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摘 要:目的:建立了复方鲜竹沥口服液的质量标准。方法:采用薄层色谱法对鱼腥草、桔梗进行定性鉴别,采用HPLC测定枇杷叶中熊果酸的含量。结果:薄层色谱法能准确鉴别鱼腥草、桔梗,HPLC能准确测定熊果酸的含量,测得熊果酸的线性范围为2.04~40.84μg·mL-1,R=0.9999;平均回收率为99.32%,RSD(%)=0.58%。结论:该方法准确、可行,可作为复方鲜竹沥口服液的质量标准。
关键词:复方鲜竹沥口服液;熊果酸;薄层色谱法;HPLC
复方鲜竹沥口服液为祛痰剂,具有清热化痰,止咳之功效,主治痰热咳嗽,痰黄黏稠。由鲜竹沥、鱼腥草、枇杷叶、桔梗、半夏、生姜、薄荷油加工而成的中药复方口服液。为了更好的控制本品质量,建立了復方鲜竹沥口服液的质量标准研究,采用薄层色谱法对鱼腥草、桔梗进行定性鉴别,采用HPLC法测定枇杷叶中熊果酸的含量。
1 仪器、试药及样品
高效液相色谱仪(岛津Nexera XR);迪马C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱;熊果酸对照品(中检所,批号:110742-201220),甲基正壬酮对照品、桔梗对照药材(中检所);乙腈为色谱纯,水为纯净水,其它试剂均为分析纯;复方鲜竹沥口服液(市售样品,规格:10ml*10支)。
2 薄层鉴别
薄层鉴别 结合本产品特点,参照药典,建立了鱼腥草、桔梗、半夏药材的薄层定性鉴别方法。
2.1 鱼腥草鉴别。取本品200ml,置圆底烧瓶中,加水100ml,连接挥发油测定器。自测定器上端加水使充满刻度部分,再加醋酸乙酯1ml,连接回流冷凝管,加热回流1小时,停止加热,放置片刻,分取醋酸乙酯层,作为供试品溶液。另取甲基正壬酮对照品,加醋酸乙酯制成每1ml含10μg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液10μl,对照品溶液5μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以正己烷-醋酸乙酯(8:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以二硝基苯肼试液,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的黄色斑点。
2.2 桔梗鉴别。取本品10ml,加7%硫酸乙醇-水(1:3)混合溶液10ml,加热回流30分钟,放冷,用三氯甲烷振摇提取2次,每次20m1,合并三氯甲烷液,加水洗涤2次,每次30ml,弃去洗液,三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取桔梗对照药材1g,加7%硫酸乙醇-水(1:3)混合溶液20ml,加热回流2小时,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙醚(2:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
2.3 专属性试验。分别取不含鱼腥草的阴性样品、不含桔梗的阴性样品,按上述各自方法制成阴性样品供试品溶液。结果在与甲基正壬酮对照品色谱相应的位置上,鱼腥草阴性样品不显相同的黄色斑点。在与桔梗对照药材色谱相应的位置上,不含桔梗的阴性样品不显相同颜色的斑点。本品其他成分不干扰鱼腥草、桔梗的定性鉴别,专属性良好。
3 含量测定 建立了HPLC法测定本品中枇杷叶主要有效成分熊果酸含量方法
3.1 色谱条件。以十八烷基砝烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液(65:15:20)为流动相;柱温35℃;进样量20μl;检测波长为210nm。理论板数按熊果酸峰计算应不低于5000。
3.2 对照品溶液的制备。取熊果酸对照品适量,精密称定,加95%乙醇制成每1ml含熊果酸20μg的溶液,即得。
3.3 供试品溶液的制备。精密取本品5ml,置50ml量瓶中,加入95%乙醇适量,超声处理(功率250W,频率50kHz)10分钟,放冷,加95%乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3.4 专属性试验。按处方比例制备不含枇杷叶的阴性样品,按供试品方法制备阴性样品溶液,结果表明,阴性样品溶液在熊果酸色谱峰处无干扰峰,方法专属性良好。
3.5 线性关系考察。精密称取熊果酸对照品10.21mg,置50ml量瓶中,加95%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品原液。精密量取对照品原液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0ml,分别置10ml量瓶中,加95%乙醇稀释至刻度,摇匀,作为不同浓度的对照品溶液。照含量测定法,精密量取20μl,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标作线性回归,详见表1。
