【摘 要】
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目的 构建叉头盒蛋白A1 (Forkhead-boxA1,FOXA1)的pFLAG-CMV4-FOXA1表达载体,为探究FOXA1功能和作用机制奠定基础.方法 设计引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reactio
【机 构】
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100069 首都医科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所
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目的 构建叉头盒蛋白A1 (Forkhead-boxA1,FOXA1)的pFLAG-CMV4-FOXA1表达载体,为探究FOXA1功能和作用机制奠定基础.方法 设计引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增FOXA1的cDNA全长序列,产物电泳回收.随后将pFLAG-CMV载体进行酶切消化,与回收的FOXA1的cDNA全长序列连接.将构建好的质粒转化到DH5a大肠埃希菌中,将验证正确的质粒进行提取纯化,然后将其转染至FOXA1阴性细胞系HEK293T.HEK293T细胞转染pFLAG-CMV4-FOXA1载体24 h后,收集其mRNA和总蛋白.通过实时荧光定量PCR检测mRNA的变化,同时采用免疫印迹法检测蛋白质表达情况.结果 测序结果显示序列正确,载体构建成功;实时荧光定量PCR结果显示在HEK293T细胞中,FOXA1基因的mRNA水平显著增加,免疫印迹结果显示FOXA1蛋白正确表达.结论 成功构建了人pFLAG-CMV4-FOXA1,并可在HEK293T细胞内正确且高效表达,为后续FOXA1功能和机制的研究提供了重要的工具.
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