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摘要
本研究通过两组试验，明确了土壤接种棉花枯萎病菌的两种方法及适宜接种量。枯萎病菌的繁殖采用玉米沙粒培养基。建立苗床病圃或田间接种时，可在种沟内直接将风干的玉米沙粒培养物与土壤混匀，适宜接种量为10 g/m。采用土壤拌菌法时，病原菌的风干玉米沙粒培养物的加入量以灭菌的细沙壤土的0.6%～08%为宜。采用上述接种方法和接种量，感病品种‘冀棉11’当年病株率可达到80%以上，病情指数可达到50以上。本文提供的接种方法和接种量可用于棉花新品种（系）、资源材料的抗病鉴定及枯萎病的相关研究。
关键词
棉花枯萎病菌；接种方法；接种量
中图分类号：
S 435.621.24
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.04.025
枯萎病（Fusarium wilt）是棉花生产中的主要病害之一，自20世纪30年代在我国华北地区发现报道后，该病迅速扩展蔓延，给棉花生产造成严重威胁。直到20世纪80年代，大面积推广种植抗病品种后，枯萎病的危害才显著减轻。目前，种植抗病品种仍然是控制枯萎病发生危害最经济有效的措施。建立准确、快速的鉴定方法是抗病品种选育、推广的基础工作。枯萎病是一种土传病害，病害的发生发展与土壤中病原菌群体数量有着密切的关系。据报道，土壤接种病菌培养物，无论使用麦粒沙培法还是分生孢子培养法得到的培养物，总是在中等接菌量时，枯萎病发生较重，发展较快；增加接菌体数量，则病情发展缓慢，发病率也下降[1]。目前，进行棉花抗枯萎病鉴定及相关研究中采用的接种方法和接种量各不相同[27]。本文在总结多年的抗病鉴定及相关研究试验的基础上，着重研究在适宜的发病环境下，两种棉花枯萎病菌土壤接种方法及其适宜的接种量，为抗病鉴定及相关研究提供基础。
1材料与方法
1.1供试土壤
选用长期未种植棉花的生砂壤土，过筛后经160 ℃干热灭菌2 h。
1.2供试菌种
供试菌种采自中国农业科学院棉花所试验地的棉花枯萎病病株，分离纯化后接入玉米沙粒培养基（沙子和玉米粉质量比1∶1），25 ℃培养10 d，风干粉碎后得到玉米沙粒培养物备用。
1.3供试棉花品种
人工水泥池试验于2007年进行，选用的棉花品种为‘豫棉21’和‘冀棉11’；菌土营养钵试验于2011年进行，采用的棉花品种为‘中植棉2号’和‘冀棉11’。‘豫棉21’和‘中植棉2号’为国家棉花品种区域试验中的抗病对照，‘冀棉11’为感病对照。
1.4试验设置
种沟接种法：2007年，采用人工水泥池进行。将灭菌的细砂壤土装入长×宽×高为4 m×1.2 m×0.3 m的专用人工水泥池中，播种前浇水，适墒开沟，将风干玉米沙粒培养物按5、10、15、20 g/m均匀撒入种沟内，菌种与土壤混匀后播种。每处理3次重复，每重复1行，随机排列，行长1.2 m，每行播种100粒种子，齐苗后每行留苗15株左右，以不接菌的水泥池为对照。
土壤拌菌法：2011年，采用营养钵进行。将玉米沙粒培养物按土重的0.4%、0.6%、0.8%和1.0%与土壤拌匀后装入营养钵（或直接放入花盆中），将营养钵放入塑料盘中备播。每处理3次重复，每重复15个钵，随机排列，每钵播种10粒种子，齐苗后每钵留苗4～5株，以不接种枯萎病菌的灭菌土为对照。
2结果与分析
2.1种沟接种法及适宜接种量
