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摘要：【目的】探究 N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）對水稻幼苗的抗寒效果及其潜在的抗寒机制，以期为NAG在农业免疫诱抗领域的应用提供理论依据。【方法】以水稻品种内5优907为供试材料，外源施用不同浓度（0、50、100、150 mg/L）的NAG进行根系培养，测定低温条件下水稻幼苗的生长指标、叶绿素含量及可溶性糖含量，表征NAG的抗寒效果并筛选最适施用浓度。进一步在生理生化水平从渗透调节系统、根系系统、抗氧化系统和脱落酸代谢途径探究NAG对水稻幼苗的抗寒机制。【结果】外源施用NAG可促进水稻幼苗在低温环境下正常生长，具有明显的抗寒效果，其最适施用浓度为100 mg/L，在此浓度下幼苗单株鲜重（0.118±0.009 g）、株高（21.21±0.72 cm）、根长（5.76±0.43 cm）及可溶性糖（41.031±0.992 μg/g）和总叶绿素含量（5.959±0.020 mg/g）较对照组涨幅最大，分别显著增长14.14%、7.14%、7.22%、63.09%和36.79%（P<0.05，下同）。生理生化水平相关结果表明，100 mg/L NAG促进寒害幼苗中渗透调节物质积累，可溶性蛋白、脯氨酸和游离氨基酸积累量较低温对照组分别显著增长19.58%、19.49%和36.82%;保护幼苗根系系统，促进寒害幼苗根系活力提高至低温对照组的1.56倍，并使茎叶组织中硝态氮含量下降15.65%;有效促进幼苗中丙二醛积累量下降23.92%，并将超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活力分别提高34.94%和25.42%，保护幼苗抗氧化系统;增加寒害幼苗脱落酸代谢通路中OsNCED、OsSDR和AAO基因表达量至低温对照组的3.52、1.73和1.64倍，从而实现幼苗中内源脱落酸的积累。【结论】外源施用NAG根系处理能够调控低温胁迫下水稻幼苗渗透调节系统、根系系统、抗氧化系统及内源脱落酸代谢途径，进而提高水稻抗寒性。
关键词： N-乙酰氨基葡萄糖;水稻;抗寒性;脱落酸途径
Abstract：【Objective】To evaluate the cold resistance effect of N-acetyl-D-glucosamineon on rice seedlings，and to further explore its potential cold resistance mechanism，with a view to providing the theoretical basis for the application of NAG in the field of agricultural immune induction. 【Method】With the rice variety Nei 5 You 907 as the test material，different concentrations（0，50，100，150 mg/L） NAG were exogenously applied to rice seedlings for root culture. The growth potential，growth index，chlorophyll content and soluble sugar content of rice seedlings under low temperature conditions were measured to characterize the cold resistance effect of NAG and to screen the optimum applied concentration. Furthermore，the cold resistance mechanism of NAG on rice seedlings was explored from osmotic adjustment system，root system，antioxidant system and abscisic acid metabolism pathways at the physiological and biochemical level. 【Result】Exogenous application of NAG promoted the growth of rice seedlings in low temperature environments，and had obvious cold resistance effect. The optimum applied concentration was 100 mg/L. Under this concentration，the fresh weight（0.118±0.009 g），plant height（21.21±0.72 cm），root length（5.76±0.43 cm），soluble sugar（41.031±0.992 μg/g） and the total chlorophyll content（5.959±0.020 mg/g）of seedlings increased the most in comparison with the control group，which significantly increased by 14.14%，7.14%，7.22%，63.09% and 36.79% respectively（P<0.05，the same below）. The results of the physiological and biochemical level showed that 100 mg/L NAG promoted the accumulation of osmotic adjustment substances， soluble protein， proline，free amino acid in the cold injury seedlings increased significantly by 19.58%，19.49% and 36.82% respectively compared with the control group;effectively protected the root system of seedlings，the root acti-vity of cold injury seedlings was increased to 1.56 times，and the nitrate nitrogen content in the stem and leaf tissues was decreased by 15.65% compared with the low-temperature control group;effectively reduced the accumulation of malondialdehyde in the cold injury seedlings by 23.92% and increased the activities of superoxide dismutase（SOD） and peroxidase（POD） by 34.94% and 25.42% respectively，thereby protecting the antioxidant system of seedlings;increased the OsNCED，OsSDR and AAO genes expression in the abscisic acid metabolism pathway to 3.52，1.73 and 1.64 times of low temperature control，so as to achieve the accumulation of endogenous abscisic acid in cold injury seedlings. 