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摘 要 黄龙病一直危害着柑橘生产，做好黄龙病的识别和防治是柚子生产中的一项重要任务。亚洲柑橘木虱和非洲木虱是黄龙病传播的主要媒介，科学适量释放捕食性天敌瓢虫等，与化学防治相结合可有效防控木虱。对于疑似黄龙病病株，可采取简易的“黄龙病检测试剂”检测，该方法简单易行、成本低廉、准确率高，对于普通种植户是经济可行的识别方法。
关键词 柚树;柑橘黄龙病;识别与鉴定;防治措施
中图分类号：S436.661.1 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.1.012
柑橘黄龙病在我国最早发现，莱因金（Reinking）1919年记述了华南柑橘上的一种黄叶斑驳病。陈其暴1943年首次报道，柑橘黄龙病于1938—1941年在广东潮汕地区严重发生，因广东潮汕地区称梢为“龙”，故得名黄龙病[1]。我国植物病理学家林孔湘教授首次证实该病害是一种传染性病害[2]。1995 年，在中国福州举行的第13届国际柑橘病毒学家会议（International Organization of Citrus Virologists， IOCV）正式将黄龙病命名为“Huanglongbing”，简称HLB，而将国外曾经使用的“柑橘青果病（Citrus greening）”等作为地方名称[3]。
专家们研究发现，甜橙、橘等为黄龙病高感品种，柚类属于中感品种[1]。尽管如此，黄龙病对柚子产业的危害仍然非常巨大。笔者通过对云南省瑞丽市柚子种植大户的调研发现，一定规模以上柚子地块，均出现黄龙病病株或疑似黄龙病症状病株。柚树感染黄龙病后，全年均可表现症状，在柚园抽发夏梢和秋梢期间发病最多，其次是春梢。发病伊始，柚树新梢叶停止转绿，在树冠顶部出现明显的“黄梢”现象。叶片呈现斑驳型或花叶型黄化，其中斑驳型黄化最为典型，黄化症状从叶脉基部和侧脉附近出现，然后逐渐扩展形成不规则、大小不一、形状各异的斑驳型黄斑。柚树一旦感染黄龙病，轻者影响产量和品质，重者将造成“树死园毁”。田间农事作业中，黄龙病的症状常常与柚园管理不善造成的现象相近，普通农户难以有效甄别。再者，由于时间、费用等诸多因素的限制和影响，几乎无法做到将样本送到高等院校和研究机构进行鉴定。由此可见，对黄龙病的识别和防治非常重要。筆者从实际生产出发，讨论一种适宜柚树种植普通农户应用的黄龙病识别和防治方法，希望对柚子种植户有一定的帮助。
1 黄龙病病原菌及其寄主
1.1 黄龙病病原菌
人类对柑橘黄龙病病原菌的认知经历了“病原生理因子、病毒阶段”“病原类菌原体、类立克次氏阶段”“病原类细菌阶段”，直到1984年，Garnier等通过电镜观察发现黄龙病病原的膜结构外壁和内壁间存在肽聚糖，与革兰氏阴性细菌的细胞壁结构相似，故认为黄龙病病原是一种革兰氏阴性细菌[4]。1995年，黄龙病病原归为候选的薄壁菌门韧皮部杆菌属（Candidatus liberibacter sp），属于真细菌的变形菌纲（ Proteobacteriacea）α亚纲成员。根据黄龙病病原物对热的敏感性、虫媒和地理分布，将其分为3个种：亚洲种（Candidatus liberibacter asiaticus，Las），其传媒昆虫为亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）;非洲种（Candidatus liberibacter africanus，Laf），其传媒昆虫为非洲柑橘木虱（Trioza erytreae）;美洲种（Candidatus liberibacter americanus，Lam），其传媒昆虫为亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）。Las属于耐热型，发病的适合温度为27～32 ℃，常在低海拔炎热地区存在;Laf属于热敏感型，发病适合温度为22～25 ℃，只能在海拔700 m以上地区种植的柑橘上发现;Lam也属于耐热型，发病适合温度为27～32 ℃，在症状表现上更接近于亚洲种[5]。
