硝化细菌分布状况在一定程度上受湿地结构和湿地植物的影響（王爱平等，2010）;研究显示，表面流人工湿地（鲁敏等，2012）、水平潜流人工湿地（李宝华等，2013）及垂直潜流人工湿地（董玉峰，2014）对水体中的氮磷、重金属等有较稳定的处理能力，但随着使用年限的增长，人工湿地的净化效率和稳定性必然会下降（尹炜等，2004）。【本研究切入点】复合垂直潜流人工湿地作为生态处理技术的一种典型应用模式，其对于水产养殖废水氮素的去除效果明显（董玉峰，2014）。微生物的硝化和反硝化作用是去除氮素的最主要途径（张鸿等，1999），目前研究报道具有氮素净化作用的微生物种类较多，但关于复合垂直潜流人工湿地中硝化和反硝化细菌的筛选、鉴定及其特性分析的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过特定生境下硝化及反硝化细菌的筛选、鉴定、分析及应用，实现人工湿地氮素处理效率的提升，以期为加强人工湿地氮素净化功能提供技术支撑。
1 材料与方法
1. 1 试验地点及概况
1. 1. 1 复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统结构 试验地点位于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心大浦科研试验基地。复合垂直潜流人工湿地主要由5个单元构成，即沉淀池、上行垂直潜流湿地、下行垂直潜流湿地、预警池及清水池，面积约600 m2。湿地基质为直径8～10 cm大鹅卵石、4～6 cm小鹅卵石和2～4 cm生物陶粒。湿地植物为生长周期较长的梭鱼草（Pontederia cordata）和再力花（Thalia dealbata），上行池主要种植再力花，下行池种植梭鱼草，再力花株距60 cm，梭鱼草株距40 cm，种植时间为5月初。池塘养殖鲫鱼、团头鲂、鲢鱼和鳙鱼，密度依次为0.011、0.136、0.020和0.006 kg/m3，每天上午9：00—10：00和下午16：00—17：00投喂饲料。试验于2017年湿地运行的6—10月进行。复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统结构如图1所示。
1. 1. 2 复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统基本数据 人工湿地水力负荷（HLR）和水力停留时间（HRT）根据公式计算得出。
式中，S为人工湿地主体面积（m2），W为污水设计流量（100 m3/d），γ为人工湿地孔隙度（%），h为人工湿地深度（m）。
复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统基本数据见表1，不同时间段的人工湿地温度、pH和溶氧量见表2。
1. 2 样品采集及培养基制备
1. 2. 1 样品采集 在湿地运行初期（6月底）、中期（8月底）和末期（10月底），采用三点取样法在上行池和下行池进行采样，分别采集湿地植物根系、根系附近基质及植物附近水样，每个取样点选取3株相邻植株进行平行取样，装入取样袋，置于4 ℃环境中冷藏待用。
1. 2. 2 培养基制备 硝化液体富集培养基：亚硝酸钠1.0 g、硫酸镁0.5 g、碳酸钠1.0 g和硫酸亚铁0.4 g，加蒸馏水定容至l L。该培养液在灭菌前用氢氧化钠调pH至7.5～8.0，再加0.5 g磷酸氢钾（磷酸盐单独灭菌，且在培养液冷却至室温后加入）（王小菊等，2013）。
反硝化液体富集培养基：硝酸钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、磷酸氢钾0.5 g和酒石酸钾钠20.0 g，加蒸馏水定容至1 L;pH 7.0～7.5（曾庆武等，2008）。
平板分离培养基：在富集培养基中加入约1.8%琼脂糖即可。