【Conclusion】Exogenous application of NAG with root treatment can regulate osmotic adjustment system，root system， antioxidant system and the endogenous abscisic acid metabolism pathway of rice seedlings under cold stress，thereby improving the cold resistance of rice. Key words： N-acetyl-D-glucosamine; rice; cold resistance; abscisic acid pathway
0 引言
【研究意义】植物生长过程中通常会面临生物胁迫（病毒、虫害、真菌等）及非生物胁迫（寒害、旱害、盐碱、矿物质缺乏、重金属等）的压力，其中温度是植物生长发育的重要条件之一（Lukatkin et al.，2012）。水稻作为亚热带喜温植物，对低温环境敏感，低温会造成水稻幼苗生长发育不良甚至死亡，严重影响水稻产量（Hussain et al.，2016）。为提高植物的抗寒能力，脱落酸、多效唑、氯胆碱等植物生长调节剂及甜菜碱、多胺等化合物作为抗寒剂已被广泛应用（Hussain et al.，2018）。化学抗寒剂虽效果较优，但易产生化学残留并危害植物生长，造成环境污染。所以开发对植物威胁小、绿色、安全且具有良好经济效益的植物免疫诱抗剂尤为重要。目前，甲壳素及其衍生物作为含氮多糖，凭借其安全、绿色等优势已被广泛应用于免疫诱抗领域，N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）是葡萄糖分子中C2上羟基被乙酰氨基所替代的一种氨基己糖，是构成甲壳素的结构单元物质，但其在植物免疫诱抗领域的应用研究较为少见。此外，关于外源功能性糖在植物抗寒领域的机制研究尚不清晰，对于相关代谢通路的研究尚不深入。因此，探究NAG对水稻幼苗的抗寒作用及其潜在的抗寒机制，可为NAG在农业免疫诱抗领域的应用提供理论支撑，对保护水稻抵御外界低温胁迫损伤具有重要意义。【前人研究进展】郝林华等（2006）研究指出，牛蒡寡糖作为新型寡糖可显著保护低温胁迫后黄瓜幼苗细胞膜稳定性及抗氧化酶系统，进而调控植物抗寒。刘瑞志等（2009）研究发现，0.2%的褐藻寡糖通过提高烟草的抗逆酶活力，减少寒害对细胞组织的损伤，促进其抵御寒害逆境。刘同梅（2018）研究表明，海藻酸钠寡糖通过诱导水杨酸通路激活拟南芥免疫途径达到抗病效果。此外，壳寡糖和几丁寡糖作为两种不同的甲壳素类氨基寡糖，已有较成熟的产品被开发应用于植物免疫诱抗领域（Yin et al.，2016）。Shigeru等（2006）研究发现，几丁寡糖通过诱导水稻根及叶中激发子响应基因及抗性防御基因表达，在水稻中传递系统性信号并抵御稻瘟病真菌。姚艳平等（2013）研究表明，几丁寡糖可通过诱导调控抗病相关酶活性及相关植物保卫素等机制调控机体，抑制木霉菌的产生。王梦雨等（2016）研究报道，喷施壳寡糖可促进小麦中可溶性糖、脯氨酸等低温抗性相关物质表达，保护小麦抵抗低温胁迫。田路（2019）研究了壳寡糖对不同花椒种质间耐寒性差异的影响，发现100 mg/L壳寡糖处理能有效调节寒害花椒幼苗的渗透系统及抗氧化系统，从而促进其抗寒。【本研究切入点】相关研究表明，乙酰基团在植物免疫诱抗中发挥重要作用，而NAG作为一种含有乙酰基团的甲壳素结构单元，具有抗菌（Gaderer et al.，2017）、抗病（Kashulin et al.，2000）等多方面生理活性，推测其在水稻抗寒领域可能具有较大的应用潜力，但其在农作物免疫诱抗领域鲜有研究。同时，NAG现已实现发酵法进行大规模的生物制造，将其应用于农业领域能降低现有抗寒成本，具有良好的经济效益和市场前景。【拟解决的关键问题】以水稻品种内5优907为供试材料，外源施用不同浓度NAG进行根系培养，测定并比较低温条件下水稻幼苗的长势及生长指标，并进一步在生理生化水平上分析NAG对水稻幼苗脱落酸代谢通路、渗透调节系统、根系系统和抗氧化系统的调控影响，探究NAG根系处理对水稻的抗寒效果及其潜在的抗寒机制，为NAG在农业免疫诱抗领域的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为内5优907水稻种子，购自四川丰禾种业有限公司;N-乙酰氨基葡萄糖（分子式为C8H15NO6，分子量为221.09，纯度为98%）购自山东润德生物科技有限公司;脯氨酸、茚三酮、磺基水杨酸、硫代巴比妥酸和氮蓝四唑等均为分析纯，购自泰坦科技股份有限公司。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 植物培养与处理 选择粒大饱满、颗粒均匀的水稻种子置于清水中充分浸泡，将沉于底部的质量较好的种子进行清水漂洗并浸泡于75%乙醇溶液消毒15 min，清水冲洗数遍直至无乙醇殘留。将水稻种子置于30 ℃去离子水中浸种48 h，然后于30 ℃暗处催芽24 h。待其露白后，小心挑选露白一致的水稻种子移至96孔板中培养，然后将其移至植物光照培养箱中进行水培。培养条件：温度25 ℃，相对湿度75%，光照周期16 h/8 h（昼/夜）。为促进水稻种子及时获得营养，结合幼苗培养过程中的实际生长状态，水培（去离子水）约7 d后换用营养液培养（营养液参照国际水稻研究所研制的营养液配方配置），每隔2 d换液一次。
待幼苗生长至2叶1心期（共14 d左右）时添加NAG进行根系培养，具体方法如下：（1）抗寒效果浓度筛选时，NAG处理水平分别为0（对照）、50、100和150 mg/L。在光周期中光照条件下开始进行幼苗加糖的根系培养，加糖处理48 h后，开始低温胁迫处理（温度为5 ℃）24 h。（2）抗寒机制研究时，基于筛选得到的最优NAG处理浓度，幼苗分为常温对照组（未加NAG根系处理幼苗，常温培养）、常温处理组（施用NAG最优浓度根系处理幼苗，常温培养）、低温对照组（未加NAG根系处理幼苗，5 ℃低温胁迫培养24 h）和低温处理组（施用最优NAG浓度根系处理幼苗，5 ℃低温胁迫培养24 h）。随后在光照处理条件下进行取样，液氮冷冻后储存于-80 ℃冰箱，测定后续相关指标。
1. 2. 2 幼苗生长指标测定 随机选取40～50株新鲜水稻幼苗，将幼苗根部用滤纸轻轻擦拭以吸去根部表面水分，测定单株幼苗鲜重。分别测定幼苗根基部到最上部展开叶叶鞘顶部的距离和到根尖部位的距离，即为幼苗株高和根长。 1. 2. 3 幼苗相关生理生化指标测定 生理生化指标测定参照王学奎和黄见良（2015）的方法。幼苗叶绿素含量采用乙醇提取比色法测定;可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定;可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝染色法测定;脯氨酸含量采用磺基水杨酸比色法测定;游离氨基酸含量采用茚三酮显色法测定;根系活力采用氯化三苯基四氮唑TTC法测定;茎叶组织硝态氮含量采用水杨酸法测定;幼苗丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸反应法测定;超氧化物歧化酶（SOD）活力采用氮蓝四唑法测定，过氧化物酶（POD）活力采用愈创木酚显色法测定;脱落酸含量参照酶联免疫分析试剂盒（纪宁生物科技有限公司）的说明方法测定。