1.2 黄龙病发生与流行规律
黄龙病传播途径主要是通过带病接穗、苗木及柑橘木虱虫媒进行传播，也可通过草地菟丝子（Cuscuta chinensis）将黄龙病菌从柑橘传到草本植物长春花（Catharanthus roseus）上。病原菌主要在田间韧皮部组织中越冬，初侵染源为田间病株、带菌苗木及带菌柑橘木虱。
在田间传播黄龙病的柑橘木虱主要是亚洲柑橘木虱和非洲木虱，二者喜食嫩芽，卵大多产在嫩叶边缘，若虫生活在叶子边缘的背侧或者叶脉和叶柄部。非洲木虱的若虫会植入叶片背部形成凹巢，有突起状，当成长为成虫后，巢空，突起状仍在。而亚洲柑橘木虱一般不会产生突起状，但严重时叶片扭曲[6]。
1.3 黄龙病寄主
柑橘黄龙病的植物寄主主要是柑橘属及芸香科柑橘亚科近缘属植物。除芸香科植物外，柑橘黄龙病细菌还可以通过菟丝子传播给长春花、烟草和番茄等非芸香科植物。长春花染病后的症状比柑橘更明显，病菌密度更高，因此，常被用作黄龙病草本指示植物[1， 5]。
2 柚树黄龙病的识别方法
2.1 田间识别法
田间识别法主要是依据新梢的成熟期症状表现来识别黄龙病，如果当年新梢出现黄梢和叶片出现斑驳症状，很多种植户基本上会把该柚树判定为疑似黄龙病病树。但是由于黄龙病的症状很容易和其他由于管理不善、营养不良或病虫害引起的症状相混淆，特别是已经感染黄龙病但尚未表现明显症状的植株难以依据症状做出准确的判定。
2.2 实验室鉴定法
实验室判定法是研究、检疫黄龙病的主要方法，经过柑橘学者多年的研究，先后报道了电镜观察法、血清学诊断法、核酸探针杂交法及PCR扩增法[3， 6]。但是由于时间、费用等因素，在实际生产中，柚树种植户几乎不会送样本到高等院校和科研院所进行实验室判定。 1）电镜观察法。电镜观察可以把黄龙病菌的形态、大小及细菌体的壁膜结构等特征观察清楚，做出的诊断非常准确，是一种重要的鉴定和诊断方法。
2）血清学诊断法。由于黄龙病菌目前还不能进行人工培养，不能获得病菌纯培养，因此要制备高效的黄龙病菌单克隆抗体比较困难。即便已获得，但因其单克隆抗体专一性过强，难以适应不同地域的黄龙病菌变异菌株，可能会发生漏检，故其应用与推广也受到很大的限制。
3）核酸探针杂交法。核酸分子杂交的原理是：具一定同源性的2条核酸单链间核苷酸键有亲和力，在一定的条件下，这2条单链按碱基互补原则退火形成双链。杂交的双方是待测核酸及标记探针，标记物常选用放射性同位素或非放射性物质如生物素等。杂交后，通过标记探针放射自显影或尼龙膜显带就可达到检测的目的。核酸分子杂交技术的优点是：检测快速专一，灵敏度高达ng级。但由于分子探针杂交过程复杂、需要大量DNA等，限制了该技术的广泛应用。
4）PCR扩增法。目前，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术因具有快速简便、灵敏度高、特异性强等优点，已成为国际上最为可靠并广泛采用的检测方法。在常规PCR基础上发展出了灵敏度更高，特异性更强的巢式PCR技术（nested-PCR）。为克服常规PCR和nested-PCR不能准确定量、容易交叉污染和容易产生假阳性问题，又逐步发展出了实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR）技术。该技术融合了PCR和DNA探针杂交技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术作为核酸定量的手段，以其高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、污染少等优点，实现了PCR从定性到定量的飞跃，在柑橘黄龙病检测中得到广泛应用。
2.3 指示物鉴定法[1， 3]
指示植物鉴定是将可疑的枝条嫁接到容易感病的指示植物上，接种3～4个月后观察其发病情况。虽然指示植物嫁接鉴定相对于田间诊断法更为准确，但周期太长，不利于快速检测。