纯化培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g和氯化钠10.0 g，加水定容至1 L;氢氧化钠调pH至7.0。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 细菌筛选 取湿地水样10 mL、基质若干及适量植物根系加入到含100 mL灭菌蒸馏水的250 mL三角烧瓶中，30 ℃下170 r/min振荡30 min后，取10 mL上清液加入到含100 mL硝化液体培养基的250 mL三角瓶中，另取10 mL上清液加入到含100 mL反硝化液体培养基的250 mL三角瓶中（夏辉和梁运祥，2006）;在30 ℃、170 r/min条件下，硝化培养液振荡富集培养10 d（每2 d吸取适量硝化富集液，在白瓷板上与二苯胺试剂发生显色反应，根据显色反应判断液体培养基中亚硝酸根的减少和硝酸根的生成状况）（胡朝松等，2009），反硝化培养液静置密闭富集培养3 d。选取颜色变深的硝化培养液和富集培养3 d后的反硝化培养液按稀释分离方法稀释至10-2、10-3和10-4 3个稀释度，分别在硝化细菌和反硝化细菌固体培养基上涂布分离，硝化固体培养基在30 ℃恒温培养箱中培养10 d左右，反硝化固体培养基培养3 d左右。挑选8株典型单菌落，经溶菌肉汤（LB）培养基多次划线纯化，转入斜面保存备用。 1. 3. 2 备用菌液培养 将上述分离得到且保存在斜面的单菌株分别接种到含20 mL LB液体培养基的100 mL三角瓶中，28 ℃下170 r/min振荡培养24 h，作为备用菌液。
1. 3. 3 脱氮率和硝化速率测定 将1.3.2获得的备用硝化菌液按6%的接种量接种至含有硝化液体培养基的三角瓶中，反硝化菌液按2%的接种量接种至含有反硝化液体培养基的三角瓶中（其中1瓶不接种，作为对照），设3个平行，结果取其平均值。3 d后参照曾庆武等（2008）的方法检测硝酸盐和亚硝酸盐含量，并计算脱氮率，以硝酸盐降解、亚硝酸盐积累及脱氮率为反硝化细菌的筛选指标，其中以脱氮率为主要指标。
10 d后利用比色法（国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会，2002）测定亚硝酸根量。硝化速率以单位时间、单位体积培养液转化亚硝酸根的量（亚硝酸根的减少量）表示（王小菊等，2013）。
式中，C1为不接种样品中亚硝酸根浓度（mg/L），C0为接种样品中亚硝酸根浓度（mg/L），t为培养时间（d）。
1. 3. 4 菌种鉴定 选取工作效率最高的硝化和反硝化细菌，参照蔡妙英和东秀珠（2001）的方法进行菌株形态和生理生化鉴定;同时，测定16S rDNA序列和构建系统发育进化树。
1. 3. 5 菌种特性分析
1. 3. 5. 1 温度对菌株特性的影响 硝化细菌按备用菌液6%的量接种至含有硝化培养液的三角瓶中（亚硝酸钠浓度1.0 g/L），反硝化细菌按备用菌液2%的量接种至含有反硝化培养液的三角瓶中。初始pH控制在7.0，温度依次设为10、20、30、35和40 ℃，以不加菌液的三角瓶为对照，每个试验3次重复。硝化细菌每24 h测定一次OD600指示菌株的生长情况，5 d后检测亚硝酸盐含量，并计算硝化速率;反硝化细菌每6 h测定一次OD600，同时测定硝酸盐和亚硝酸盐含量，并计算脱氮率。
1. 3. 5. 2 pH对菌株特性的影响 试验设计同1.3.5.1，初始温度控制在30 ℃，pH依次设为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。
1. 3. 5. 3 亚硝酸钠浓度对硝化特性的影响 试验设计同1.3.5.1，初始温度控制在30 ℃，pH控制在7.0，亚硝酸钠浓度依次设为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L。
1. 3. 5. 4 接种量对反硝化特性的影响 初始温度30 ℃，pH 7.0，接种量依次设为2%、4%、6%和8%。每6 h测定一次OD600，48 h后测定硝酸盐和亚硝酸盐含量，并计算脱氮率。
1. 3. 6 数据测定方法 硝酸盐含量采用紫外分光光度法测定;亚硝酸盐含量采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法测定;菌株的生长情况使用可见分光光度法测定。
16S rDNA序列测定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，所得测序拼接结果提交GenBank进行BLAST比对分析，获得同源性最高种属的16S rDNA序列，采用MEGA 5.2的邻位相连法（Neighbor-joining method）进行系统发育进化树分析，以确定菌株分类地位。