1. 2. 4 实时荧光定量PCR测定脱落酸通路关键基因表达 水稻叶片总RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR测定分别按照相应试剂盒说明书（诺唯赞生物科技有限公司）进行。于NCBI搜索水稻脱落酸代谢通路相关基因及常用水稻内参基因β-Actin序列，所用引物序列详见表1。
1. 3 统计分析
采用Excel 2010及SPSS 21进行数据处理，采用GraphPad Prism 8.0作图，采用LSD法进行数据显著差异性分析。
2 结果与分析
2. 1 NAG对水稻幼苗抗寒性的影响
2. 1. 1 不同浓度NAG对低温胁迫下水稻幼苗生长的影响 经不同浓度NAG根系培养后，由寒害幼苗整体生长情况（图1-A）可看出，低温寒害后，0 mg/L对照组幼苗整体萎蔫不立挺，叶片形态发生变化，叶缘失水、叶尖卷曲;而经50和100 mg/L NAG根系培养的幼苗表型更立挺，叶片颜色更鲜绿，幼苗整体生长状态较对照组更优。表明外源施用NAG能够缓解低温对水稻的伤害，保护水稻幼苗。
由图1-B和图1-C可知，与0 mg/L对照组相比，经50、100和150 mg/L NAG处理后幼苗的单株鲜重分别增加11.94%、14.14%和9.93%;株高分别增加3.81%、7.14%和6.38%，且均与对照组差异显著（P<0.05，下同）。从图1-D可看出，50 mg/L NAG根系培养后幼苗根长与对照组无显著差异（P>0.05，下同），而100和150 mg/L NAG根系培养后幼苗的根长较对照组分别显著增加7.22%和5.87%。可见NAG根系处理对幼苗在低温条件下的促生长效果显著，能保护幼苗正常生长，其中，100 mg/L NAG处理组幼苗恢复生长的效果最佳，其单株鲜重（0.118±0.009 g）、株高（21.21±0.72 cm）和根长（5.76±0.43 cm）均为最大值。
2. 1. 2 不同浓度NAG对低温胁迫下水稻幼苗叶绿素及可溶性糖含量的影响 图2-A和图2-B分别显示了不同浓度NAG根系培养的幼苗在低温胁迫24 h及低温胁迫后于正常温度下恢复生长时叶绿素含量的变化。由图2-A可知，与0 mg/L对照组相比，经50、100和150 mg/L NAG处理后寒害幼苗的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均呈增加趋势，且同一指标不同处理组间差异显著，其中，100 mg/L NAG处理对寒害幼苗光合系统的促进作用相对较好，其叶绿素a含量（4.253±0.016 mg/g）、叶绿素b含量（1.707±0.008 mg/g）及总叶绿素含量（5.959±0.020 mg/g）较对照组增幅最大，分别显著增加36.65%、37.13%和36.79%。说明NAG根系处理能促进寒害幼苗叶绿素的合成，保护幼苗进行正常的光合作用以抵御寒害损伤。由图2-B可知，100 mg/L NAG处理还能显著促进寒害幼苗在恢复生长过程中的叶绿素积累，保证后续正常生长，相比对照组其幼苗中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别显著提高14.76%、20.17%和18.94%。
从图2-C可知，50、100和150 mg/L NAG根系处理促进了幼苗在低温下渗透调节物质可溶性糖的积累，分别较对照组增加23.26%、63.09%和40.46%，其中，100 mg/L NAG处理组的可溶性糖含量（41.031±0.992 μg/g）增长趋势最明显，且各处理组间差异均达显著水平。说明NAG可有效调控寒害幼苗机体渗透势，从而保护幼苗抵御寒害损伤。
综合对比幼苗的长势、生长指标、叶绿素含量及可溶性糖积累等结果，发现低温胁迫过程中，外源施用一定浓度的NAG可保護水稻幼苗在低温环境下正常生长，提高水稻的抗寒效果。从不同浓度NAG的抗寒效果及经济效益考虑，本研究中100 mg/L为最适施用浓度。
2. 2 NAG对水稻幼苗的抗寒生理生化机制研究
2. 2. 1 NAG对水稻幼苗渗透调节系统的影响 由图3-A可看出，100 mg/L NAG根系处理对常温环境幼苗起到促生长作用，同时在一定程度上缓解了低温对水稻生长的损伤，促进幼苗正常生长。
由图3-B～图3-D可看出，低温对照组的可溶性蛋白含量较常温对照组提高19.88%，低温处理组的可溶性蛋白含量较常温处理组提高13.83%;低温对照组幼苗脯氨酸含量是常温对照组幼苗的1.93倍，而低温处理组幼苗的脯氨酸含量升高至常温处理组的2.07倍，表明在遭受低温胁迫后，水稻幼苗能在一定程度上通过积累可溶性蛋白和脯氨酸来调控自身代谢，而外源施用NAG进一步促进了寒害幼苗中可溶性蛋白、脯氨酸和游离氨基酸的积累量，较低温对照组分别显著增长19.58%、19.49%和36.82%，从而更进一步调控幼苗机体渗透势，保护其抵抗寒害逆境影响。
2. 2. 2 NAG对水稻幼苗根系系统的影响 由图4-A可看出，低温胁迫会导致幼苗的根系活力下降，其中低温对照组的根系活力较常温对照组幼苗降低23.15%，低温处理组的根系活力较常温处理组降低36.17%;而外源NAG能在常温及低温环境下促进幼苗根系活力分别提高至相应对照的1.88和1.56倍，说明NAG能有效缓解低温对幼苗根系的伤害，从而保护水稻根系抵御逆境胁迫。 由图4-B可知，低温胁迫24 h后低温对照组水稻幼苗茎叶部位的硝态氮含量较常温对照组提高23.62%，表明低温会造成幼苗茎叶组织的硝态氮积累，抑制其被进一步转化利用;而NAG处理显著降低常温及寒害幼苗中硝态氮含量，较相应对照组分别降低12.37%和15.65%，促进了幼苗茎叶组织对根系硝态氮的充分转化，从而调控机体代谢并抵御寒害。
2. 2. 3 NAG对水稻幼苗抗氧化系统的影响 由图5-A可知，低温会导致水稻幼苗中MDA积累，其中低温对照组水稻幼苗MDA含量較常温对照组显著增加36.65%，而低温处理组幼苗较常温处理组仅增加11.63%，可见NAG根系处理能减缓低温环境幼苗的MDA积累。同时外源NAG能有效降低寒害幼苗中MDA含量，较低温对照组显著下降23.92%。
由图5-B和图5-C可知，寒害处理后低温对照组较常温对照组幼苗的SOD活力显著提高19.68%，POD活力显著提高20.21%。NAG的施用能进一步提高幼苗的SOD和POD活力，其中常温处理组较常温对照组幼苗SOD活力显著提高36.34%，POD活力略有提高但差异不显著;而低温处理组较低温对照组幼苗的SOD和POD活力分别显著提高34.94%和25.42%，表明NAG有效保护了幼苗的抗氧化系统，减缓过氧化损伤以抵抗寒害逆境。
2. 2. 4 NAG对水稻幼苗脱落酸代谢调节的影响
由图6-A可看出，低温胁迫后，幼苗自身脱落酸积累量增加，低温对照组幼苗的脱落酸含量较常温对照组增加16.18%;外源施用NAG后低温处理组较低温对照组幼苗的脱落酸含量显著提高16.45%，说明NAG根系处理能进一步促进寒害幼苗的脱落酸积累。