1）木本指示物鉴定。不同地区使用的指示寄主也不同，如南非用伏令夏橙，印度用莱檬作为黄龙病的指示植物，而在我国多用椪柑作为黄龙病的指示植物，椪柑嫁接后在25～32 ℃条件下，3个月左右叶片出现斑駁黄化。
2）草本指示物鉴定。在防虫隔离网室内播种草本指示植物长春花，待植株生长至4～6片叶时，采用大花菟丝子（Cuscuta reflexa）或草地菟丝子（Cuscuta campestris）接种。长春花和菟丝子接种3个月左右开始表现明显症状，初为下部叶片最先从叶脉处开始黄化，上部叶片仍表现为健康的绿色，之后整个叶片逐渐均匀黄化，并且黄化的叶片由下而上逐渐增多，最后黄化叶片逐渐脱落。
3）木虱传毒鉴定。从田间怀疑病株上，采木虱50～100头，接到指示植物上，或采用饲养的4龄、5龄若虫或成虫，在病株上吸毒30 min，保持8～12 d，整个生活期保持传染性，最后观察指示物的变化。
2.4 试剂鉴定法
笔者采用“黄龙病检测试剂（专利号：201820411023.5）”在柚树生产中进行试验，并对其准确性进行了验证，认为，该试剂可以与田间识别法结合使用，对柚树黄龙病的判断增加了准确性，同时能达到快速和低成本目的。
2.4.1 准确性验证
笔者在“高原特色作物（瑞丽柚子）科技示范庄园”项目中，对3002株琯溪蜜柚进行高接换种时（换成瑞丽水晶柚），在瑞丽水晶柚园内采了4个水晶柚枝条样品送华中农业大学进行黄龙病（HLB）、裂皮病（CEVd）、衰退病（CTV）和碎叶病（CTLV）实验室鉴定（2017年12月5日送样，2017年12月26日出报告）。
为了验证“黄龙病检测试剂”的准确性，笔者在原采样的同柚园同树上采样，用“黄龙病检测试剂”进行黄龙病的快速检测，检测结果与原华中农业大学鉴定结果汇总于表1。
从表1的对比发现，检测结果一致。但是，在“黄龙病检测试剂”使用中存在不少问题，CSM20171111-1和YLY20171111-1样品树上采下的新梢，检测结果均为阴性，而老叶检测的结果为阳性，因此，使用“黄龙病检测试剂”的正确方法是：每一株被检柚树，要采下10片以上老叶或有症状的叶片分别检测，只要有一个叶片出现阳性（+），就判定该株柚树为黄龙病病树。如果检测的叶片太少，“黄龙病检测试剂”检测的指导意义就不大。
2.4.2 黄龙病检测试剂应用案例
笔者在瑞丽市布衣农庄柚园（E 97°44′32″，N 23°57′39″）中，对疑似黄龙病的12棵柚树采样检测，每棵树采下老叶或有斑驳状的叶片10片，每棵树检测10次，结果有4棵数被判定为阳性（+），属黄龙病病树，其余8棵疑似黄龙病的柚树判定为非黄龙病病树。通过检查根系，8棵非黄龙病病树根系已经出现根腐，应为根腐所致黄化现象。
3 黄龙病防治方法
3.1 “三步法”
迄今为止，柑橘黄龙病菌不能在离体条件下获得纯培养，因此对该病的研究受到制约[1]。在市场上也找不到一种药剂直接杀死黄龙病的病原菌（Candidatus liberibacter sp），因此，对黄龙病的防治一直是采用我国植物病理学家林孔湘教授提出“三步法”[2]，即使用无毒繁殖材料，铲除病原（树）和防控木虱。该方法至今仍然是黄龙病防控的不二方法，已为世界各国普遍采用。
3.2 严格实施植物检疫及建立无病苗圃，培育无病苗木
要防止黄龙病从疫区传染到新区，加强植物检疫是最重要的手段。瑞丽市政府正在引导和打造弄岛柚子庄园，政府介入，严格实施植物检疫制度，是确保弄岛柚子庄园绿色、可持续发展的重要手段。 培育无病苗木是预防柑橘黄龙病的基础保障。所以，农业科研院所及苗木培育公司须建立无病苗圃，无病苗圃的选点要远离黄龙病疫区或者与黄龙病疫区隔离。除严格选择无病的母株外，繁殖材料还要通过消毒处理。接穗或苗木用49 ℃湿热空气处理50 min，或接穗用47～50 ℃热水间歇热处理6～12 min，每24 h一次，共处理3次，或者接穗用四霉素与噁霉灵混合液灭菌消毒，浸泡1～2 h，然后用清水冲洗，晾干备用[7]，可有效脱除黄龙病菌。
3.3 坚决防除柑橘木虱