从出苗情况来看，菌种的接种量越大，出苗率越低。5 g/m的接种量处理与空白对照出苗率相当，其他不同接菌量处理的出苗率均低于空白对照。20 g/m处理下，‘豫棉21’和‘冀棉11’的出苗率均只有37%，分别较对照降低526%和560%。从发病情况来看，播种后30 d，‘豫棉21’的病情指数为3.1～8.5，接菌量5、10 和15 g/m处理的病情指数差异不显著，但均极显著高于20 g/m处理；‘冀棉11’的病情指数为22.8～54.2，以10 g/m接种量处理发病最重（病情指数为54.2），极限著高于5 g/m（39.7）和15 g/m（42.6）处理，20 g/m处理的病情指数最低，极显著低于其他3个处理。播种后35 d，2个供试品种的病情指数均上升，但与播种后30 d相同，‘豫棉21’和‘冀棉11’均在接种量为10 g/m时发病最重，其病情指数分别为136和675其次是5 g/m（125和442）和 15 g/m处理（118和463）， 20 g/m处理发病最轻（56和321）；空白对照中未发现枯萎病病株。因此，综合出苗和发病情况，推荐采用该接种方法时，最适宜的接种量为每米行长10 g风干的玉米沙粒培养物（表1）。
1）
表中同列数据后不同字母表示同一品种的不同接种量处理在P<0.01水平差异显著（LSD test）。下表同。
Data with different capital letters in the same column are significant different between different inoculum doses of same variety at 0.01 level by LSD.The same below.
2.2土壤拌菌法及适宜接种量
从不同处理的出苗率来看，接菌量为土重的0.4%、0.6%和0.8%时，其出苗率与空白对照差异不显著，当接菌量为土重的1.0%时，‘中植棉2号’和‘冀棉11’的出苗率分别为68.9%和66.7%，极显著低于空白对照。从发病情况来看，播种后30 d，‘中植棉2号’的病情指数为0.0～9.8，其中，接菌量为土重的0.8%和1.0% 2个处理的病情指数分别为9.8和8.2，均极显著高于0.6%接种量处理（4.3），0.4%土重接种量处理的棉苗未出现明显的发病症状；‘冀棉11’的病情指数为15.3～46.3，接种量为土重的0.6%、0.8%和1.0% 3个处理的病情指数均极显著高于0.4%处理，3个高接种量处理之间差异不显著。播种后35 d，2个品种3个高接种量处理的病情指数差异不显著，但均极显著高于0.4%处理，空白对照中未发现枯萎病病株。综合不同接菌量处理的出苗率和发病情况，推荐采用该接种方法时，最适宜的接种量为风干玉米沙土接种物与土壤的质量比为0.6%～08%（表2）。 3结论与讨论
接菌量是棉花抗枯萎病鉴定中的关键因素。本研究的两组试验结果表明，在人工接种进行抗枯萎病鉴定时，并非接菌量越高，发病越重，当接种量达到一定程度后，增加接种量，反而会降低发病程度。在建立苗床病圃或田间病圃进行抗枯萎病鉴定时，可采用种沟接种法，接种量以10 g/m风干的玉米沙粒培养物为最佳，在播种后30 d，感病品种‘冀棉11’的病株率和病情指数达到国家标准中对感病对照的发病要求（病株率在80%左右，病情指数在50左右）[7]；在采用土壤拌菌制作营养钵或盆栽进行抗枯萎病鉴定时，接种量以风干的玉米沙粒培养物质量为土壤的0.6%～08%为宜。播种后30～35 d，感病品种‘冀棉11’病株率和病情指数也达到国家标准。郭金城等[1]推荐在建立水泥池枯萎病圃时，最佳接种量为10 g/m风干的棉籽培养物，这与本研究结果部分相同。
在人工接种进行棉花抗枯萎病鉴定时，如果接种后立即播种，较高的接种量会严重影响棉花出苗。比如种沟接种时，10～20 g/m的接种量，对出苗有严重的影响；当土壤拌菌接种时，风干的玉米沙粒培养物质量为土壤的1.0%时就会严重影响棉花出苗。因此，在实际工作中，要准确把握接种量，也可以考虑将病原菌先接入土壤，5～7 d后再进行播种。
抗病鉴定中枯萎病菌的繁殖可采用不同的培养基。在以往的工作中，笔者采用过棉籽培养基，但由于有短绒存在，棉籽培养物风干后不易碾碎，也不容易与土壤混匀。改用玉米沙粒培养基后，枯萎病菌生长良好，易碾碎，易与土壤混匀，保证了鉴定试验的顺利进行。
参考文献
[1]郭金城， 李玉奎 宋晓轩. 土壤接菌量与棉花枯萎病的关系[J].中国棉花， 1988（1）： 4546.