OsZEP、OsNCED、OsSDR和AAO基因是植物脱落酸代谢通路中4类关键酶——玉米黄质环氧化酶（Zeaxanthin epoxidase，ZEP）、9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）、短链醇脱氢/还原酶（Short chain dehydrogenases/reductases，SDR）和脱落醛氧化酶（Abscisic aldehyde oxidase，AO）分别对应的4个关键调控基因（Wan and Li，2004）。由图6-B～图6-E可知，正常条件下，NAG常温处理组幼苗中OsNCED和AAO基因相对表达量分别增长至常温对照组的2.32和1.50倍，OsZEP基因相对表达量显著下降，而OsSDR基因相对表达量无显著变化。低温胁迫后，无论是无糖处理组还是NAG处理组水稻幼苗中4种基因的相对表达量均呈下降趋势;但外源施用NAG能显著促进寒害幼苗中OsNCED、AAO和OsSDR基因的相对表达。其中，低温处理组幼苗的OsNCED和AAO基因相对表达量分别显著提升至低温对照组的3.52和1.64倍，OsSDR基因相对表达量增长至1.73倍，几乎已恢复至幼苗未经寒害处理时的水平。表明NAG根系处理能在低温胁迫条件下调控水稻幼苗脱落酸代谢途径中OsNCED、OsSDR和AAO等脱落酸生物合成关键基因的表达，从而进一步显著促进寒害水稻幼苗中内源脱落酸的合成与积累来抵御寒害损伤。
3 讨论
植物的生长状态能直观地反映植物面对外界寒害等逆境的感应及耐受能力。研究表明低温会延缓水稻等农作物的生长发育，造成叶片坏死、脱色、白化、衰老发黄萎蔫、叶面积减小等严重损伤（Li et al.，2017）。本研究发现，外源施用NAG根系培养能有效缓解寒害下水稻幼苗萎蔫、叶缘失水、叶尖卷曲等不良状态，使幼苗的生长状态更优，表明NAG能有效减缓低温对水稻的损伤，具有促进水稻抗寒的效果。植物单株鲜重、株高、根长等生长指标能反映植物地上部分及根系组织的生长情况，郑典元等（2012）研究指出壳寡糖能促进水稻株高、根长等生长指标，降低电导率，提高过氧化氢酶（CAT）活性，进而提高水稻抗寒性。张运红等（2017）研究表明，镉胁迫下外源喷施海藻酸钠寡糖可提高水稻幼苗的株高、穗长和千粒重，进而促进水稻正常生长发育。本研究结果与上述研究结果相似，施用NAG根系处理后水稻幼苗的单株鲜重、株高和根长均较对照组明显提高，表明NAG对低温条件下水稻根系及地上茎叶组织的促生长效果显著，能保护幼苗在低温胁迫下正常生长发育，推测其在植物抗寒领域具有较好的实际应用潜力。
光合作用的强弱可反映植物的生长状态，而叶绿素是评价植物光合能力的重要指标，其含量高低与植物抗寒性密切相关，冷适应能力强的植物能通过调控叶绿素等光合作用色素的合成代谢来抵御寒害影响（Liu et al.，2018）。本研究结果表明，NAG可促进水稻在低温胁迫及恢复生长过程中叶绿素含量的积累，促使寒害幼苗保持正常的光合作用。与姜秀梅（2014）研究报道的壳聚糖、甜菜碱、水杨酸等外源物质可提高寒害辣椒幼苗中叶绿素含量和渗透调节物质积累，进而提高其抗冷性的结论基本一致。但本研究结果与张洋（2018）研究中指出的壳寡糖可促进水稻寒害后恢复过程的叶绿素合成，而对水稻低温胁迫过程中叶绿素积累无显著促进作用的研究结果存在差异，表明不同外源糖对植物叶绿素的合成调控会有所不同，其原因可能在于NAG作为含氮多糖可充当氮源参与水稻碳氮代谢过程从而调控寒害过程中的光合能力，但具体原因尚需进一步研究。
渗透调节是植物抵抗逆境胁迫的重要调控机制，植物体通过积累可溶性糖（蔗糖、海藻糖等）、脯氨酸、可溶性蛋白、有机酸、钾和钙离子等不同类型的渗透调节离子或分子，以渗透调节、活性氧解毒、细胞膜稳定等方式维系植物体内水分环境并调控机体渗透势，从而抵抗逆境压力（Singh et al.，2015;邢芳芳等，2018）。本研究中，适宜浓度的NAG可有效促进寒害幼苗中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和游离氨基酸等渗透调节物质显著积累，与匡银近等（2009）通过壳寡糖浸种处理可增加水稻幼苗中可溶性糖、脯氨酸等渗透调节物质并减少电解质渗透，从而提高水稻抗冷性的研究结果相似，说明外源NAG可有效调节寒害水稻的渗透调节系统进而抵御寒害逆境。 根系是植物体重要的营养物质与水分吸收器官，根系活力是反映幼苗根系生长状况的重要指标，根系活力越高，植物对外界营养吸收的能力越强，相对抗寒能力越强（陈明辉等，2018）。本研究中，低温条件下水稻的根系活力大大下降，而外源施用NAG能促进寒害水稻幼苗根系活力提高，说明NAG能有效缓解低温逆境对根系系统的损伤，保护幼苗根系系统。此外，硝酸盐是植物生长的主要氮源，可促进植物调节自身碳氮代谢、营养吸收及生长发育等过程（张鹏等，2015）。本研究中，外源NAG使得寒害水稻的地上莖叶组织中硝态氮积累量显著下降，说明NAG能有效促进水稻茎叶组织对根系硝态氮的运输、吸收与还原同化，将硝态氮充分利用并转化进而提高水稻抗寒性。
抗氧化能力是表征植物抗性的重要指标之一，机体中脂质过氧化有害产物（MDA等）含量越少、抗氧化酶活性越高，机体抗氧化防御能力越强，抗寒能力越强（Ao et al.，2013）。Zou等（2017）研究指出外源施用不同聚合度的壳寡糖能促进小麦生长、降低MDA浓度、有效调控SOD、POD、CAT等抗氧化基因的表达并提高对应的抗氧化酶活性，从而缓解外界冷胁迫的损伤。Cao等（2014）研究表明外源蔗糖通过提高黄瓜叶片中SOD等抗氧化酶活性来提高黄瓜幼苗抗寒性。本研究与上述研究结果相似，当外源施用NAG进行根系处理时，寒害水稻幼苗中MDA积累量显著降低，SOD和POD活力均明显增加，表明NAG对寒害水稻幼苗的抗氧化系统具有保护作用。
目前，关于外源功能性糖在植物抗寒领域的研究主要与抗寒相关表型和生理生化调控指标相关，对于相关代谢通路的研究尚不深入。在已有研究报道中，陈巧（2016）从光合作用通路角度对壳寡糖诱导水稻的抗寒机制进行研究，证明壳寡糖修复了光损伤的光合系统II，加速了叶绿素b合成，通过改变渗透调节并减少氧化损伤从而提高水稻冷胁迫耐受性。Zhang等（2019）研究发现根系施用壳寡糖能诱导寒害水稻谷氨酸及脯氨酸通路相关关键基因表达，通过促进水稻谷氨酸代谢进而调控脯氨酸代谢，最终保护水稻幼苗抵御寒害。在众多代谢调控中，植物激素是植物面对逆境环境时调节自身生理和分子反应时最主要的内源物质之一，激素代谢调控在植物抵抗逆境胁迫时发挥关键作用（Fahad et al.，2015）。其中脱落酸作为植物面临寒害等逆境环境时的重要“胁迫激素”，可通过促进寒害幼苗根部疏水，清除有害自由基，调控机体迅速启动抗寒相关基因等过程来抵御寒害损伤（Cutler et al.，2010）。杨章旗（2011）研究表明，内源脱落酸在植物抗寒机制中发挥重要作用，低温胁迫条件下马尾松能通过调控自身内源脱落酸含量变化来调控自身SOD、POD、CAT、多酚氧化酶（PPO）等抗氧化酶活性的变化趋势，进而提高自身耐寒能力。刘航等（2015）研究指出，褐藻胶寡糖通过上调小麦中TaNCED、TaAOX和TaBG等脱落酸合成基因的转录，调控小麦脱落酸合成信号通路，进而刺激小麦叶片中内源脱落酸积累，并参与褐藻胶寡糖诱导的植物抗旱过程。Sharma等（2019）研究发现，水分胁迫下施用褐藻提取物能通过调控脱落酸生物合成基因表达进而调节脱落酸稳态，并特异性增强干旱胁迫保护基因表达，提高小麦耐旱性。本研究从脱落酸代谢通路入手，对NAG诱导水稻的抗寒机制进行研究，结果表明低温会造成水稻幼苗脱落酸代谢途径中关键基因OsZEP、OsNCED、AAO和OsSDR的表达量下降，但外源施用NAG能显著促进寒害幼苗中OsNCED、AAO和OsSDR基因的相对表达，从而实现幼苗中内源脱落酸积累量增长，推测外源NAG能通过调控水稻幼苗的脱落酸激素代谢途径来抵御寒害损伤。本研究从相关胁迫激素的代谢角度出发对NAG诱导水稻的抗寒机制进行阐述，在现有研究基础上，未来可与相关转录组学、代谢组学等方法结合，更全面地探究相关抗逆调控机制。因此，基于以上研究结果，推测NAG能充当糖原物质和信号物质，通过两种效应发挥协同作用，共同调控水稻幼苗抵抗外界低温胁迫损伤。