柑橘木虱属半翅目（Hemiptera）木虱科（Psyllidae），主要危害芸香科植物，柑橘木虱的寄主植物有：柑橘、黄皮、九里香、枸杞和橙等。其中，木虱在柑橘上危害最重，是传播柑橘黄龙病主要的自然媒介[8]。传播黄龙病的木虱主要是亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）和非洲柑橘木虱（Trioza erytreae）。近年来在云南省德宏州发现的柚喀木虱（Cacopsylla citrisuga Yang&Li）也是黄龙病的传播媒介[9]。3种木虱成虫的形态特征见图1。
防除传播黄龙病的这3种木虱，是有效防治柚树黄龙病的重要环节。
3.3.1 利用捕食性天敌瓢虫防治柑橘木虱
据报道，在美国佛罗里达，六斑盘瓢虫、双带盘瓢虫、血红斑瓢虫、楔斑溜瓢虫、墨西哥瓢虫、奇氏光缘瓢虫和异色瓢虫是柑橘木虱的主要捕食性天敌，在自然条件下，它们对柑橘木虱卵和若虫的捕食量累计可达80%～100%[10]。广东省昆虫研究所庞虹研究发现，六斑月瓢虫、红星盘瓢虫和龟纹瓢虫不仅可以捕食爬行能力较弱的木虱若虫，还可以捕食活动能力较强的木虱成虫，其中红基盘瓢虫在个别果园对柑橘木虱若虫的捕食量可以超过 80%，几种瓢虫在自然界中对柑橘木虱起着重要的控制作用[11]。
所以，在柚园科学适量释放捕食性天敌瓢虫，可以降低柑橘木虱的虫口基数，有利于柚园防除柑橘木虱，但必须与化学防治有机结合，才能达到事半功倍的效果。
3.3.2 化学防治柑橘木虱
化学防治柑橘木虱目前仍然是柚子生产中的主要手段，其技术要领是：选择有效的农药品种，科学配制农药，减少或延缓木虱对农药抗药性;选择好防治时期，避免黄龙病的传播。
3.3.2.1推荐用下列农药品种防治柑橘木虱
1）脲类杀虫剂：虱螨脲（Lufenuron）;2）拟除虫菊酯类杀虫剂：溴氰菊酯（Deltamethrin）、联苯菊酯（Bifenthrin）、甲氰菊酯（Fenpropathrin）、高效氯氟氰菊酯（Lambda-cyhalothrin）等;3）第二代烟碱类杀虫剂：噻虫嗪（ Thiamethoxam ）、噻虫胺（Clothianidin）等;4）大环内酯类杀虫剂：阿维菌素（Abamectin）、多杀霉素（Spinosad）等;5）噻二嗪类杀虫剂：噻嗪酮（Buprofezin）等;6）有机磷类杀虫剂：毒死蜱（Chlorpyrifos）等;7）吡啶类杀虫/杀螨剂：吡虫啉（Imidacloprid）、啶虫脒（Acetamiprid）等;8）苯甲酰胺类杀虫剂：氯虫苯甲酰胺（Chlorantraniliprole）等;9）生物源杀虫/杀螨剂：甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（Emamectin benzoate）等;10）昆虫生长调节剂：吡丙醚（Pyriproxyfen）。
3.3.2.2化学防治时期
柑橘木虱一般每年发生6～12代。成虫当年在柚子叶背越冬，来年3月上中旬在春梢上产卵繁衍，第一代发生于3月中旬至5月上旬，最后一代发生于10月上旬至12月上旬。只要有嫩梢抽发，成虫即产卵，嫩梢数量决定世代的多少。伴随春梢、夏梢和秋梢的抽发高峰，若虫出现3个发生高峰，因此化防时期为这三季梢的抽发期。
3.4 挖除病树
国内外实践证明，及时挖除病株是有效防控黄龙病的关键手段，仅剪除病枝对防治黄龙病是无效的。挖除病树后，在穴内撒施适量的生石灰，在太阳下暴晒10～20 d后，可以重新补苗。
4 小结与讨论
由于黄龙病潜伏期较长，柚树染病初期不出现症状或症状不明显，因此，如何及早发现病树就具有挑战性。实验室鉴定法目前主要是专家学者在研究中使用，柚树种植户即使是大户，也很难应用实验室鉴定法来发现柚树黄龙病;指示物鉴定法由于时间太长，在笔者的调查中没有发现种植户使用，也成为了专家学者使用的方法。本文推荐田间识别法与“黄龙病检测试剂”检测法相结合使用，在柚子生产中具有现实意义。
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[11] 庞虹.三种瓢虫对木虱成虫的捕食量观察[J].昆虫天敌，1991，13（4）：186-188.