[2]朱荷琴， 宋晓轩， 李玉奎. 苗床病圃法鉴定棉花品种资源抗枯萎病性研究[J].江西棉花， 1994（2）： 2122.
[3]朱荷琴， 吴征彬， 邹奎， 等. 国家棉花品种区域试验棉花抗枯黄萎病鉴定方法[J].中国棉花， 2007， 34（11）： 910.
[4]师勇强， 冯自力， 李志芳， 等. 1998-2011年黄河流域棉区棉花品种区域试验参试品种（系）抗病性评述[J].中国棉花， 2013， 40（3）： 3033.
[5]朱荷琴， 宋晓轩， 孙君灵， 等. 国家棉花品种区域试验90年代参试品种抗病性评述[J].棉花学报， 1998， 10（6）： 303306.
[6]朱荷琴， 金石桥， 冯自力， 等. 国审大面积推广棉花品种抗病性监测[J].中国棉花， 2012， 39（7）： 1517.
[7]中国农业科学院植物保护研究所，全国农业技术推广服务中心.GB/T22101.42009棉花抗病虫性评价技术规范， 第4部分： 枯萎病[S].北京： 中国标准出版社， 2009.
（责任编辑：杨明丽）
本研究通过两组试验，明确了土壤接种棉花枯萎病菌的两种方法及适宜接种量。枯萎病菌的繁殖采用玉米沙粒培养基。建立苗床病圃或田间接种时，可在种沟内直接将风干的玉米沙粒培养物与土壤混匀，适宜接种量为10 g/m。采用土壤拌菌法时，病原菌的风干玉米沙粒培养物的加入量以灭菌的细沙壤土的0.6%～08%为宜。采用上述接种方法和接种量，感病品种‘冀棉11’当年病株率可达到80%以上，病情指数可达到50以上。本文提供的接种方法和接种量可用于棉花新品种（系）、资源材料的抗病鉴定及枯萎病的相关研究。
关键词
棉花枯萎病菌；接种方法；接种量
中图分类号：
S 435.621.24
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.04.025
枯萎病（Fusarium wilt）是棉花生产中的主要病害之一，自20世纪30年代在我国华北地区发现报道后，该病迅速扩展蔓延，给棉花生产造成严重威胁。直到20世纪80年代，大面积推广种植抗病品种后，枯萎病的危害才显著减轻。目前，种植抗病品种仍然是控制枯萎病发生危害最经济有效的措施。建立准确、快速的鉴定方法是抗病品种选育、推广的基础工作。枯萎病是一种土传病害，病害的发生发展与土壤中病原菌群体数量有着密切的关系。据报道，土壤接种病菌培养物，无论使用麦粒沙培法还是分生孢子培养法得到的培养物，总是在中等接菌量时，枯萎病发生较重，发展较快；增加接菌体数量，则病情发展缓慢，发病率也下降[1]。目前，进行棉花抗枯萎病鉴定及相关研究中采用的接种方法和接种量各不相同[27]。本文在总结多年的抗病鉴定及相关研究试验的基础上，着重研究在适宜的发病环境下，两种棉花枯萎病菌土壤接种方法及其适宜的接种量，为抗病鉴定及相关研究提供基础。
1材料与方法
1.1供试土壤
选用长期未种植棉花的生砂壤土，过筛后经160 ℃干热灭菌2 h。
1.2供试菌种