4 结论
低温胁迫下，采用根系处理方式外源施用NAG可保护水稻幼苗，恢复幼苗低温胁迫后生长过程中叶绿素的积累，促进其在低温环境下正常生长。其可能的调控机制在于：首先，NAG调节水稻幼苗的机体渗透势，促进渗透调节物质的积累和硝态氮的转化利用;其次，NAG的外源施用有效降低寒害幼苗中MDA含量，提高SOD和POD抗氧化酶活力，保护幼苗抗氧化系统;此外，NAG显著促进寒害幼苗脱落酸代谢通路中OsNCED、OsSDR和AAO基因表达，进而促进幼苗中内源脱落酸积累，通过脱落酸代谢途径保护幼苗抵御寒害。
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（責任编辑 王 晖）
关键词： N-乙酰氨基葡萄糖;水稻;抗寒性;脱落酸途径
Abstract：【Objective】To evaluate the cold resistance effect of N-acetyl-D-glucosamineon on rice seedlings，and to further explore its potential cold resistance mechanism，with a view to providing the theoretical basis for the application of NAG in the field of agricultural immune induction. 【Method】With the rice variety Nei 5 You 907 as the test material，different concentrations（0，50，100，150 mg/L） NAG were exogenously applied to rice seedlings for root culture. The growth potential，growth index，chlorophyll content and soluble sugar content of rice seedlings under low temperature conditions were measured to characterize the cold resistance effect of NAG and to screen the optimum applied concentration. Furthermore，the cold resistance mechanism of NAG on rice seedlings was explored from osmotic adjustment system，root system，antioxidant system and abscisic acid metabolism pathways at the physiological and biochemical level. 【Result】Exogenous application of NAG promoted the growth of rice seedlings in low temperature environments，and had obvious cold resistance effect. The optimum applied concentration was 100 mg/L. Under this concentration，the fresh weight（0.118±0.009 g），plant height（21.21±0.72 cm），root length（5.76±0.43 cm），soluble sugar（41.031±0.992 μg/g） and the total chlorophyll content（5.959±0.020 mg/g）of seedlings increased the most in comparison with the control group，which significantly increased by 14.14%，7.14%，7.22%，63.09% and 36.79% respectively（P<0.05，the same below）. The results of the physiological and biochemical level showed that 100 mg/L NAG promoted the accumulation of osmotic adjustment substances， soluble protein， proline，free amino acid in the cold injury seedlings increased significantly by 19.58%，19.49% and 36.82% respectively compared with the control group;effectively protected the root system of seedlings，the root acti-vity of cold injury seedlings was increased to 1.56 times，and the nitrate nitrogen content in the stem and leaf tissues was decreased by 15.65% compared with the low-temperature control group;effectively reduced the accumulation of malondialdehyde in the cold injury seedlings by 23.92% and increased the activities of superoxide dismutase（SOD） and peroxidase（POD） by 34.94% and 25.42% respectively，thereby protecting the antioxidant system of seedlings;increased the OsNCED，OsSDR and AAO genes expression in the abscisic acid metabolism pathway to 3.52，1.73 and 1.64 times of low temperature control，so as to achieve the accumulation of endogenous abscisic acid in cold injury seedlings. 【Conclusion】Exogenous application of NAG with root treatment can regulate osmotic adjustment system，root system， antioxidant system and the endogenous abscisic acid metabolism pathway of rice seedlings under cold stress，thereby improving the cold resistance of rice. Key words： N-acetyl-D-glucosamine; rice; cold resistance; abscisic acid pathway