关键词 柚树;柑橘黄龙病;识别与鉴定;防治措施
中图分类号：S436.661.1 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.1.012
柑橘黄龙病在我国最早发现，莱因金（Reinking）1919年记述了华南柑橘上的一种黄叶斑驳病。陈其暴1943年首次报道，柑橘黄龙病于1938—1941年在广东潮汕地区严重发生，因广东潮汕地区称梢为“龙”，故得名黄龙病[1]。我国植物病理学家林孔湘教授首次证实该病害是一种传染性病害[2]。1995 年，在中国福州举行的第13届国际柑橘病毒学家会议（International Organization of Citrus Virologists， IOCV）正式将黄龙病命名为“Huanglongbing”，简称HLB，而将国外曾经使用的“柑橘青果病（Citrus greening）”等作为地方名称[3]。
专家们研究发现，甜橙、橘等为黄龙病高感品种，柚类属于中感品种[1]。尽管如此，黄龙病对柚子产业的危害仍然非常巨大。笔者通过对云南省瑞丽市柚子种植大户的调研发现，一定规模以上柚子地块，均出现黄龙病病株或疑似黄龙病症状病株。柚树感染黄龙病后，全年均可表现症状，在柚园抽发夏梢和秋梢期间发病最多，其次是春梢。发病伊始，柚树新梢叶停止转绿，在树冠顶部出现明显的“黄梢”现象。叶片呈现斑驳型或花叶型黄化，其中斑驳型黄化最为典型，黄化症状从叶脉基部和侧脉附近出现，然后逐渐扩展形成不规则、大小不一、形状各异的斑驳型黄斑。柚树一旦感染黄龙病，轻者影响产量和品质，重者将造成“树死园毁”。田间农事作业中，黄龙病的症状常常与柚园管理不善造成的现象相近，普通农户难以有效甄别。再者，由于时间、费用等诸多因素的限制和影响，几乎无法做到将样本送到高等院校和研究机构进行鉴定。由此可见，对黄龙病的识别和防治非常重要。筆者从实际生产出发，讨论一种适宜柚树种植普通农户应用的黄龙病识别和防治方法，希望对柚子种植户有一定的帮助。
1 黄龙病病原菌及其寄主
1.1 黄龙病病原菌
人类对柑橘黄龙病病原菌的认知经历了“病原生理因子、病毒阶段”“病原类菌原体、类立克次氏阶段”“病原类细菌阶段”，直到1984年，Garnier等通过电镜观察发现黄龙病病原的膜结构外壁和内壁间存在肽聚糖，与革兰氏阴性细菌的细胞壁结构相似，故认为黄龙病病原是一种革兰氏阴性细菌[4]。1995年，黄龙病病原归为候选的薄壁菌门韧皮部杆菌属（Candidatus liberibacter sp），属于真细菌的变形菌纲（ Proteobacteriacea）α亚纲成员。根据黄龙病病原物对热的敏感性、虫媒和地理分布，将其分为3个种：亚洲种（Candidatus liberibacter asiaticus，Las），其传媒昆虫为亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）;非洲种（Candidatus liberibacter africanus，Laf），其传媒昆虫为非洲柑橘木虱（Trioza erytreae）;美洲种（Candidatus liberibacter americanus，Lam），其传媒昆虫为亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）。Las属于耐热型，发病的适合温度为27～32 ℃，常在低海拔炎热地区存在;Laf属于热敏感型，发病适合温度为22～25 ℃，只能在海拔700 m以上地区种植的柑橘上发现;Lam也属于耐热型，发病适合温度为27～32 ℃，在症状表现上更接近于亚洲种[5]。
1.2 黄龙病发生与流行规律
黄龙病传播途径主要是通过带病接穗、苗木及柑橘木虱虫媒进行传播，也可通过草地菟丝子（Cuscuta chinensis）将黄龙病菌从柑橘传到草本植物长春花（Catharanthus roseus）上。病原菌主要在田间韧皮部组织中越冬，初侵染源为田间病株、带菌苗木及带菌柑橘木虱。