结果表明,熊果酸在浓度为2.04~40.84μg·mL-1的范围内线性关系良好。
3.6 重复性试验。取同一批号样品,平行测定6次,计算含量,考察含量结果的相对标准偏差,结果符合规定,重复性良好,详见表2。
3.7 准确度试验。精密称取熊果酸对照品10.14mg,加95%乙醇溶解并稀释至刻度,作为对照品原液。精密量取本品2.5ml,共9份,置50ml量瓶中,分别精密加入对照品原液2.0、2.5、3.0ml(每个浓度3份),加入95%乙醇适量,超声处理(功率250W,频率50kHz)10分钟,放冷,加95%乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,作为回收率供试品溶液。同法配制对照品溶液。精密量取供试品及对照品溶液各20μl,注入高效液相色谱仪,记录峰面积,以外标法计算熊果酸的回收率,详见表3。
结果表明,熊果酸在高、中、低3个浓度下的回收率均在98%-102%,RSD小于2.0%,说明本方法准确度良好。
3.8 样品测定 用已建立的熊果酸含量测定方法测定3个不同批号的市售样品,详见表4。
结果表明,3个不同批次的样品含量测定结果均符合规定,且批次间熊果酸含量无明显差异,含量均一。
4 结论
经过方法学验证试验表明,建立的薄层色谱法和高效液相色谱法,可用于本产品的质量控制。
5 讨论
5.1 鱼腥草的主要成分为挥发油,油中主要为甲基壬酮,所以对鱼腥草药材主要定性鉴别甲基壬酮。药典中展开剂为正己烷-醋酸乙酯(9:1),而本品采用此展开剂比移值(Rf=0.2)较小,分离效果不佳,经过实验摸索,采用正己烷-醋酸乙酯(8:2)比例,比移值符合规定(Rf=0.5),分离效果好,斑点清晰。
5.2 枇杷叶中熊果酸的流动相系统采用乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液(65:15:20),熊果酸色谱峰与相邻色谱峰达到良好分离,峰形柱效均符合规定。由于本产品成分较多,采用药典枇杷叶药材熊果酸流动相乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液(67:12:21),与相邻一个色谱峰未完全分开,所以减少乙腈量,延后保留时间,达到完全分离。
参考文献
[1]中华人民共和国药典(一部).化学工业出版社,2015:224.
[2]中华人民共和国药典(一部).化学工业出版社,2015:227.
[3]中华人民共和国药典(一部).化学工业出版社,2015:204-205.
关键词:复方鲜竹沥口服液;熊果酸;薄层色谱法;HPLC
复方鲜竹沥口服液为祛痰剂,具有清热化痰,止咳之功效,主治痰热咳嗽,痰黄黏稠。由鲜竹沥、鱼腥草、枇杷叶、桔梗、半夏、生姜、薄荷油加工而成的中药复方口服液。为了更好的控制本品质量,建立了復方鲜竹沥口服液的质量标准研究,采用薄层色谱法对鱼腥草、桔梗进行定性鉴别,采用HPLC法测定枇杷叶中熊果酸的含量。
1 仪器、试药及样品
高效液相色谱仪(岛津Nexera XR);迪马C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱;熊果酸对照品(中检所,批号:110742-201220),甲基正壬酮对照品、桔梗对照药材(中检所);乙腈为色谱纯,水为纯净水,其它试剂均为分析纯;复方鲜竹沥口服液(市售样品,规格:10ml*10支)。
2 薄层鉴别
薄层鉴别 结合本产品特点,参照药典,建立了鱼腥草、桔梗、半夏药材的薄层定性鉴别方法。
2.1 鱼腥草鉴别。取本品200ml,置圆底烧瓶中,加水100ml,连接挥发油测定器。自测定器上端加水使充满刻度部分,再加醋酸乙酯1ml,连接回流冷凝管,加热回流1小时,停止加热,放置片刻,分取醋酸乙酯层,作为供试品溶液。另取甲基正壬酮对照品,加醋酸乙酯制成每1ml含10μg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液10μl,对照品溶液5μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以正己烷-醋酸乙酯(8:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以二硝基苯肼试液,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的黄色斑点。