0 引言
【研究意义】植物生长过程中通常会面临生物胁迫（病毒、虫害、真菌等）及非生物胁迫（寒害、旱害、盐碱、矿物质缺乏、重金属等）的压力，其中温度是植物生长发育的重要条件之一（Lukatkin et al.，2012）。水稻作为亚热带喜温植物，对低温环境敏感，低温会造成水稻幼苗生长发育不良甚至死亡，严重影响水稻产量（Hussain et al.，2016）。为提高植物的抗寒能力，脱落酸、多效唑、氯胆碱等植物生长调节剂及甜菜碱、多胺等化合物作为抗寒剂已被广泛应用（Hussain et al.，2018）。化学抗寒剂虽效果较优，但易产生化学残留并危害植物生长，造成环境污染。所以开发对植物威胁小、绿色、安全且具有良好经济效益的植物免疫诱抗剂尤为重要。目前，甲壳素及其衍生物作为含氮多糖，凭借其安全、绿色等优势已被广泛应用于免疫诱抗领域，N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）是葡萄糖分子中C2上羟基被乙酰氨基所替代的一种氨基己糖，是构成甲壳素的结构单元物质，但其在植物免疫诱抗领域的应用研究较为少见。此外，关于外源功能性糖在植物抗寒领域的机制研究尚不清晰，对于相关代谢通路的研究尚不深入。因此，探究NAG对水稻幼苗的抗寒作用及其潜在的抗寒机制，可为NAG在农业免疫诱抗领域的应用提供理论支撑，对保护水稻抵御外界低温胁迫损伤具有重要意义。【前人研究进展】郝林华等（2006）研究指出，牛蒡寡糖作为新型寡糖可显著保护低温胁迫后黄瓜幼苗细胞膜稳定性及抗氧化酶系统，进而调控植物抗寒。刘瑞志等（2009）研究发现，0.2%的褐藻寡糖通过提高烟草的抗逆酶活力，减少寒害对细胞组织的损伤，促进其抵御寒害逆境。刘同梅（2018）研究表明，海藻酸钠寡糖通过诱导水杨酸通路激活拟南芥免疫途径达到抗病效果。此外，壳寡糖和几丁寡糖作为两种不同的甲壳素类氨基寡糖，已有较成熟的产品被开发应用于植物免疫诱抗领域（Yin et al.，2016）。Shigeru等（2006）研究发现，几丁寡糖通过诱导水稻根及叶中激发子响应基因及抗性防御基因表达，在水稻中传递系统性信号并抵御稻瘟病真菌。姚艳平等（2013）研究表明，几丁寡糖可通过诱导调控抗病相关酶活性及相关植物保卫素等机制调控机体，抑制木霉菌的产生。王梦雨等（2016）研究报道，喷施壳寡糖可促进小麦中可溶性糖、脯氨酸等低温抗性相关物质表达，保护小麦抵抗低温胁迫。田路（2019）研究了壳寡糖对不同花椒种质间耐寒性差异的影响，发现100 mg/L壳寡糖处理能有效调节寒害花椒幼苗的渗透系统及抗氧化系统，从而促进其抗寒。【本研究切入点】相关研究表明，乙酰基团在植物免疫诱抗中发挥重要作用，而NAG作为一种含有乙酰基团的甲壳素结构单元，具有抗菌（Gaderer et al.，2017）、抗病（Kashulin et al.，2000）等多方面生理活性，推测其在水稻抗寒领域可能具有较大的应用潜力，但其在农作物免疫诱抗领域鲜有研究。同时，NAG现已实现发酵法进行大规模的生物制造，将其应用于农业领域能降低现有抗寒成本，具有良好的经济效益和市场前景。【拟解决的关键问题】以水稻品种内5优907为供试材料，外源施用不同浓度NAG进行根系培养，测定并比较低温条件下水稻幼苗的长势及生长指标，并进一步在生理生化水平上分析NAG对水稻幼苗脱落酸代谢通路、渗透调节系统、根系系统和抗氧化系统的调控影响，探究NAG根系处理对水稻的抗寒效果及其潜在的抗寒机制，为NAG在农业免疫诱抗领域的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为内5优907水稻种子，购自四川丰禾种业有限公司;N-乙酰氨基葡萄糖（分子式为C8H15NO6，分子量为221.09，纯度为98%）购自山东润德生物科技有限公司;脯氨酸、茚三酮、磺基水杨酸、硫代巴比妥酸和氮蓝四唑等均为分析纯，购自泰坦科技股份有限公司。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 植物培养与处理 选择粒大饱满、颗粒均匀的水稻种子置于清水中充分浸泡，将沉于底部的质量较好的种子进行清水漂洗并浸泡于75%乙醇溶液消毒15 min，清水冲洗数遍直至无乙醇殘留。将水稻种子置于30 ℃去离子水中浸种48 h，然后于30 ℃暗处催芽24 h。待其露白后，小心挑选露白一致的水稻种子移至96孔板中培养，然后将其移至植物光照培养箱中进行水培。培养条件：温度25 ℃，相对湿度75%，光照周期16 h/8 h（昼/夜）。为促进水稻种子及时获得营养，结合幼苗培养过程中的实际生长状态，水培（去离子水）约7 d后换用营养液培养（营养液参照国际水稻研究所研制的营养液配方配置），每隔2 d换液一次。
待幼苗生长至2叶1心期（共14 d左右）时添加NAG进行根系培养，具体方法如下：（1）抗寒效果浓度筛选时，NAG处理水平分别为0（对照）、50、100和150 mg/L。在光周期中光照条件下开始进行幼苗加糖的根系培养，加糖处理48 h后，开始低温胁迫处理（温度为5 ℃）24 h。（2）抗寒机制研究时，基于筛选得到的最优NAG处理浓度，幼苗分为常温对照组（未加NAG根系处理幼苗，常温培养）、常温处理组（施用NAG最优浓度根系处理幼苗，常温培养）、低温对照组（未加NAG根系处理幼苗，5 ℃低温胁迫培养24 h）和低温处理组（施用最优NAG浓度根系处理幼苗，5 ℃低温胁迫培养24 h）。随后在光照处理条件下进行取样，液氮冷冻后储存于-80 ℃冰箱，测定后续相关指标。
1. 2. 2 幼苗生长指标测定 随机选取40～50株新鲜水稻幼苗，将幼苗根部用滤纸轻轻擦拭以吸去根部表面水分，测定单株幼苗鲜重。分别测定幼苗根基部到最上部展开叶叶鞘顶部的距离和到根尖部位的距离，即为幼苗株高和根长。 1. 2. 3 幼苗相关生理生化指标测定 生理生化指标测定参照王学奎和黄见良（2015）的方法。幼苗叶绿素含量采用乙醇提取比色法测定;可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定;可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝染色法测定;脯氨酸含量采用磺基水杨酸比色法测定;游离氨基酸含量采用茚三酮显色法测定;根系活力采用氯化三苯基四氮唑TTC法测定;茎叶组织硝态氮含量采用水杨酸法测定;幼苗丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸反应法测定;超氧化物歧化酶（SOD）活力采用氮蓝四唑法测定，过氧化物酶（POD）活力采用愈创木酚显色法测定;脱落酸含量参照酶联免疫分析试剂盒（纪宁生物科技有限公司）的说明方法测定。
1. 2. 4 实时荧光定量PCR测定脱落酸通路关键基因表达 水稻叶片总RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR测定分别按照相应试剂盒说明书（诺唯赞生物科技有限公司）进行。于NCBI搜索水稻脱落酸代谢通路相关基因及常用水稻内参基因β-Actin序列，所用引物序列详见表1。
1. 3 统计分析
采用Excel 2010及SPSS 21进行数据处理，采用GraphPad Prism 8.0作图，采用LSD法进行数据显著差异性分析。
2 结果与分析
2. 1 NAG对水稻幼苗抗寒性的影响