在田间传播黄龙病的柑橘木虱主要是亚洲柑橘木虱和非洲木虱，二者喜食嫩芽，卵大多产在嫩叶边缘，若虫生活在叶子边缘的背侧或者叶脉和叶柄部。非洲木虱的若虫会植入叶片背部形成凹巢，有突起状，当成长为成虫后，巢空，突起状仍在。而亚洲柑橘木虱一般不会产生突起状，但严重时叶片扭曲[6]。
1.3 黄龙病寄主
柑橘黄龙病的植物寄主主要是柑橘属及芸香科柑橘亚科近缘属植物。除芸香科植物外，柑橘黄龙病细菌还可以通过菟丝子传播给长春花、烟草和番茄等非芸香科植物。长春花染病后的症状比柑橘更明显，病菌密度更高，因此，常被用作黄龙病草本指示植物[1， 5]。
2 柚树黄龙病的识别方法
2.1 田间识别法
田间识别法主要是依据新梢的成熟期症状表现来识别黄龙病，如果当年新梢出现黄梢和叶片出现斑驳症状，很多种植户基本上会把该柚树判定为疑似黄龙病病树。但是由于黄龙病的症状很容易和其他由于管理不善、营养不良或病虫害引起的症状相混淆，特别是已经感染黄龙病但尚未表现明显症状的植株难以依据症状做出准确的判定。
2.2 实验室鉴定法
实验室判定法是研究、检疫黄龙病的主要方法，经过柑橘学者多年的研究，先后报道了电镜观察法、血清学诊断法、核酸探针杂交法及PCR扩增法[3， 6]。但是由于时间、费用等因素，在实际生产中，柚树种植户几乎不会送样本到高等院校和科研院所进行实验室判定。 1）电镜观察法。电镜观察可以把黄龙病菌的形态、大小及细菌体的壁膜结构等特征观察清楚，做出的诊断非常准确，是一种重要的鉴定和诊断方法。
2）血清学诊断法。由于黄龙病菌目前还不能进行人工培养，不能获得病菌纯培养，因此要制备高效的黄龙病菌单克隆抗体比较困难。即便已获得，但因其单克隆抗体专一性过强，难以适应不同地域的黄龙病菌变异菌株，可能会发生漏检，故其应用与推广也受到很大的限制。
3）核酸探针杂交法。核酸分子杂交的原理是：具一定同源性的2条核酸单链间核苷酸键有亲和力，在一定的条件下，这2条单链按碱基互补原则退火形成双链。杂交的双方是待测核酸及标记探针，标记物常选用放射性同位素或非放射性物质如生物素等。杂交后，通过标记探针放射自显影或尼龙膜显带就可达到检测的目的。核酸分子杂交技术的优点是：检测快速专一，灵敏度高达ng级。但由于分子探针杂交过程复杂、需要大量DNA等，限制了该技术的广泛应用。
4）PCR扩增法。目前，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术因具有快速简便、灵敏度高、特异性强等优点，已成为国际上最为可靠并广泛采用的检测方法。在常规PCR基础上发展出了灵敏度更高，特异性更强的巢式PCR技术（nested-PCR）。为克服常规PCR和nested-PCR不能准确定量、容易交叉污染和容易产生假阳性问题，又逐步发展出了实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR）技术。该技术融合了PCR和DNA探针杂交技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术作为核酸定量的手段，以其高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、污染少等优点，实现了PCR从定性到定量的飞跃，在柑橘黄龙病检测中得到广泛应用。
2.3 指示物鉴定法[1， 3]
指示植物鉴定是将可疑的枝条嫁接到容易感病的指示植物上，接种3～4个月后观察其发病情况。虽然指示植物嫁接鉴定相对于田间诊断法更为准确，但周期太长，不利于快速检测。
1）木本指示物鉴定。不同地区使用的指示寄主也不同，如南非用伏令夏橙，印度用莱檬作为黄龙病的指示植物，而在我国多用椪柑作为黄龙病的指示植物，椪柑嫁接后在25～32 ℃条件下，3个月左右叶片出现斑駁黄化。