2.2 桔梗鉴别。取本品10ml,加7%硫酸乙醇-水(1:3)混合溶液10ml,加热回流30分钟,放冷,用三氯甲烷振摇提取2次,每次20m1,合并三氯甲烷液,加水洗涤2次,每次30ml,弃去洗液,三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取桔梗对照药材1g,加7%硫酸乙醇-水(1:3)混合溶液20ml,加热回流2小时,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙醚(2:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
2.3 专属性试验。分别取不含鱼腥草的阴性样品、不含桔梗的阴性样品,按上述各自方法制成阴性样品供试品溶液。结果在与甲基正壬酮对照品色谱相应的位置上,鱼腥草阴性样品不显相同的黄色斑点。在与桔梗对照药材色谱相应的位置上,不含桔梗的阴性样品不显相同颜色的斑点。本品其他成分不干扰鱼腥草、桔梗的定性鉴别,专属性良好。
3 含量测定 建立了HPLC法测定本品中枇杷叶主要有效成分熊果酸含量方法
3.1 色谱条件。以十八烷基砝烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液(65:15:20)为流动相;柱温35℃;进样量20μl;检测波长为210nm。理论板数按熊果酸峰计算应不低于5000。
3.2 对照品溶液的制备。取熊果酸对照品适量,精密称定,加95%乙醇制成每1ml含熊果酸20μg的溶液,即得。
3.3 供试品溶液的制备。精密取本品5ml,置50ml量瓶中,加入95%乙醇适量,超声处理(功率250W,频率50kHz)10分钟,放冷,加95%乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3.4 专属性试验。按处方比例制备不含枇杷叶的阴性样品,按供试品方法制备阴性样品溶液,结果表明,阴性样品溶液在熊果酸色谱峰处无干扰峰,方法专属性良好。
3.5 线性关系考察。精密称取熊果酸对照品10.21mg,置50ml量瓶中,加95%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品原液。精密量取对照品原液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0ml,分别置10ml量瓶中,加95%乙醇稀释至刻度,摇匀,作为不同浓度的对照品溶液。照含量测定法,精密量取20μl,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标作线性回归,详见表1。
结果表明,熊果酸在浓度为2.04~40.84μg·mL-1的范围内线性关系良好。
3.6 重复性试验。取同一批号样品,平行测定6次,计算含量,考察含量结果的相对标准偏差,结果符合规定,重复性良好,详见表2。
3.7 准确度试验。精密称取熊果酸对照品10.14mg,加95%乙醇溶解并稀释至刻度,作为对照品原液。精密量取本品2.5ml,共9份,置50ml量瓶中,分别精密加入对照品原液2.0、2.5、3.0ml(每个浓度3份),加入95%乙醇适量,超声处理(功率250W,频率50kHz)10分钟,放冷,加95%乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,作为回收率供试品溶液。同法配制对照品溶液。精密量取供试品及对照品溶液各20μl,注入高效液相色谱仪,记录峰面积,以外标法计算熊果酸的回收率,详见表3。
结果表明,熊果酸在高、中、低3个浓度下的回收率均在98%-102%,RSD小于2.0%,说明本方法准确度良好。
3.8 样品测定 用已建立的熊果酸含量测定方法测定3个不同批号的市售样品,详见表4。
结果表明,3个不同批次的样品含量测定结果均符合规定,且批次间熊果酸含量无明显差异,含量均一。
4 结论
经过方法学验证试验表明,建立的薄层色谱法和高效液相色谱法,可用于本产品的质量控制。
5 讨论
5.1 鱼腥草的主要成分为挥发油,油中主要为甲基壬酮,所以对鱼腥草药材主要定性鉴别甲基壬酮。药典中展开剂为正己烷-醋酸乙酯(9:1),而本品采用此展开剂比移值(Rf=0.2)较小,分离效果不佳,经过实验摸索,采用正己烷-醋酸乙酯(8:2)比例,比移值符合规定(Rf=0.5),分离效果好,斑点清晰。
5.2 枇杷叶中熊果酸的流动相系统采用乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液(65:15:20),熊果酸色谱峰与相邻色谱峰达到良好分离,峰形柱效均符合规定。由于本产品成分较多,采用药典枇杷叶药材熊果酸流动相乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液(67:12:21),与相邻一个色谱峰未完全分开,所以减少乙腈量,延后保留时间,达到完全分离。
参考文献
[1]中华人民共和国药典(一部).化学工业出版社,2015:224.
[2]中华人民共和国药典(一部).化学工业出版社,2015:227.
[3]中华人民共和国药典(一部).化学工业出版社,2015:204-205.