2. 1. 1 不同浓度NAG对低温胁迫下水稻幼苗生长的影响 经不同浓度NAG根系培养后，由寒害幼苗整体生长情况（图1-A）可看出，低温寒害后，0 mg/L对照组幼苗整体萎蔫不立挺，叶片形态发生变化，叶缘失水、叶尖卷曲;而经50和100 mg/L NAG根系培养的幼苗表型更立挺，叶片颜色更鲜绿，幼苗整体生长状态较对照组更优。表明外源施用NAG能够缓解低温对水稻的伤害，保护水稻幼苗。
由图1-B和图1-C可知，与0 mg/L对照组相比，经50、100和150 mg/L NAG处理后幼苗的单株鲜重分别增加11.94%、14.14%和9.93%;株高分别增加3.81%、7.14%和6.38%，且均与对照组差异显著（P<0.05，下同）。从图1-D可看出，50 mg/L NAG根系培养后幼苗根长与对照组无显著差异（P>0.05，下同），而100和150 mg/L NAG根系培养后幼苗的根长较对照组分别显著增加7.22%和5.87%。可见NAG根系处理对幼苗在低温条件下的促生长效果显著，能保护幼苗正常生长，其中，100 mg/L NAG处理组幼苗恢复生长的效果最佳，其单株鲜重（0.118±0.009 g）、株高（21.21±0.72 cm）和根长（5.76±0.43 cm）均为最大值。
2. 1. 2 不同浓度NAG对低温胁迫下水稻幼苗叶绿素及可溶性糖含量的影响 图2-A和图2-B分别显示了不同浓度NAG根系培养的幼苗在低温胁迫24 h及低温胁迫后于正常温度下恢复生长时叶绿素含量的变化。由图2-A可知，与0 mg/L对照组相比，经50、100和150 mg/L NAG处理后寒害幼苗的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均呈增加趋势，且同一指标不同处理组间差异显著，其中，100 mg/L NAG处理对寒害幼苗光合系统的促进作用相对较好，其叶绿素a含量（4.253±0.016 mg/g）、叶绿素b含量（1.707±0.008 mg/g）及总叶绿素含量（5.959±0.020 mg/g）较对照组增幅最大，分别显著增加36.65%、37.13%和36.79%。说明NAG根系处理能促进寒害幼苗叶绿素的合成，保护幼苗进行正常的光合作用以抵御寒害损伤。由图2-B可知，100 mg/L NAG处理还能显著促进寒害幼苗在恢复生长过程中的叶绿素积累，保证后续正常生长，相比对照组其幼苗中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别显著提高14.76%、20.17%和18.94%。
从图2-C可知，50、100和150 mg/L NAG根系处理促进了幼苗在低温下渗透调节物质可溶性糖的积累，分别较对照组增加23.26%、63.09%和40.46%，其中，100 mg/L NAG处理组的可溶性糖含量（41.031±0.992 μg/g）增长趋势最明显，且各处理组间差异均达显著水平。说明NAG可有效调控寒害幼苗机体渗透势，从而保护幼苗抵御寒害损伤。
综合对比幼苗的长势、生长指标、叶绿素含量及可溶性糖积累等结果，发现低温胁迫过程中，外源施用一定浓度的NAG可保護水稻幼苗在低温环境下正常生长，提高水稻的抗寒效果。从不同浓度NAG的抗寒效果及经济效益考虑，本研究中100 mg/L为最适施用浓度。
2. 2 NAG对水稻幼苗的抗寒生理生化机制研究
2. 2. 1 NAG对水稻幼苗渗透调节系统的影响 由图3-A可看出，100 mg/L NAG根系处理对常温环境幼苗起到促生长作用，同时在一定程度上缓解了低温对水稻生长的损伤，促进幼苗正常生长。
由图3-B～图3-D可看出，低温对照组的可溶性蛋白含量较常温对照组提高19.88%，低温处理组的可溶性蛋白含量较常温处理组提高13.83%;低温对照组幼苗脯氨酸含量是常温对照组幼苗的1.93倍，而低温处理组幼苗的脯氨酸含量升高至常温处理组的2.07倍，表明在遭受低温胁迫后，水稻幼苗能在一定程度上通过积累可溶性蛋白和脯氨酸来调控自身代谢，而外源施用NAG进一步促进了寒害幼苗中可溶性蛋白、脯氨酸和游离氨基酸的积累量，较低温对照组分别显著增长19.58%、19.49%和36.82%，从而更进一步调控幼苗机体渗透势，保护其抵抗寒害逆境影响。
2. 2. 2 NAG对水稻幼苗根系系统的影响 由图4-A可看出，低温胁迫会导致幼苗的根系活力下降，其中低温对照组的根系活力较常温对照组幼苗降低23.15%，低温处理组的根系活力较常温处理组降低36.17%;而外源NAG能在常温及低温环境下促进幼苗根系活力分别提高至相应对照的1.88和1.56倍，说明NAG能有效缓解低温对幼苗根系的伤害，从而保护水稻根系抵御逆境胁迫。 由图4-B可知，低温胁迫24 h后低温对照组水稻幼苗茎叶部位的硝态氮含量较常温对照组提高23.62%，表明低温会造成幼苗茎叶组织的硝态氮积累，抑制其被进一步转化利用;而NAG处理显著降低常温及寒害幼苗中硝态氮含量，较相应对照组分别降低12.37%和15.65%，促进了幼苗茎叶组织对根系硝态氮的充分转化，从而调控机体代谢并抵御寒害。
2. 2. 3 NAG对水稻幼苗抗氧化系统的影响 由图5-A可知，低温会导致水稻幼苗中MDA积累，其中低温对照组水稻幼苗MDA含量較常温对照组显著增加36.65%，而低温处理组幼苗较常温处理组仅增加11.63%，可见NAG根系处理能减缓低温环境幼苗的MDA积累。同时外源NAG能有效降低寒害幼苗中MDA含量，较低温对照组显著下降23.92%。
由图5-B和图5-C可知，寒害处理后低温对照组较常温对照组幼苗的SOD活力显著提高19.68%，POD活力显著提高20.21%。NAG的施用能进一步提高幼苗的SOD和POD活力，其中常温处理组较常温对照组幼苗SOD活力显著提高36.34%，POD活力略有提高但差异不显著;而低温处理组较低温对照组幼苗的SOD和POD活力分别显著提高34.94%和25.42%，表明NAG有效保护了幼苗的抗氧化系统，减缓过氧化损伤以抵抗寒害逆境。
2. 2. 4 NAG对水稻幼苗脱落酸代谢调节的影响
由图6-A可看出，低温胁迫后，幼苗自身脱落酸积累量增加，低温对照组幼苗的脱落酸含量较常温对照组增加16.18%;外源施用NAG后低温处理组较低温对照组幼苗的脱落酸含量显著提高16.45%，说明NAG根系处理能进一步促进寒害幼苗的脱落酸积累。
OsZEP、OsNCED、OsSDR和AAO基因是植物脱落酸代谢通路中4类关键酶——玉米黄质环氧化酶（Zeaxanthin epoxidase，ZEP）、9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）、短链醇脱氢/还原酶（Short chain dehydrogenases/reductases，SDR）和脱落醛氧化酶（Abscisic aldehyde oxidase，AO）分别对应的4个关键调控基因（Wan and Li，2004）。由图6-B～图6-E可知，正常条件下，NAG常温处理组幼苗中OsNCED和AAO基因相对表达量分别增长至常温对照组的2.32和1.50倍，OsZEP基因相对表达量显著下降，而OsSDR基因相对表达量无显著变化。低温胁迫后，无论是无糖处理组还是NAG处理组水稻幼苗中4种基因的相对表达量均呈下降趋势;但外源施用NAG能显著促进寒害幼苗中OsNCED、AAO和OsSDR基因的相对表达。其中，低温处理组幼苗的OsNCED和AAO基因相对表达量分别显著提升至低温对照组的3.52和1.64倍，OsSDR基因相对表达量增长至1.73倍，几乎已恢复至幼苗未经寒害处理时的水平。表明NAG根系处理能在低温胁迫条件下调控水稻幼苗脱落酸代谢途径中OsNCED、OsSDR和AAO等脱落酸生物合成关键基因的表达，从而进一步显著促进寒害水稻幼苗中内源脱落酸的合成与积累来抵御寒害损伤。