供试菌种采自中国农业科学院棉花所试验地的棉花枯萎病病株，分离纯化后接入玉米沙粒培养基（沙子和玉米粉质量比1∶1），25 ℃培养10 d，风干粉碎后得到玉米沙粒培养物备用。
1.3供试棉花品种
人工水泥池试验于2007年进行，选用的棉花品种为‘豫棉21’和‘冀棉11’；菌土营养钵试验于2011年进行，采用的棉花品种为‘中植棉2号’和‘冀棉11’。‘豫棉21’和‘中植棉2号’为国家棉花品种区域试验中的抗病对照，‘冀棉11’为感病对照。
1.4试验设置
种沟接种法：2007年，采用人工水泥池进行。将灭菌的细砂壤土装入长×宽×高为4 m×1.2 m×0.3 m的专用人工水泥池中，播种前浇水，适墒开沟，将风干玉米沙粒培养物按5、10、15、20 g/m均匀撒入种沟内，菌种与土壤混匀后播种。每处理3次重复，每重复1行，随机排列，行长1.2 m，每行播种100粒种子，齐苗后每行留苗15株左右，以不接菌的水泥池为对照。
土壤拌菌法：2011年，采用营养钵进行。将玉米沙粒培养物按土重的0.4%、0.6%、0.8%和1.0%与土壤拌匀后装入营养钵（或直接放入花盆中），将营养钵放入塑料盘中备播。每处理3次重复，每重复15个钵，随机排列，每钵播种10粒种子，齐苗后每钵留苗4～5株，以不接种枯萎病菌的灭菌土为对照。
2结果与分析
2.1种沟接种法及适宜接种量
从出苗情况来看，菌种的接种量越大，出苗率越低。5 g/m的接种量处理与空白对照出苗率相当，其他不同接菌量处理的出苗率均低于空白对照。20 g/m处理下，‘豫棉21’和‘冀棉11’的出苗率均只有37%，分别较对照降低526%和560%。从发病情况来看，播种后30 d，‘豫棉21’的病情指数为3.1～8.5，接菌量5、10 和15 g/m处理的病情指数差异不显著，但均极显著高于20 g/m处理；‘冀棉11’的病情指数为22.8～54.2，以10 g/m接种量处理发病最重（病情指数为54.2），极限著高于5 g/m（39.7）和15 g/m（42.6）处理，20 g/m处理的病情指数最低，极显著低于其他3个处理。播种后35 d，2个供试品种的病情指数均上升，但与播种后30 d相同，‘豫棉21’和‘冀棉11’均在接种量为10 g/m时发病最重，其病情指数分别为136和675其次是5 g/m（125和442）和 15 g/m处理（118和463）， 20 g/m处理发病最轻（56和321）；空白对照中未发现枯萎病病株。因此，综合出苗和发病情况，推荐采用该接种方法时，最适宜的接种量为每米行长10 g风干的玉米沙粒培养物（表1）。
1）
表中同列数据后不同字母表示同一品种的不同接种量处理在P<0.01水平差异显著（LSD test）。下表同。
Data with different capital letters in the same column are significant different between different inoculum doses of same variety at 0.01 level by LSD.The same below.