1. 4 统计分析
采用SPSS 22.0进行单因素方差分析（One-way ANVOA），并进行Duncan’s多重比较。在数据统计分析前，试验数据需進行正态性和方差齐性检验（Zar，1999）。
2 结果与分析
2. 1 硝化和反硝化细菌的筛选鉴定结果
由表3可知，湿地运行不同阶段菌株的工作效率有所不同。选择硝化速率最高的菌株，即湿地运行初期从再力花根基样品中筛选出的硝化细菌，命名为ZX2;选择反硝化速率最高的菌株，即湿地运行末期从再力花根基样品中筛选出的反硝化细菌，命名为ZF7。
硝化菌株ZX2的菌落生态特征及生理生化特征：菌体呈浅褐色球状，不透明，革兰氏染色阴性;葡萄糖氧化呈阳性，V-P试验及甲基红试验呈阳性，不能水解淀粉，不利用柠檬酸，不产H2S，不具运动性，过氧化氢试验、吲哚试验和氧化酶试验均呈阴性。根据菌株生态及生理生化特征，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》（布坎南和吉本斯，1984）及16S rDNA序列鉴定结果，可确定ZX2菌株为不动杆菌属（Acinetobacter）。对菌株ZX2进行系统发育进化树分析，结果（图2-A）表明，该菌株与不动杆菌属中的约氏不动杆菌（A. johnsonii）的遗传进化距离最近。
反硝化菌株ZF7的菌落生态特征及生理生化特征：菌体呈黄白色圆形，半透明，表面光滑，边缘整齐，革兰氏染色阴性;氧化酶试验呈阳性，精氨酸双水解酶和硝酸盐还原阳性，甲基红和V-P试验呈阴性，不液化明胶，不水解淀粉。根据菌株生态及生理生化特征，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》（布坎南和吉本斯，1984）及16S rDNA序列鉴定结果，可确定ZF7菌株为假单胞菌属（Pseudomonas）。对菌株ZF7进行系统发育进化树分析，结果（图2-B）表明，该菌株与恶臭假单胞菌（P. putida）的遗传进化距离最近。
2. 2 菌种特性分析结果
2. 2. 1 温度的影响 将菌株ZX2按照一定量接入硝化细菌培养液中，不同温度下菌株ZX2的硝化速率变化如图3所示。不同温度对硝化速率有显著影响（P<0.05，下同），在10～30 ℃范围内硝化速率随温度的升高呈显著上升趋势，但温度超过30 ℃后，硝化速率随温度的持续升高而呈下降趋势。该菌株最适宜的硝化温度为30 ℃，硝化速率达62.9 mg/（L·d）。
温度对菌株ZF7反硝化作用脱氮率的影响如图4所示，不同温度条件下，菌株ZF7的脱氮率随培养时间的延长总体上呈逐步上升后趋于稳定的变化趋势;48 h内菌株ZF7在35 ℃下反硝化能力最强，脱氮效果最佳，最高脱氮率达93.9%，温度过高或过低均会影响菌株反硝化作用的效率。 通过定时测定培养液OD600的变化来反映菌株的生长状态，菌株ZX2在不同温度下的生长变化如图5-A所示，不同温度条件下菌株ZX2的OD600随培养时间的延长总体呈先上升后趋于稳定的变化趋势，该菌株在30 ℃下细菌浓度最大（0.87），生长状态最佳;图5-B反映温度对菌株ZF7生长的影响情况，菌株ZF7在35 ℃下生长状态最佳，利用硝酸盐的能力最强，同时在30和35 ℃条件下，培养48 h OD600均可达1.00以上。
2. 2. 2 pH的影响 在不同pH条件下，菌株ZX2的硝化速率和细菌浓度呈先上升后下降的变化趋势，且pH为7.0时，菌株ZX2所表现的硝化速率和细菌浓度均最高，分别为68.4 mg/（L·d）和0.72（图6）。图7显示，在不同pH条件下，随着培养时间的延长，菌株ZF7的脱氮率和细菌浓度呈先上升后趋于稳定的变化趋势，pH为7.0时，菌株ZF7表现的脱氮率和细菌浓度均最高（分别为94.4%和1.39），培养至48 h，pH 6.0～8.0的脱氮率可维持在80.0%以上，且OD600大于0.80。
2. 2. 3 亚硝酸钠浓度对菌株ZX2硝化特性的影响 将菌株ZX2按照一定量接种至硝化细菌培养液中，在不同亚硝酸钠浓度下培养，硝化速率和细菌浓度OD600如图8所示，随着亚硝酸钠浓度的升高，硝化速率和细菌浓度总体呈先上升后下降的变化趋势;菌株ZX2在亚硝酸钠浓度为0.8 g/L时的生长状态最佳，硝化速率最高[65.6 mg/（L·d）]，当亚硝酸浓度高于1.2 g/L后，硝化速率和细菌浓度均迅速下降。