3 讨论
植物的生长状态能直观地反映植物面对外界寒害等逆境的感应及耐受能力。研究表明低温会延缓水稻等农作物的生长发育，造成叶片坏死、脱色、白化、衰老发黄萎蔫、叶面积减小等严重损伤（Li et al.，2017）。本研究发现，外源施用NAG根系培养能有效缓解寒害下水稻幼苗萎蔫、叶缘失水、叶尖卷曲等不良状态，使幼苗的生长状态更优，表明NAG能有效减缓低温对水稻的损伤，具有促进水稻抗寒的效果。植物单株鲜重、株高、根长等生长指标能反映植物地上部分及根系组织的生长情况，郑典元等（2012）研究指出壳寡糖能促进水稻株高、根长等生长指标，降低电导率，提高过氧化氢酶（CAT）活性，进而提高水稻抗寒性。张运红等（2017）研究表明，镉胁迫下外源喷施海藻酸钠寡糖可提高水稻幼苗的株高、穗长和千粒重，进而促进水稻正常生长发育。本研究结果与上述研究结果相似，施用NAG根系处理后水稻幼苗的单株鲜重、株高和根长均较对照组明显提高，表明NAG对低温条件下水稻根系及地上茎叶组织的促生长效果显著，能保护幼苗在低温胁迫下正常生长发育，推测其在植物抗寒领域具有较好的实际应用潜力。
光合作用的强弱可反映植物的生长状态，而叶绿素是评价植物光合能力的重要指标，其含量高低与植物抗寒性密切相关，冷适应能力强的植物能通过调控叶绿素等光合作用色素的合成代谢来抵御寒害影响（Liu et al.，2018）。本研究结果表明，NAG可促进水稻在低温胁迫及恢复生长过程中叶绿素含量的积累，促使寒害幼苗保持正常的光合作用。与姜秀梅（2014）研究报道的壳聚糖、甜菜碱、水杨酸等外源物质可提高寒害辣椒幼苗中叶绿素含量和渗透调节物质积累，进而提高其抗冷性的结论基本一致。但本研究结果与张洋（2018）研究中指出的壳寡糖可促进水稻寒害后恢复过程的叶绿素合成，而对水稻低温胁迫过程中叶绿素积累无显著促进作用的研究结果存在差异，表明不同外源糖对植物叶绿素的合成调控会有所不同，其原因可能在于NAG作为含氮多糖可充当氮源参与水稻碳氮代谢过程从而调控寒害过程中的光合能力，但具体原因尚需进一步研究。
渗透调节是植物抵抗逆境胁迫的重要调控机制，植物体通过积累可溶性糖（蔗糖、海藻糖等）、脯氨酸、可溶性蛋白、有机酸、钾和钙离子等不同类型的渗透调节离子或分子，以渗透调节、活性氧解毒、细胞膜稳定等方式维系植物体内水分环境并调控机体渗透势，从而抵抗逆境压力（Singh et al.，2015;邢芳芳等，2018）。本研究中，适宜浓度的NAG可有效促进寒害幼苗中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和游离氨基酸等渗透调节物质显著积累，与匡银近等（2009）通过壳寡糖浸种处理可增加水稻幼苗中可溶性糖、脯氨酸等渗透调节物质并减少电解质渗透，从而提高水稻抗冷性的研究结果相似，说明外源NAG可有效调节寒害水稻的渗透调节系统进而抵御寒害逆境。 根系是植物体重要的营养物质与水分吸收器官，根系活力是反映幼苗根系生长状况的重要指标，根系活力越高，植物对外界营养吸收的能力越强，相对抗寒能力越强（陈明辉等，2018）。本研究中，低温条件下水稻的根系活力大大下降，而外源施用NAG能促进寒害水稻幼苗根系活力提高，说明NAG能有效缓解低温逆境对根系系统的损伤，保护幼苗根系系统。此外，硝酸盐是植物生长的主要氮源，可促进植物调节自身碳氮代谢、营养吸收及生长发育等过程（张鹏等，2015）。本研究中，外源NAG使得寒害水稻的地上莖叶组织中硝态氮积累量显著下降，说明NAG能有效促进水稻茎叶组织对根系硝态氮的运输、吸收与还原同化，将硝态氮充分利用并转化进而提高水稻抗寒性。
抗氧化能力是表征植物抗性的重要指标之一，机体中脂质过氧化有害产物（MDA等）含量越少、抗氧化酶活性越高，机体抗氧化防御能力越强，抗寒能力越强（Ao et al.，2013）。Zou等（2017）研究指出外源施用不同聚合度的壳寡糖能促进小麦生长、降低MDA浓度、有效调控SOD、POD、CAT等抗氧化基因的表达并提高对应的抗氧化酶活性，从而缓解外界冷胁迫的损伤。Cao等（2014）研究表明外源蔗糖通过提高黄瓜叶片中SOD等抗氧化酶活性来提高黄瓜幼苗抗寒性。本研究与上述研究结果相似，当外源施用NAG进行根系处理时，寒害水稻幼苗中MDA积累量显著降低，SOD和POD活力均明显增加，表明NAG对寒害水稻幼苗的抗氧化系统具有保护作用。
目前，关于外源功能性糖在植物抗寒领域的研究主要与抗寒相关表型和生理生化调控指标相关，对于相关代谢通路的研究尚不深入。在已有研究报道中，陈巧（2016）从光合作用通路角度对壳寡糖诱导水稻的抗寒机制进行研究，证明壳寡糖修复了光损伤的光合系统II，加速了叶绿素b合成，通过改变渗透调节并减少氧化损伤从而提高水稻冷胁迫耐受性。Zhang等（2019）研究发现根系施用壳寡糖能诱导寒害水稻谷氨酸及脯氨酸通路相关关键基因表达，通过促进水稻谷氨酸代谢进而调控脯氨酸代谢，最终保护水稻幼苗抵御寒害。在众多代谢调控中，植物激素是植物面对逆境环境时调节自身生理和分子反应时最主要的内源物质之一，激素代谢调控在植物抵抗逆境胁迫时发挥关键作用（Fahad et al.，2015）。其中脱落酸作为植物面临寒害等逆境环境时的重要“胁迫激素”，可通过促进寒害幼苗根部疏水，清除有害自由基，调控机体迅速启动抗寒相关基因等过程来抵御寒害损伤（Cutler et al.，2010）。杨章旗（2011）研究表明，内源脱落酸在植物抗寒机制中发挥重要作用，低温胁迫条件下马尾松能通过调控自身内源脱落酸含量变化来调控自身SOD、POD、CAT、多酚氧化酶（PPO）等抗氧化酶活性的变化趋势，进而提高自身耐寒能力。刘航等（2015）研究指出，褐藻胶寡糖通过上调小麦中TaNCED、TaAOX和TaBG等脱落酸合成基因的转录，调控小麦脱落酸合成信号通路，进而刺激小麦叶片中内源脱落酸积累，并参与褐藻胶寡糖诱导的植物抗旱过程。Sharma等（2019）研究发现，水分胁迫下施用褐藻提取物能通过调控脱落酸生物合成基因表达进而调节脱落酸稳态，并特异性增强干旱胁迫保护基因表达，提高小麦耐旱性。本研究从脱落酸代谢通路入手，对NAG诱导水稻的抗寒机制进行研究，结果表明低温会造成水稻幼苗脱落酸代谢途径中关键基因OsZEP、OsNCED、AAO和OsSDR的表达量下降，但外源施用NAG能显著促进寒害幼苗中OsNCED、AAO和OsSDR基因的相对表达，从而实现幼苗中内源脱落酸积累量增长，推测外源NAG能通过调控水稻幼苗的脱落酸激素代谢途径来抵御寒害损伤。本研究从相关胁迫激素的代谢角度出发对NAG诱导水稻的抗寒机制进行阐述，在现有研究基础上，未来可与相关转录组学、代谢组学等方法结合，更全面地探究相关抗逆调控机制。因此，基于以上研究结果，推测NAG能充当糖原物质和信号物质，通过两种效应发挥协同作用，共同调控水稻幼苗抵抗外界低温胁迫损伤。
4 结论
低温胁迫下，采用根系处理方式外源施用NAG可保护水稻幼苗，恢复幼苗低温胁迫后生长过程中叶绿素的积累，促进其在低温环境下正常生长。其可能的调控机制在于：首先，NAG调节水稻幼苗的机体渗透势，促进渗透调节物质的积累和硝态氮的转化利用;其次，NAG的外源施用有效降低寒害幼苗中MDA含量，提高SOD和POD抗氧化酶活力，保护幼苗抗氧化系统;此外，NAG显著促进寒害幼苗脱落酸代谢通路中OsNCED、OsSDR和AAO基因表达，进而促进幼苗中内源脱落酸积累，通过脱落酸代谢途径保护幼苗抵御寒害。
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（責任编辑 王 晖）