2）草本指示物鉴定。在防虫隔离网室内播种草本指示植物长春花，待植株生长至4～6片叶时，采用大花菟丝子（Cuscuta reflexa）或草地菟丝子（Cuscuta campestris）接种。长春花和菟丝子接种3个月左右开始表现明显症状，初为下部叶片最先从叶脉处开始黄化，上部叶片仍表现为健康的绿色，之后整个叶片逐渐均匀黄化，并且黄化的叶片由下而上逐渐增多，最后黄化叶片逐渐脱落。
3）木虱传毒鉴定。从田间怀疑病株上，采木虱50～100头，接到指示植物上，或采用饲养的4龄、5龄若虫或成虫，在病株上吸毒30 min，保持8～12 d，整个生活期保持传染性，最后观察指示物的变化。
2.4 试剂鉴定法
笔者采用“黄龙病检测试剂（专利号：201820411023.5）”在柚树生产中进行试验，并对其准确性进行了验证，认为，该试剂可以与田间识别法结合使用，对柚树黄龙病的判断增加了准确性，同时能达到快速和低成本目的。
2.4.1 准确性验证
笔者在“高原特色作物（瑞丽柚子）科技示范庄园”项目中，对3002株琯溪蜜柚进行高接换种时（换成瑞丽水晶柚），在瑞丽水晶柚园内采了4个水晶柚枝条样品送华中农业大学进行黄龙病（HLB）、裂皮病（CEVd）、衰退病（CTV）和碎叶病（CTLV）实验室鉴定（2017年12月5日送样，2017年12月26日出报告）。
为了验证“黄龙病检测试剂”的准确性，笔者在原采样的同柚园同树上采样，用“黄龙病检测试剂”进行黄龙病的快速检测，检测结果与原华中农业大学鉴定结果汇总于表1。
从表1的对比发现，检测结果一致。但是，在“黄龙病检测试剂”使用中存在不少问题，CSM20171111-1和YLY20171111-1样品树上采下的新梢，检测结果均为阴性，而老叶检测的结果为阳性，因此，使用“黄龙病检测试剂”的正确方法是：每一株被检柚树，要采下10片以上老叶或有症状的叶片分别检测，只要有一个叶片出现阳性（+），就判定该株柚树为黄龙病病树。如果检测的叶片太少，“黄龙病检测试剂”检测的指导意义就不大。
2.4.2 黄龙病检测试剂应用案例
笔者在瑞丽市布衣农庄柚园（E 97°44′32″，N 23°57′39″）中，对疑似黄龙病的12棵柚树采样检测，每棵树采下老叶或有斑驳状的叶片10片，每棵树检测10次，结果有4棵数被判定为阳性（+），属黄龙病病树，其余8棵疑似黄龙病的柚树判定为非黄龙病病树。通过检查根系，8棵非黄龙病病树根系已经出现根腐，应为根腐所致黄化现象。
3 黄龙病防治方法
3.1 “三步法”
迄今为止，柑橘黄龙病菌不能在离体条件下获得纯培养，因此对该病的研究受到制约[1]。在市场上也找不到一种药剂直接杀死黄龙病的病原菌（Candidatus liberibacter sp），因此，对黄龙病的防治一直是采用我国植物病理学家林孔湘教授提出“三步法”[2]，即使用无毒繁殖材料，铲除病原（树）和防控木虱。该方法至今仍然是黄龙病防控的不二方法，已为世界各国普遍采用。
3.2 严格实施植物检疫及建立无病苗圃，培育无病苗木
要防止黄龙病从疫区传染到新区，加强植物检疫是最重要的手段。瑞丽市政府正在引导和打造弄岛柚子庄园，政府介入，严格实施植物检疫制度，是确保弄岛柚子庄园绿色、可持续发展的重要手段。 培育无病苗木是预防柑橘黄龙病的基础保障。所以，农业科研院所及苗木培育公司须建立无病苗圃，无病苗圃的选点要远离黄龙病疫区或者与黄龙病疫区隔离。除严格选择无病的母株外，繁殖材料还要通过消毒处理。接穗或苗木用49 ℃湿热空气处理50 min，或接穗用47～50 ℃热水间歇热处理6～12 min，每24 h一次，共处理3次，或者接穗用四霉素与噁霉灵混合液灭菌消毒，浸泡1～2 h，然后用清水冲洗，晾干备用[7]，可有效脱除黄龙病菌。
3.3 坚决防除柑橘木虱