2. 2. 4 接种量对菌株ZF7反硝化特性的影响 图9显示，在48 h培养时间内，菌株ZF7在接种量为6%的条件下OD600始终最高，生长状态最佳（图9-A）;接种量对脱氮率的影响较小，4个接种量在培养48 h后脱氮率均达80.0%以上，其中6%接种量的脱氮率最高（94.5%），显著高于4%接种量，与2%和8%接种量的脱氮率差异不显著（P>0.05）（图9-B）。
3 讨论
3. 1 关于菌种鉴定结果
通过个体形态特征观察、生理生化鉴定及16S rDNA同源性比对分析，表明筛选的反硝化细菌属于假单胞菌属，硝化细菌属于不动杆菌属。目前，已报道假单胞菌属中具有反硝化功能的细菌包括产碱假单胞菌（P. pseudoalcaligenes）（楊基先等，2008）、恶臭假单胞菌（王弘宇等，2009）、施氏假单胞菌（P. stutzeri）（胡国元等，2012）及荧光假单胞菌（P. fluorescens）（连红民等，2015）。本研究得到反硝化菌株初步鉴定为假单胞菌属的恶臭假单胞菌。本研究对恶臭假单胞菌的反硝化特性进行分析，发现菌株ZF7具备很强的反硝化脱氮能力，在pH为7.0、温度为35 ℃，接种量为6%的条件下，其脱氮率可达94.5%，一定程度上加深了对恶臭假单胞菌在氮素净化特性的认识。
国内外对于具备硝化功能不动杆菌属的研究较少，但近几年不动杆菌属的异养硝化和好氧反硝化特点引起学者的广泛关注。目前，已报道不动杆菌属中具有氮净化功能的细菌包括鲍曼不动杆菌（A. baumannii）（孔庆鑫，2004）、溶血不动杆菌（A. haemolyticus）（刘玉香，2012）、约氏不动杆菌（刘小英等，2016）和琼氏不动杆菌（A. junii）（颜薇芝等，2017）。金少锋（2018）在池塘底部筛选的1株不动杆菌对氨氮和硝酸盐氮具有很好的去除能力，好氧反硝化能力处于较高水平。本研究筛选获得的硝化细菌初步鉴定为约氏不动杆菌，该菌株在适宜条件下去除氮素的效率可达68.4 mg/（L·d），120 h内对硝氮去除率可达49.2%，去除效率处于较高水平。刘小英等（2016）筛选的约氏不动杆菌在120 h内对硝氮去除率为56.9%，表明约氏不动杆菌有较强的硝化去氮能力，本研究结果与其相吻合。
3. 2 关于菌株ZF7反硝化特性
本研究结果表明，不同接种量下细菌浓度OD600在培养48 h后均可达0.70以上，4个接种量在培养48 h后脱氮率均在80.0%以上，初始接种量对于脱氮率的影响不明显，由此可得出菌株ZF7在OD600大于0.70后对脱氮率的影响不显著。颜薇芝等（2017）对1株不动杆菌的脱氮性能研究中也得到类似结果，在不同碳源情况下，当OD600大于1.00以上时，OD600的增加并未使脱氮效率提高。
3. 3 关于筛选菌株应用于氮素净化
已有学者通过构建小型盆栽人工湿地（陈朋，2009）或利用工业废水（赵志岚，2013）对实验室条件下筛选得到的硝化细菌或反硝化细菌的氮素净化效果进行相关研究，但目前国内外对于将筛选得到的硝化细菌或反硝化细菌应用于大型人工湿地净化效果的研究仍较少。本研究通过对复合垂直潜流人工湿地运行期间的pH和温度进行连续监测，pH变化范围基本在6.0～8.0，温度范围为19～33 ℃。菌株ZF7在该pH和温度范围内有很好的生长状态，OD600可达1.00以上，脱氮率在80.0%以上;菌株ZX2硝化速率在50.0～60.0 mg/（L·d）范围内波动。表明复合垂直潜流人工湿地运行期间，在pH和温度的适宜波动范围内筛选获得的反硝化细菌和硝化细菌能发挥其氮素净化效果，但具体效果仍需通过进一步的实际应用来检验。
4 结论
本研究从复合垂直潜流人工湿地运行过程中筛选得到氮素去除效果较好的硝化细菌和反硝化细菌，经鉴定硝化细菌属于不动杆菌属，反硝化细菌属于假单胞菌属。在pH 7.0、温度30 ℃、亚硝酸钠浓度0.8 g/L条件下硝化菌株ZX2的硝化能力最强;在pH 7.0、温度35 ℃，接种量6%条件下反硝化菌株ZF7的反硝化能力最强，即可为下一步强化人工湿地氮素净化功能提供备用菌株。 参考文献：
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