2.2土壤拌菌法及适宜接种量
从不同处理的出苗率来看，接菌量为土重的0.4%、0.6%和0.8%时，其出苗率与空白对照差异不显著，当接菌量为土重的1.0%时，‘中植棉2号’和‘冀棉11’的出苗率分别为68.9%和66.7%，极显著低于空白对照。从发病情况来看，播种后30 d，‘中植棉2号’的病情指数为0.0～9.8，其中，接菌量为土重的0.8%和1.0% 2个处理的病情指数分别为9.8和8.2，均极显著高于0.6%接种量处理（4.3），0.4%土重接种量处理的棉苗未出现明显的发病症状；‘冀棉11’的病情指数为15.3～46.3，接种量为土重的0.6%、0.8%和1.0% 3个处理的病情指数均极显著高于0.4%处理，3个高接种量处理之间差异不显著。播种后35 d，2个品种3个高接种量处理的病情指数差异不显著，但均极显著高于0.4%处理，空白对照中未发现枯萎病病株。综合不同接菌量处理的出苗率和发病情况，推荐采用该接种方法时，最适宜的接种量为风干玉米沙土接种物与土壤的质量比为0.6%～08%（表2）。 3结论与讨论
接菌量是棉花抗枯萎病鉴定中的关键因素。本研究的两组试验结果表明，在人工接种进行抗枯萎病鉴定时，并非接菌量越高，发病越重，当接种量达到一定程度后，增加接种量，反而会降低发病程度。在建立苗床病圃或田间病圃进行抗枯萎病鉴定时，可采用种沟接种法，接种量以10 g/m风干的玉米沙粒培养物为最佳，在播种后30 d，感病品种‘冀棉11’的病株率和病情指数达到国家标准中对感病对照的发病要求（病株率在80%左右，病情指数在50左右）[7]；在采用土壤拌菌制作营养钵或盆栽进行抗枯萎病鉴定时，接种量以风干的玉米沙粒培养物质量为土壤的0.6%～08%为宜。播种后30～35 d，感病品种‘冀棉11’病株率和病情指数也达到国家标准。郭金城等[1]推荐在建立水泥池枯萎病圃时，最佳接种量为10 g/m风干的棉籽培养物，这与本研究结果部分相同。
在人工接种进行棉花抗枯萎病鉴定时，如果接种后立即播种，较高的接种量会严重影响棉花出苗。比如种沟接种时，10～20 g/m的接种量，对出苗有严重的影响；当土壤拌菌接种时，风干的玉米沙粒培养物质量为土壤的1.0%时就会严重影响棉花出苗。因此，在实际工作中，要准确把握接种量，也可以考虑将病原菌先接入土壤，5～7 d后再进行播种。
抗病鉴定中枯萎病菌的繁殖可采用不同的培养基。在以往的工作中，笔者采用过棉籽培养基，但由于有短绒存在，棉籽培养物风干后不易碾碎，也不容易与土壤混匀。改用玉米沙粒培养基后，枯萎病菌生长良好，易碾碎，易与土壤混匀，保证了鉴定试验的顺利进行。
参考文献
[1]郭金城， 李玉奎 宋晓轩. 土壤接菌量与棉花枯萎病的关系[J].中国棉花， 1988（1）： 4546.
[2]朱荷琴， 宋晓轩， 李玉奎. 苗床病圃法鉴定棉花品种资源抗枯萎病性研究[J].江西棉花， 1994（2）： 2122.
[3]朱荷琴， 吴征彬， 邹奎， 等. 国家棉花品种区域试验棉花抗枯黄萎病鉴定方法[J].中国棉花， 2007， 34（11）： 910.
[4]师勇强， 冯自力， 李志芳， 等. 1998-2011年黄河流域棉区棉花品种区域试验参试品种（系）抗病性评述[J].中国棉花， 2013， 40（3）： 3033.
[5]朱荷琴， 宋晓轩， 孙君灵， 等. 国家棉花品种区域试验90年代参试品种抗病性评述[J].棉花学报， 1998， 10（6）： 303306.
[6]朱荷琴， 金石桥， 冯自力， 等. 国审大面积推广棉花品种抗病性监测[J].中国棉花， 2012， 39（7）： 1517.
[7]中国农业科学院植物保护研究所，全国农业技术推广服务中心.GB/T22101.42009棉花抗病虫性评价技术规范， 第4部分： 枯萎病[S].北京： 中国标准出版社， 2009.
（责任编辑：杨明丽）