柑橘木虱属半翅目（Hemiptera）木虱科（Psyllidae），主要危害芸香科植物，柑橘木虱的寄主植物有：柑橘、黄皮、九里香、枸杞和橙等。其中，木虱在柑橘上危害最重，是传播柑橘黄龙病主要的自然媒介[8]。传播黄龙病的木虱主要是亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）和非洲柑橘木虱（Trioza erytreae）。近年来在云南省德宏州发现的柚喀木虱（Cacopsylla citrisuga Yang&Li）也是黄龙病的传播媒介[9]。3种木虱成虫的形态特征见图1。
防除传播黄龙病的这3种木虱，是有效防治柚树黄龙病的重要环节。
3.3.1 利用捕食性天敌瓢虫防治柑橘木虱
据报道，在美国佛罗里达，六斑盘瓢虫、双带盘瓢虫、血红斑瓢虫、楔斑溜瓢虫、墨西哥瓢虫、奇氏光缘瓢虫和异色瓢虫是柑橘木虱的主要捕食性天敌，在自然条件下，它们对柑橘木虱卵和若虫的捕食量累计可达80%～100%[10]。广东省昆虫研究所庞虹研究发现，六斑月瓢虫、红星盘瓢虫和龟纹瓢虫不仅可以捕食爬行能力较弱的木虱若虫，还可以捕食活动能力较强的木虱成虫，其中红基盘瓢虫在个别果园对柑橘木虱若虫的捕食量可以超过 80%，几种瓢虫在自然界中对柑橘木虱起着重要的控制作用[11]。
所以，在柚园科学适量释放捕食性天敌瓢虫，可以降低柑橘木虱的虫口基数，有利于柚园防除柑橘木虱，但必须与化学防治有机结合，才能达到事半功倍的效果。
3.3.2 化学防治柑橘木虱
化学防治柑橘木虱目前仍然是柚子生产中的主要手段，其技术要领是：选择有效的农药品种，科学配制农药，减少或延缓木虱对农药抗药性;选择好防治时期，避免黄龙病的传播。
3.3.2.1推荐用下列农药品种防治柑橘木虱
1）脲类杀虫剂：虱螨脲（Lufenuron）;2）拟除虫菊酯类杀虫剂：溴氰菊酯（Deltamethrin）、联苯菊酯（Bifenthrin）、甲氰菊酯（Fenpropathrin）、高效氯氟氰菊酯（Lambda-cyhalothrin）等;3）第二代烟碱类杀虫剂：噻虫嗪（ Thiamethoxam ）、噻虫胺（Clothianidin）等;4）大环内酯类杀虫剂：阿维菌素（Abamectin）、多杀霉素（Spinosad）等;5）噻二嗪类杀虫剂：噻嗪酮（Buprofezin）等;6）有机磷类杀虫剂：毒死蜱（Chlorpyrifos）等;7）吡啶类杀虫/杀螨剂：吡虫啉（Imidacloprid）、啶虫脒（Acetamiprid）等;8）苯甲酰胺类杀虫剂：氯虫苯甲酰胺（Chlorantraniliprole）等;9）生物源杀虫/杀螨剂：甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（Emamectin benzoate）等;10）昆虫生长调节剂：吡丙醚（Pyriproxyfen）。
3.3.2.2化学防治时期
柑橘木虱一般每年发生6～12代。成虫当年在柚子叶背越冬，来年3月上中旬在春梢上产卵繁衍，第一代发生于3月中旬至5月上旬，最后一代发生于10月上旬至12月上旬。只要有嫩梢抽发，成虫即产卵，嫩梢数量决定世代的多少。伴随春梢、夏梢和秋梢的抽发高峰，若虫出现3个发生高峰，因此化防时期为这三季梢的抽发期。
3.4 挖除病树
国内外实践证明，及时挖除病株是有效防控黄龙病的关键手段，仅剪除病枝对防治黄龙病是无效的。挖除病树后，在穴内撒施适量的生石灰，在太阳下暴晒10～20 d后，可以重新补苗。
4 小结与讨论
由于黄龙病潜伏期较长，柚树染病初期不出现症状或症状不明显，因此，如何及早发现病树就具有挑战性。实验室鉴定法目前主要是专家学者在研究中使用，柚树种植户即使是大户，也很难应用实验室鉴定法来发现柚树黄龙病;指示物鉴定法由于时间太长，在笔者的调查中没有发现种植户使用，也成为了专家学者使用的方法。本文推荐田间识别法与“黄龙病检测试剂”检测法相结合使用，在柚子生产中具有现实意义。
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[11] 庞虹.三种瓢虫对木虱成虫的捕食量观察[J].昆虫天敌，1991，13（4）：186-188.